-
Die Erfindung betrifft ein neues Reagens, das für den
Nachweis und die Bestimmung von Bilirubin im Urin nützlich ist.
-
Derzeit können der Nachweis und die Bestimmung von Bilirubin
in Körperflüssigkeiten nach drei Verfahren durchgeführt
werden:
-
a) dem spektrophotometrischen Verfahren durch direktes
Ablesen des gelben Pigments von Bilirubin.
Offensichtlich kann ein solches Verfahren für die Bestimmung im
Urin nicht verwendet werden, da die Farbe der
Flüssigkeit oft gleich ist wie die des Pigments.
-
b) dem enzymatischen Verfahren, bei dem Bilirubinoxidase
verwendet wird: das oxidierte Bilirubin verliert die
gelbe Farbe, daher kann seine Konzentration durch eine
Abnahme in der Absorption analysiert werden; Dieses
Verfahren wird ebenfalls nicht allgemein für die
Bestimmung im Urin verwendet.
-
c) dem chemischen Verfahren durch Diazo-Kupplung zwischen
einer diazotierten aromatischen Verbindung
(Diazo-Verbindung) und Bilirubin. Dieses Verfahren zeigt die
höchste Empfänglichkeit wie auch wirtschaftliche
Vorteile.
-
Bei der Diazo-Kupplung zwischen Bilirubin und einer
geeigneten Diazo-Verbindung wird Azobilirubin, eine Substanz, die
sich wie ein pH-Indikator verhält, gebildet. Sie verfärbt
sich in der Tat in neutraler oder etwas saurer Lösung rot,
blau in stark alkalischer Lösung und purpur in sehr saurer
Lösung.
-
Die Bestimmung von Bilirubin im Urin bringt vollständig
andere Schwierigkeiten, verglichen mit der Bestimmung im
Serum, mit sich. In der letzteren biologischen Flüssigkeit
liegt Bilirubin sowohl in freier als auch in konjugierter
Form, d.h. in Form eines Glucuronsäuresalzes vor. Diese
zwei Formen zeigen gegenüber den Diazo-Verbindungen
unterschiedliche Reaktivität. Das freie Bilirubin ist für die
Diazo-Kupplung weniger empfänglich, die dementsprechend nur
in Anwesenheit geeigneter Beschleuniger stattfindet. Vom
klinischen Standpunkt aus ist es wichtig, die Konzentration
beider Formen im Serum und ebenfalls das Verhältnis der
beiden zu bestimmen.
-
Im Urin liegt Bilirubin im wesentlichen in konjugierter Form
vor, es ist daher nicht erforderlich, Beschleuniger für die
Diazo-Kupplung zu verwenden. Jedoch ist die quantitative
Bestimmung in dieser Flüssigkeit nicht zufriedenstellend, da
viele und unterschiedliche Substanzen, die vorhanden sind,
Störungen sowohl in der photometrischen Ablesung als auch
durch direkte Umsetzung mit der Diazo-Verbindung und die
Bildung nicht-spezifischer Färbung mit sich bringen.
-
Damit diese Art der Analyse treuer, genauer und
reproduzierbarer wird, wurden Modifizierungen sowohl hinsichtlich der
Stabilität als auch der Empfindlichkeit der Reagentien, wie
auch des analytischen Verfahrens durchgeführt.
-
Wie bekannt ist, sind Diazo-Verbindungen im allgemeinen
nicht stabil. Es wurden Versuche unternommen, diesen
Nachteil zu beseitigen, indem ihre Komplexe mit Zinksalzen
verwendet wurden (die sogenannten Fast Red RC, Fast Red PDC,
usw.).
-
Unglücklicherweise hat sich gezeigt, daß diese Verbindungen
für die Bestimmung von Bilirubin im Urin ungeeignet sind, da
sie ebenfalls mit dem Urobilinogen reagieren, einer
Substanz, die immer im Urin vorhanden ist, wenn auch in
unbestimmten Mengen. Weiterhin können die Diazo-Verbindungen
unspezifische Färbungen hervorrufen, indem sie mit den
Medikamenten und/oder mit deren Metaboliten reagieren.
-
Eine andere Schwierigkeit entsteht durch die extreme
Variationsmöglichkeit des Aussehens und der Farbe des Urins.
