DE2533458C2

DE2533458C2 - Verfahren und Reagens zur Bestimmung des Gesamtcalciums in Körperflüssigkeiten

Info

Publication number: DE2533458C2
Application number: DE2533458A
Authority: DE
Inventors: Kenneth Eugene Woodbury N.J. Cleaver
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1974-08-09
Filing date: 1975-07-25
Publication date: 1984-08-09
Also published as: CA1044581A; US3934977A; DE2533458A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamtcalciums In protelnhaltlgeri Körperflüsslgkelten gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie ein Reagens zur Durchführung des Verfahrens.

:5 Im allgemeinen erfordern bekannte Methoden zur Messung des Gesamtcalciums In biologischen Flüssigkeiten eine komplizierte Handhabung von Proben und Reagentien vor der Bestimmung der Calciumkonzentration. Üblicherweise erfordern gravimetrische und titrimetrische Methoden große Probenvolumina. Colorlmetrlsche Methoden, und zwar sowohl manuelle als auch automatisierte Methoden, erfordern häufig Endablesungen unter hochalkalischen Bedingungen; die für solche Bestimmungen verwendeten Indikatoren sind bei dem End-pH-

3n Wert instabil, so daß eine Verdünnung des Reagens mit einer starken Base erforderlich 1st. Die Atomabsorptionsmeihode, welche vom National Bureau of Standards, USA, empfohlen wird, Ist zu zeitraubend, um bei den meisten rouiV.inemäßlgen, klinischen Gegebenheiten angewandt zu werden.

Eine häufig angewandte Methode zur Bestimmung des Serumcalciums verwendet als Indikator Kresolphthalelnkomplexon. Dabei wird Calcium unter sauren Bedingungen in eine aufnehmende Strömung der Kresolphthaleinkompiexonlösung dialysiert. Es wird ein gefärbter Komplex zwischen Calcium und dem Farbstoff bei der Zugabe von Diäthylamin gebildet, welches das Reaktionsgemisch alkalisch macht. Die entwickelte Färbung wird dann in einem Spektrometer bei 580 nrr. gemessen. Zusätzlich zu der Handhabung von drei getrennten Lösungen muß das Bedienungspersonal andauernd den Zustand der Dialysatormembrane überwachen. Sollte eine Abfall-Lösung durch Unachtsamkeit oder aus einem anderen Grunde angesäuert werden, wird der tödlich

4i) wirkende, giftige Cyanwasserstoff erzeugt. Ebenso ergeben sich bei der praktischen Durchführung mit dem System einige Probleme durch eine Verschiebung der Grundlinien, so daß die Methode schlecht reproduzierbar ist. Trotz dieser beträchtlichen Nachtelle wird eine solche Verfahrenswelse allgemein als leichter und eher voraussagbar als andere colorimetrische, gravimetrische oder titrimetrische Methoden angesehen.

Andere, kommerziell eingeführte Verfahrenswelsen erfordern ebenfalls die Handhabung von stark alkalischen

4> Reagentien, wobei die zulässige Ablesung (Endpunkt) zeltabhängig ist. Solche Arbeltsweisen erfordern beinahe Immer eine Inkubation nach der Probenzugabe, und bei zahlreichen Arbeltswelsen muß die Ablesung Innerhalb einer Zeltspanne von 30 Minuten durchgeführt werden. Im allgemeinen umfassen die kommerziell zugänglichen Arbeltsweisen zur Bestimmung des Gesamtserumcalclums keine Messungen unter neutralen oder sauren Bedingungen.

5(i Von Ferguson et al. Ist in Analytical Chemistry, Vol. 36 (April 1964), Nr. 4, S. 796 bis 799 die Verwendung von Chlorphosphonazo III, d. h. 2,7-Bls-(4-chlor-2-phosphonhenzol-azo)-l,8-dIhydroxynaphthalin-3,6-dlsulfonsäure, zur spektrofotometrlschen Bestimmung von Calcium und Magnesium in nichtbiologischen Flüssigkeiten beschrieben, wöbe! eine selektive Bestimmung von Calcium bei pH = 2,2 möglich Ist. Eine Messung von Calcium In protelnhaltlgen Körperflüsslgketten ist wegen der Bildung von unlöslichen Calcium-Protelnkomple-

<5 xen unter solchen Bedingungen nicht durchführbar.