-
Diese Eigenschaften unterliegen bemerkbaren Veränderungen
bei der Zugabe stark saurer Reagentien. Die plötzliche
Senkung des pHs verursacht beispielsweise die Präzipitation von
Substanzen, wie Harnsäure, die in sauren Umgebungen nur
wenig löslich sind.
-
Zur Verringerung solcher Störungen hat man versucht, die
Probe nach der Reagenszugabe, wie bei dem Verfahren für das
Serum, alkalisch zu machen, so daß sich Azobilirubin von
blau nach rot verfärbt. Dies bewirkt, daß die Bestimmung
spezifischer wirkt, da wenige störende Substanzen
Blaufärbungen ergeben.
-
Trotzdem ist dieses Verfahren nicht geeignet, da
Azobilirubin in alkalischer Umgebung nur in Anwesenheit von Proteinen
stabil ist und es bekannt ist, daß, ausgenommen für
pathologische Situationen, Proteine nie im Urin vorhanden sind.
Daraus folgt, daß die Instabilität des Bilirubinpigments die
Ergebnisse vollständig unzuverlässig macht.
-
Man hat weiterhin die Tatsache ausgenutzt, daß Azobilirubin
gefärbte Komplexe zusammen mit Metallionen wie Co³&spplus;, Cu²&spplus;
und Ni²&spplus; ergibt. Insbesondere wird die Bildung eines
Azobilirubin-Cu²&spplus;-Komplexes unter anderem von Michaelsson
M., in Scand. J. Clin. Lab. Invest., 13, Erg. 56, 1 (1961)
beschrieben. Dabei wird die Bildung eines blauen
Reaktionsproduktes ebenfalls in Abwesenheit alkalischer
Substanzen möglich. Wie bereits oben erwähnt, ermöglicht die
blaue Farbe die photometrischen Ablesungen, die bei
Wellenlängen durchgeführt werden können, bei welchen andere
Pigmente nicht stören. Es ist bekannt, daß, während
Azobilirubin rot ist und einen Absorptions-Peak bei 530-550 nm in
neutraler oder leicht saurer Umgebung besitzt, der
Azobilirubin-Cu²&spplus;-Komplex blau ist und einen Absorptions-Peak bei
615-620 nm bei einer pH-Ablesung zwischen 3,8 und 11 ergibt.
Bei pHs unter 3,8 ändert sich die blaue Farbe progressiv in
rot und der Peak von 615 nm nimmt ab, bis er verschwindet,
und schließlich wird die Farbe rein rot bei einem
Absorptions-Peak
bei 535 nm bei pH 2,4. Dies führt zu der Annahme,
daß der Azobilirubin-Cu²&spplus;-Komplex nur bei einem pH in einem
Bereich zwischen 3,8 und 11 stabil ist und bei pH-Werten
unter 3,8 mehr und mehr dissoziiert, und vollständig bei pH
2,4 dissoziiert ist.
-
Der Grund für die Wahl von Michaelsson, einen pH-Wert von 6
für das Diazo-Kupplungsverfahren und die daraus folgende
Bildung des blauen Komplexes mit Cu²&spplus; für die Bestimmung von
Bilirubin im Urin zu verwenden, ergibt sich aus diesen
Beobachtungen.
-
Dieses Verfahren besitzt jedoch nennenswerte Nachteile
hinsichtlich der Praktikabilität, und insbesondere der
Automatisierung der Analyse. In der Tat erfordert das Verfahren
die Verwendung von vier unterschiedlichen Reagentien und
dementsprechend vier Reaktionen für jede geprüfte Probe
("Kupferprobe", "Kupferkontrollprobe", "Wasserprobe" und
"Wasserkontrollprobe") mit der sich daraus ergebenden
Bewertung der Ergebnisse für jede Reaktion und die
Reaktionszeiten (ungefähr 10 Minuten) sind für analytische Laboratorien,
die Hunderte von Proben pro Tag zu analysieren haben, zu
lang.
-
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das
Analyseverfahren nach Michaelsson zu verbessern und zu
vereinfachen, indem ein Reagens zur Verfügung gestellt wird,
mit dem genaue und zuverlässige Ergebnisse ohne mögliche
Störungen mit den in der Probe vorhandenen Substanzen
erhalten werden, das gleichzeitig leicht zu handhaben und im
Verlauf der Zeit stabil ist.
-
Diese und andere Aufgaben werden mit dem erfindungsgemäßen
Reagens gelöst, welches eine aromatische Verbindung, die
eine Diazo-Reaktion eingehen kann, ein lösliches Kupfer(II)-
Salz, einen Puffer, der geeignet ist, den pH zwischen 3 und
7 zu halten und gegenüber Kupfer(II)-Ionen inert ist und ein
Alkalimetallnitrit, das Teil des oben erwähnten Gemisches
sein kann oder das zu dem Gemisch zum Zeitpunkt der
Bestimmung zugegeben werden kann, enthält.
-
Eine solche Zusammensetzung enthält ebenfalls ein oder
mehrere anionische oder nicht-ionische grenzflächenaktive
Mittel (oder Detergentien) und Dimethylsulfoxid (DMSO).
-
Das erfindungsgemäße Reagens enthält bevorzugt den Puffer in
einer Konzentration zwischen 10 mmol/l und 5.000 mmol/l, die
geeignete aromatische Verbindung in einer Konzentration
zwischen 5 mmol/l und 200 mmol/l, und das Kupfer(II)-Salz in
einer Konzentration zwischen 1 mmol/l und 30 mmol/l, und das
Nitrit in einer Konzentration zwischen 10 mmol/l und 1.000
mmol/l. Mehr bevorzugt ist der Puffer in einer Konzentration
von etwa 3.000 mmol/l, die geeignete aromatische Verbindung
in einer Konzentration von etwa 150 mmol/l, das Kupfer(II)-
Salz in einer Konzentration von etwa 5 mmol/l und das Nitrit
in einer Konzentration von etwa 45 mmol/l vorhanden.
-
Das grenzflächenaktive Mittel oder das Gemisch davon ist in
einer Konzentration zwischen 0,3% und 10% Gew./Vol.,
bevorzugt in einer Konzentration von etwa 0,3% Gew./Vol.
vorhanden.
-
Die DMSO ist in einer Konzentration zwischen 0% und 100%
Gew./Vol., bevorzugt in einer Konzentration von etwa 50%
Gew./Vol., vorhanden.
-
Überraschenderweise wurde gefunden, daß es nicht
erforderlich ist, Cu²&spplus; zur Bildung des Azobilirubin-Cu²&spplus;-Komplexes
am Ende der Diazo-Kupplung, wie von Michaelsson beschrieben,
zuzugeben. Cu²&spplus; kann einem Einzelreagens, das all die oben
erwähnten Verbindungen und gegebenenfalls Nitrit als
Initiator, das in einer Reihe von Reaktionen wirkt, welche die
Bildung des blauen Azobilirubin-Cu²&spplus;-Komplexes ergeben,
beigemischt werden.
-
Es wurde weiterhin überraschenderweise gefunden, daß im
Gegensatz zur Lehre der Literatur im Zusammenhang mit der
Diazo-Kupplung bei stark saurem pH die aromatische
Verbindung, die gegenüber der Diazo-Reaktion empfindlich ist,
zu dem Reagens bei schwach saurem bis neutralem pH, der
durch einen Puffer stabil gehalten wird, zusammen mit Cu²&spplus;
und gegebenenfalls grenzflächenaktiven Mitteln, die nützlich
sind um schnell besondere Arten von Proben zu klären,
zugegeben werden kann.
-
Überraschenderweise wurde weiterhin gefunden, daß der
Azobilirubin-Cu²&spplus;-Komplex sich bei pH-Werten unter 3,8
vollständig bildet, selbst wenn er bei solchen Bedingungen schnell
dissoziiert. Bei solchen pH-Werten reicht die "Überlebens"-
Zeit des Komplexes aus, um das photometrische Ablesen, das
für die Bestimmung von Bilirubin erforderlich ist,
durchzuführen. Die Bedeutung der Verwendung von pH 3 liegt in der
Tatsache, daß bei einem solchen pH eine schnelle
Solubilisierung der Calcium- und Magnesiumphosphate erreicht wird,
da solche Salze häufig in Urinproben bei neutralem oder
alkalischem pH ausfallen und diese trübe machen.