Von späteren Bearbeitern, welche Chlorphosphonazon III zur Bestimmung des Gesamtserumcalclums verwenden wollten, wurden daher Vielstufenarbeltswelsen zur Abtrennung des Calciums und des Proteins aus der Probe entwickelt, bevor das Calcium mit dem Farbstoff zusammengebracht wurde. So wurde von Howell et al. In Analytical Chemistry, Vol. 38, Nr. 3 (März 1966), S. 434 bis 438 zuerst die Behandlung der Serumprobe mit

N> Tctrabutylammonlumoxalat zur Ausfällung des gesamten Calciums aus der Körperflüssigkeit beschrieben. Nach der Abtrennung wird der Niederschlag In Salzsäure erneut aufgelöst und erst dann mit Chlorophosphonazo III versetzt.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur genauen und raschen Messung des Gesamtcalciums In proteinhaltlgen Körperflüssigkelten unter Verwendung eines einzigen Reagens.

t- Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß das Gesamtcalclum In protelnhaltigen Körperflüssigkelten genau und rasch unter Verwendung eines einzigen Chlorophosphonazo-III-Reagens gemessen werden kann, falls dieses Reagens auf einen pH-Wert Innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 5,5 gepuffert wird, wobei der bevorzugte pH-Wert annähernd 5,4 beträgt. In diesem pH-Bereich bzw. bei diesem pH-Wert wird keine Absorption durch

das Serum-Magnesium beobachtet, und andere übliche Störungen einschließlich durch Bilirubin, Hämolyse und Phosphate beeinträchtigen die Testergebnisse nicht. Das einzige Reagens ist für wenigstens ein Jahr bei Zimmertemperatur stabil, und beim Vermischen mit der Probe bleibt die Entwicklung der Färbung für ausgedehnte Zeitspannen unverändert.

Gegenstand der Erfindung Ist ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamtcalciums in proteinhaltlgen Körper- > flüssigkeiten durch Vermischen einer Probe der Körperflüssigkeit mit einem eine wäßrige Lösung von Chlorphosphonazo III enthaltenden Farbreagens und optischen Vergleich der Entwicklung der Färbung des Gemisches mit derjenigen eines Standards mit bekannter Caiclumkonzentratlon, vermischt mit dem gleichen Reagens, das dadurch gekennzeichnet Ist, daß das Farbreagens mit einem Kaliumhydrogenphthalat enthaltenden Puffersystem auf einen pH-Wert innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 5,5 eingestellt wird. in

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Bestimmung des Gesamtcalciums in einer proteinhaltlgen Körperflüssigkeit, enthaltend eine wäßrige Lösung von Chlorphosphonazo III, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Lösung mit einem Kaliumhydrogenphthalat enthaltenden Puffersystem auf einen pH-Wert Innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 5,5 eingestellt ist.

Bei einem pH-Wert von etwa 5,4 wird die Konkurrenzreaktk>n des Blndens des Calciums durch Serumprotein i> (Albumin) praktisch ausgeschaltet, insbesondere wenn das Puffersystem Kaliumhydrogenphthalat enthält. Obwohl die genauen Gründe für die Wirksamkeit eines Kaliumhydrogenphthalatpuffers noch nicht vollständig verstanden werden, wird jedoch angenommen, daß der Phthalatpuffer die Freisetzung des Calciums aus der Bindung mit dem Protein und die gleichzeitig ablaufende Chelatierung des Calciums mit Kaliumhydrogenphthalat unterstüizt. Da ein Gleichgewicht zwischen dem mit Kaliumhydrogenphthalat komplexierten Calcium und mit Chiörphosphonazo HI kompiesleriem Calcium auftritt, ist Calcium, weiches sonst wegen der Bindung an Protein nicht zugänglich wäre, nun für die Reaktion mit dem Farbstoff zugänglich.

Als Ergebnis hiervon Ist ein rascher und empfindlicher Test zur Bestimmung des Gesamtcalciums in Körperfiüssigkelten möglich. Die vollständige Bildung der Färbung wird unmittelbar nach dem Vermischen von Probe und Reagens erreicht, es Ist keine Inkubationszeit erforderlich. Die hohe Empfindlichkeit (25 ng Calcium entwickeln eine Extinktion von annähernd 0,45) ermöglicht die Verwendung von lediglich Mlkrollterirengen an Serum. Für Serumcalciumgehalte bis zu 15 mg-% (15 mg pro 100 ml), werden lineare Ergebnisse erhalten.