-
DMSO kann verwendet werden, um die Bildung des Azobilirubin-
Cu²&spplus;-Komplexes gemäß einem Prinzip zu verlangsamen, das sich
vollständig von den bekannten unterscheidet, bei dem DMSO
nur als Beschleuniger zur Bestimmung von freiem Bilirubin im
Serum verwendet wird. DMSO bildet Koordinationskomplexe mit
Kupfer und anderen Metallen, und es wurde ebenfalls
gefunden, daß diese Eigenschaft in dem erfindungsgemäßen
Reagens auch genutzt werden kann, um Cu²&spplus; mehr oder weniger
direkt für die Bildung des Azobilirubin-Cu²&spplus;-Komplexes
verfügbar zu machen, mit der daraus sich ergebenden
Möglichkeit, die Bildungsgeschwindigkeit des Komplexes selbst zu
variieren. Eine solche Möglichkeit ist hauptsächlich
nützlich, wenn die Analyse manuell durchgeführt wird, d.h. wenn
langsamere Reaktionszeiten für die Ablesung der Werte
erforderlich sind.
-
Weiterhin hat sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Reagens
für den Nachweis und die Bestimmung von Bilirubin im Urin
vorteilhaft ist wegen der Kürze der Analysezeiten und der
gesamten Möglichkeit einer Automatisierung.
-
Das erfindungsgemäße Reagens vereinigt überraschenderweise
alle Substanzen, die für den Nachweis und die Bestimmung von
Bilirubin im Urin nützlich sind, wodurch ein analytisches
Instrument verfügbar wird, das extrem einfach, zuverlässig
und handhabbar ist. Durch Unterteilung der aktiven
Komponenten in zwei Reagentien, von denen das erste das Nitrit und
gegebenenfalls das DMSO und das zweite den Puffer, die
aromatische Verbindung, die die Diazo-Reaktion eingeht, Cu²&spplus;
und grenzflächenaktive Mittel enthält, verbleiben die
Reagentien länger als ein Jahr bei Raumtemperatur stabil.
-
Die beiden Reagentien können vor der Verwendung unter
Bildung eines einzigen Reagenses mit geringerer Stabilität,
aber mit mehr als ausreichender Stabilität, vermischt
werden, um eine Reihe von Bestimmungen innerhalb einer Zeit zu
ermöglichen, die erforderlich ist, um ein normales
analytisches Verfahren durchzuführen. Beachtet man, daß es möglich
ist, eine Analyse in einigen Sekunden mit dem offenbarten
System durchzuführen, erlaubt die Verwendung des einfachen
Reagenses die Analyse von mindestens 700 Proben/Stunde,
insbesondere, wenn es mit einer schnellen automatischen
Vorrichtung gekoppelt ist. Eine solche
Arbeitsgeschwindigkeit ist unzweifelhaft höher als die, welche man in der
Mehrzahl der Analyselaboratorien erreicht.
-
Alternativ wird durch die Verwendung von zwei getrennten
Reagentien jedes Stabilitätsproblem beseitigt, da die beiden
Reagentien ebenfalls in der automatischen Vorrichtung
verbleiben können, wenn getrennte Behälter für die Aufnahme der
Reagentien vorgesehen sind. Auch in diesem Fall erlaubt die
extrem hohe Reaktionsgeschwindigkeit, die mit den
beschriebenen Reagentien möglich ist, die Analyse von über 350
Proben/Stunde bis mindestens 700 Proben/Stunde.
-
In den Versuchen, die zur Optimierung der unterschiedlichen
Komponenten durchgeführt wurden, wurde der Wahl des Puffers
und der Konzentration von Cu²&spplus; besondere Beachtung
geschenkt. In der Tat wurde gefunden, daß eine zu niedrige
Konzentration von Kupfer(II)-Ionen einen Verlust der
Empfindlichkeit mit sich bringt, da sie für die vollständige
Bildung des Azobilirubin-Komplexes nicht ausreichen. Im
Gegensatz dazu bewirkt eine zu hohe Konzentration, daß der
Komplex und die entstehende Farbe instabil werden. Daraus
folgt, daß die Konzentration von Cu²&spplus;, die verwendet wird,
geeigneterweise in dem erfindungsgemäßen Reagens im Bereich
von 1 bis 10 mmol/l liegt.
-
Unter den Puffern, die bei pHs im Bereich von 3 und 7
geprüft wurden, schienen Citrate und Succinate nicht geeignet
zu sein. Citrat bildet Chelate und entfernt Cu²&spplus; von der
Bildung des Komplexes mit Azobilirubin und Succinat
verursacht die Präzipitation des entsprechenden
Kupfer(II)-Salzes. Es wurde gefunden, daß geeignete Puffer Essigsäure-
Natriumacetat, Glycin-HCl und Formiat-HCl sind, obgleich
irgendein Puffersystem verwendet werden kann, mit der Maßgabe,
daß es keine unlöslichen Salze, Chelate oder
Kupfer(II)-Komplexe bildet.
-
Es hat sich gezeigt, daß von den Zusatzstoffen, außer dem
bereits erwähnten DMSO, die grenzflächenaktiven Mittel (oder
Detergentien) von überraschendem Nutzen sind. Wie bereits
zuvor erwähnt, sind sie besonders nützlich, um einige
besondere Arten von Proben schnell zu klären. Ein Beispiel ist,
daß der Urin eine große Zahl von Leukozyten, Erythrozyten
oder anderen Zellen enthält, die bewirken, daß er ein
besonders milchiges oder trübes Aussehen hat. In Abwesenheit von
grenzflächenaktiven Mitteln kann es geschehen, daß die
Trübung der Probe die photometrische Ablesung bemerkenswert
hindert, indem sie das Durchgehen von Licht verhindert. Es
kann weiterhin geschehen, und dies ist am häufigsten und
schädlichsten, weil es am wenigsten kontrollierbar ist, daß
beim Mischen der Probe und der Reagentien eine langsame
Zell-Lyse eine allmähliche Abnahme der Trübung des Gemisches
mit der daraus folgenden Abnahme der Absorption bewirkt.
Eine solche negative Änderung kann negative Fehler durch
Überlagerung der positiven Änderung, bedingt durch die
spezifische Farbreaktion von Bilirubin ergeben. Die Zugabe von
grenzflächenaktiven Mitteln zu dem Reaktionsgemisch bewirkt
eine sehr schnelle Zell-Lyse und Klärung des Gemisches vor
der spezifischen Farbreaktion des Bilirubins.
-
Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele erläutern die
Erfindung:
Beispiel 1
-
Ein Reagens A wurde hergestellt, welches 80 mmol/l
Sulfanilsäure, 300 mmol/l Glycin-HCl-Puffer, so daß der pH 4,5
betrug, 12 mmol/l Cu²&spplus; und 0,1% Gew./Vol. Triton X-67 (Rohm &
Haas Co.) enthielt. Getrennt wurde eine Reagens B
hergestellt, welches 45 mmol/l NaNO&sub2; in Wasser enthielt. Die
Reagentien A und B wurden vor der Verwendung zu gleichen Teilen
vermischt (Einzelreagens C). Die Proben wurden aus einem
Pool von Normalurin entnommen, und es wurde
Ditaurat-Bilirubin in Konzentrationen von 0, 0,31, 0,62, 1,25, 2,5, 5, 10,
und 20 mg/dl zugegeben.
-
In einer spektrophotometrischen Küvette wurden 2 ml Wasser
und 0,5 ml der Testprobe vermischt. Die erste photometrische
Ablesung (A&sub1;) wurde bei 635 nm durchgeführt. Dann wurde 1 ml
Einzelreagens C zugegeben. Fünf Sekunden nach der Zugabe des
Reagenses C wurde eine zweite photometrische Ablesung (A&sub2;)
ebefalls bei 635 nm durchgeführt. Der Unterschied zwischen
den beiden Ablesungen (A&sub2;-A&sub1;) stand in Korrelation zu der
Konzentration von Bilirubin, mindestens bis zu 20 mg/dl, wie
aus der folgenden Tabelle 1 hervorgeht.