Das Reagens besteht bevorzugt aus einer wäßrigen Lösung von Chlorphosphonazo III mit einem Puffersystem von Kailumhydrogenphthalat und Kalium- (oder Nalrium-)hydroxid bei einem pH-Wert Innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 5,5. Der bevorzugte Bereich beträgt 5,35 bis 5,45, wobei der optimale Wert 5,4 ist. w

Der In der Bescrreibung als Chlorphosphonazo III bezeichnete Farbstoff Ist 2,7-Bls(4-chlor-2-phosphonobenzolazo)-l,8-dihydroxynaphthalin-3,6-d!iulfonsäure. Die Menge an Chlorphosphonazo HI für einen vorgegebenen Test hängt von dem Volumen der zu untersuchenden Probe und der Konzentration des Calciums hierin ab, wobei darauf hingewiesen sei, daß die Molmengen an Farbstoff gleich den oder schwach höher als die Molmengen an Calcium in der Probe sein sollten. Unter der Annahme, daß erhöhte Calclumwerte in einer Serumprobe erwartungsgemäß 15 mg pro dl nicht übersteigen, wurde gefunden, daß leistungsfähige Ergebnisse routinemäßig erhalten werden können, wenn Proben von 25 μΐ mit 3,0 ml des Farbreagens vermischt werden, wobei letzteres 0,042 mg Chlorphosphonazo III und 0,01 g Kaüumhydrogenphthalat pro ml an Reagens enthält. Die Konzentration an Kaliumhydrogenphthalat Ist annähernd 0,05 molar, eine Konzentration, welche hauptsächlv,!, wegen der Leichtigkeit der Herstellung und zur Erzielung eines Wertes der Färbungsentwicklung, die für die meisten Spek- jo trofotometer geeignet 1st, ausgewählt wird. Jedoch können wesentliche Abweichungen von dieser Konzentration (d. h. um wenigstens ± 25%) zugelassen werden, was weitgehend «on der verwendeten, spektrofotometrlschen Ausrüstung abhängt.

Da der Test hochempfindlich Ist, Ist es wichtig, die Möglichkelten einer Calclumkontamlnatlon aus den zum Aufbewahren oder Transport des Reagens verwendeten Glasgeräten zu reduzieren oder auszuschalten. Solche μ Glasgeräte können mit dem Reagens selbst oder mit einer geeigneten Säure, wie z. B. verdünnter Salzsäure, gewaschen werden. Untersuchungen hinsichtlich der Reprodzierbarkell haben gezeigt, daß die relative Standardabweichung für Spektrofotometerrohre, die mit 6 N-Salzsäure gewaschen waren, nur 2,8% betrug, Im Vergleich zu einer relativen Standardabweichung von 5,2% bei Untersuchungen, die mit Rohren durchgeführt wurden, an denen eine solche Waschstufe nicht durchgeführt worden war. ;r,

Wie bereits zuvor beschrieben, wurde gefunden, daß der pH-Wert des Reagens Innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 5,5 liegen sollte und vorzugsweise etwa 5,4 betragen sollte. Oberhalb von pH = 5,5 wird die Konkurrenzreaktion de-, Bindung des Serumcalclums durch Albumin ein nennenswerter Störfaktor, und unterhalb von pH = 5,0 wurde gefunden, daß eine Trübung von der Proteinausfällung auftritt, wenn das Reagens und die Probe miteinander vermischt werden. Weiterhin beeinflussen bei Werten wesentlich oberhalb von pH = 6,0 die physlologischen Gehalte von anderen Serummetallen, insbesondere von Magnesium, den Test negativ.

Es wurde gefunden, daß das Reagens für über ein Jahr bei Zimmertemperatur und für wenigstens 260 Tage bei 56° C stabil Ist. Weiterhin wurde gefunden, daß das Reaktionsgemisch nach dem Vermischen einer Probe mit der Körperflüssigkeit hinsichtlich der Entwicklung der Färbung stabil ist. Insbesondere wurde gefunden, daß die entwickelte Extinktion bei Zimmertemperatur für wenigstens 40 Tage stabil Ist, solange das System vor einer "· äußeren Kontamination durch Calcium geschützt wird. Falls längere Lagerzelträume wahrscheinlich sind, kann das Farbreagens einen Schlmmellnhibltor enthalten, z.B. Benzoesäure (lg/l), oder einen beliebigen anderen geeigneten Inhibitor, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind.