Tabelle 1
Ditaurat Bilirubin (mg/dl)
Beispiel 2
-
Ein Reagens A wurde hergestellt, welches 80 mmol/l
Sulfanilsäure, 300 mmol/l Glycin-HCl-Puffer, so daß der pH 4,5
betrug, 12 mmol/l Cu²&spplus; und 0,1% Gew./Vol. Triton X-67 (Rohm &
Haas Co.) enthielt. Getrennt wurde ein Reagens B
hergestellt, welches 45 mmol/l NaNO&sub2; in 50% DMSO Vol./Vol. in
Wasser enthielt. Die Reagentien A und B wurden vor der
Verwendung zu gleichen Teilen vermischt (Einzelreagens C). Die
Proben wurden aus einem Pool von Normalurin entnommen, zu
denen Ditaurat-Bilirubin in Konzentrationen von 0, 0,31,
0,62, 1,25, 2,5, 5, 10, und 20 mg/dl zugegeben wurde.
-
In einer spektrophotometrischen Küvette wurden 2 ml Wasser
und 0,5 ml der Testprobe vermischt. Die erste photometrische
Ablesung (A&sub1;) wurde bei 635 nm durchgeführt. Dann wurde 1 ml
Einzelreagens C zugegeben. Dreißig Sekunden nach der Zugabe
des Reagens es C wurde eine zweite photometrische Ablesung
(A&sub2;) ebenfalls bei 635 nm durchgeführt. Der Unterschied
zwischen den beiden Ablesungen (A&sub2;-A&sub1;) stand in Korrelation zu
der Konzentration von Bilirubin, mindestens bis zu 20 mg/dl,
wie aus der folgenden Tabelle 2 hervorgeht.
Tabelle 2
Ditaurat Bilirubin (mg/dl)
Beispiel 3
-
Ein Reagens A wurde hergestellt, welches 10 mmol/l
Sulfanilamid, 500 mmol/l Natriumformiat-HCl-Puffer, so daß der pH
3,6 betrug, 3 mmol/l Cu²&spplus; und 0,05% Gew./Vol. Brij-35
(Atlas Chemical Industries Inc.), enthielt. Getrennt wurde
ein Reagens B hergestellt, das 500 mmol/l NaNO&sub2; in Wasser
enthielt. Die Proben wurden aus einem Pool von Normalurin
entnommen, zu denen Ditaurat-Bilirubin in Konzentrationen
von 0, 0,31, 0,62, 1,25, 2,5, 5, 10, und 20 mg/dl zugegeben
wurde.
-
In einer spektrophotometrischen Küvette wurden 1 ml Wasser,
0,5 ml der Testprobe und 2 ml des Reagenses A vermischt. Die
erste photometrische Ablesung (A&sub1;) wurde bei 615 nm
durchgeführt. Dann wurde 0,05 ml Reagens B zugegeben. Fünf Sekunden
nach der Zugabe des Reagens es B wurde eine zweite
photometrische Ablesung (A&sub2;) ebenfalls bei 615 nm durchgeführt. Der
Unterschied zwischen den beiden Ablesungen (A&sub2;-A&sub1;) stand in
Korrelation zu der Konzentration von Bilirubin, mindestens
bis zu 20 mg/dl, wie aus der folgenden Tabelle 3 hervorgeht.
Tabelle 3
Ditaurat Bilirubin (mg/dl)
Beispiel 4
-
Ein Reagens A wurde hergestellt, welches 70 mmol/l
Sulfanilsäure, 200 mmol/l Glycin-HCl-Puffer, so daß der pH 3,1
betrug, 10 mmol/l Cu²&spplus; und 0,15% Gew./Vol.
Natriumdodezylsulfat enthielt. Getrennt wurde ein Reagens B hergestellt,
welches 200 mmol/l NaNO&sub2; in Wasser enthielt. Die Proben wurden
aus einem Pool von Normalurin entnommen, zu denen Ditaurat-
Bilirubin in Konzentrationen von 0, 0,31, 0,62, 1,25, 2,5,
5, 10 und 20 mg/dl zugegeben wurde.
-
In einer spektrophotometrischen Küvette wurden 1 ml Wasser,
0,5 ml der Testprobe und 1 ml des Reagenses A vermischt. Die
erste photometrische Ablesung (A&sub1;) wurde bei 620 nm
durchgeführt. Dann wurde 0,5 ml Reagens B zugegeben. Sieben
Sekunden nach der Zugabe des Reagenses B wurde eine zweite
photometrische Ablesung (A&sub2;) ebenfalls bei 620 nm
durchgeführt. Der Unterschied zwischen den beiden Ablesungen (A&sub2;
-A&sub1;) stand in Korrelation zu der Konzentration von Bilirubin,
mindestens bis zu 20 mg/dl, wie aus der folgenden Tabelle 4
hervorgeht.