Spektrofotometrlsche Messungen werden bei 615 nm gegenüber einer Reagensblindprobe durchgeführt, und die Konzentrationen werden durch Vergleich mit einem geeigneten Calclumstandard mit bekanntem Calciumwert bestimmt. Wegen der hohen Extinktion der Reagensblindproben (annähernd 0,95 bei 615 nm in einer 1,0 cm Cuvette), sollten keine größeren Cuvetten als mit einem Durchmesser von etwa 1,20 cm bei routinemäßigen Laboratorlumsspektrofotometern eingesetzt werden. Da solche spektrofotometrlsche Arbeltswelsen im

übrigen vollständig konventionelle Untersuchungsmethoden darstellen, erübrigt sich eine weitere -Beschreibung hiervon.
Das Reagens und das Verfahren gemäß der Erfindung werden anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Die Linearität der Untersuchungsergebnisse mit wäßrigen Standardlösungen ergibt sich aus der folgenden Tabelle 1, worin jeder der Extlnkilonswerte der Durchschnitt von vier Messungen Ist. In jedem Fall wurden μΐ Probe, die einen bekannten Calclumwert enthielten, zu 3,0 ml des Farbreagenses zugesetzt, welches durch η Vermischer, von 42 mg/I an Chlorphosphonazo III, 10 g/l an Kallumhydrogenphthalat und ausreichend Kaliumhydroxid, um einen pH-Wert von 5,35 bis 5,45 einzustellen, hergestellt wurde.

Tabelle I

Linearität mit wäßrigen Standardlösungen

Calciumwert (rag/dl) Extinktion gegen Blindprobe

5,0 0,210 + 0,008

2i) 6,0 0,253 ± 0,007

7,5 0,311 ±0,006 |

9,0 0,386 ± 0,003

10,0 0,425 ± 0,003

11,0 0,458 ±0,007

12,5 0,525 ± 0,010

14,0 0,591 ± 0,008

15,0 0,629 ± 0,008

Ein Auftragen der Extinktionswerte zeigt, daß praktisch lineare Ergebnisse für Calclumwerte innerhalb des angegebenen Bereiches erhalten werden.

Beispiel 2

Es wurden Untersuchungen hinsichtlich der Reproduzierbarkelt mit Serumproben während des Zeitraumes

von einem Tag und ebenfalls über einen Zeltraum von 10 Tagen durchgeführt. Für die Untersuchungen der Reproduzierbarkeit bei einem einzigen Tag wurde jede Serumprobe zehnmal analysiert, und die Werte wurden aus einer Standardkurve berechnet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen für einen einzigen Tac sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Reduzierbarkeit innerhalb eines einzigen Tages

unternormales normales übernofrnales

Serum Serum Serum

Calciumwerte (mg/dl)	7,7	9,15	12,9
Standardabweichung (mg/dl)	±0,09	±0,13	0,09
relative Standardabweichung	1,2%	L4%	0,7%

Untersuchungen der täglichen Reproduzierbarkeit wurden während 10 Arbeitstagen durchgeführt. Serummeiigen von Menschen wurden in einzelnen Gläsern lyophllisiert >uid täglich rekonstituiert, bevor Doppelablesungen jeder Probe durchgeführt wurden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

unternormales normales übernormales

Serum Serum Serum

Calciumwerte (mg/dl)	6,64	9,0	13,88
Standardabweichung (mg/dl)	±0,32	±0,18	0,235
relative Standardabweichung	4,8%	2 0%	1,7%

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung des Gesamtcalclums In protelnhaltlgen Körperflüssigkelten durch Vermischen einer Probe der Körperflüssigkeit mit einem eine wäßrige Lösung von Chlorphosphonazo HI enthalten-

> den Farbreagens und optischen Vergleich der Entwicklung der Färbung des Gemisches mit derjenigen eines

Standards mit bekannter Calciumkonzentration vermischt mit dem gleichen Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß das Farbreagens mit einem Kaliumhydrogenphthalat enthaltenden Puffersystem auf einen pH-Wert innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 5,5 eingestellt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Farbreagens innerhalb des ίο Bereiches von 5,35 bis 5,45 eingestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Farbreagens auf etwa 5,4 eingestellt wird.

4. Reagens zur Bestimmung des Gesamtcalciums in einer protelnhaltlgen Körperflüssigkeit, enthaltend eine "wäßrige Lösung von Chlorphosphonazo III, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung mit einem Kalium-

!5 hydrogenphthalat enthaltenden Puffersystem auf einen pH-Wert Innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 5,5 eingestellt ist.

5. Reagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Puffersystem weiterhin Kallumhyiroxid enthält.