Tabelle 4
Ditaurat Bilirubin (mg/dl)
Beispiel 5
-
Ein Reagens A wurde hergestellt, welches 90 mmol/l
Sulfanilsäure, 400 mmol/l Essigsäure-Natriumacetat-Puffer, so daß
der pH 5,5 betrug, 3 mmol/l Cu²&spplus; und 0,12% Gew./Vol.
Triethanolaminlaurylsulfat enthielt. Getrennt wurde ein Reagens
B hergestellt, welches 45 mmol/l NaNO&sub2; in 50% DMSO Vol./Vol.
in Wasser enthielt. Die Reagentien A und B wurden vor der
Verwendung zu gleichen Teilen vermischt (Einzelreagens C).
Die Proben wurden aus einem Pool von Normalurin entnommen,
zu denen Ditaurat-Bilirubin in Konzentrationen von 0, 0,31,
0,62, 1,25, 2,5, 5, 10 und 20 mg/dl zugegeben wurde.
-
In einer spektrophotometrischen Küvette wurden 1 ml Wasser,
0,5 ml der Testprobe und 1 ml des Einzelreagenses C
vermischt. Nach dreißig sekungen wurde die erste photometrische
Ablesung (A&sub1;) bei 610 nm durchgeführt; nach fünf Sekunden
wurde eine zweite photometrische Ablesung (A&sub2;) ebenfalls bei
610 nm durchgeführt. Der Unterschied zwischen den beiden
Ablesungen (A&sub2;-A&sub1;) stand in Korrelation zu der Konzentration
von Bilirubin, mindestens bis zu 20 mg/dl, wie aus der
folgenden Tabelle 5 hervorgeht.
Tabelle 5
Ditaurat Bilirubin (mg/dl)
Beispiel 6
-
Ein Reagens A wurde hergestellt, welches 140 mmol/l
Sulfanilsäure, 3 mmol/l Essigsäure-Natriumacetat-Puffer, so daß
der pH 3,8 betrug, 4,9 mmol/l Cu²&spplus; und 0,28% Gew./Vol.
Triton X-100 (Rohm & Haas Co.), enthielt. Getrennt wurde ein
Reagens B hergestellt, welches 42 mmol/l NaNO&sub2; in Wasser
enthielt. Die Proben wurden aus einem Pool von Normalurin
entnommen, zu denen Ditaurat-Bilirubin in Konzentrationen
von 0, 0,31, 0,62, 1,25, 2,5, 5, 10 und 20 mg/dl zugegeben
wurde.
-
In einer spektrophotometrischen Küvette wurden 1,3 ml
Wasser, 0,5 ml der Testprobe und 0,4 ml des Reagenses A
vermischt. Die erste photometrische Ablesung (A&sub1;) wurde bei 635
nm durchgeführt. Dann wurde 0,5 ml des Reagenses B
zugegeben. Zehn Sekunden nach der Zugabe des Reagenses B wurde
eine zweite photometrische Ablesung (A&sub2;) ebenfalls bei 635
nm durchgeführt. Der Unterschied zwischen den beiden
Ablesungen (A2-A1) stand in Korrelation zu der Konzentration von
Bilirubin, mindestens bis zu 20 mg/dl, wie aus der folgenden
Tabelle 6 hervorgeht.
Tabelle 6
Ditaurat Bilirubin (mg/dl)
Beispiel 7
-
Ein Reagens A wurde hergestellt, welches 150 mmol/l
Sulfanilsäure, 450 mmol/l Essigsäure-Natriumacetat-Puffer, so daß
der pH 5 betrug, 7 mmol/l Cu²&spplus;, enthielt. Getrennt wurde ein
Reagens B hergestellt, welches 18,2 mmol/l NaNO&sub2; in 0%,
37,5% und 75% Vol./Vol. DMSO in Wasser enthielt. Die Proben
wurden aus einem Pool von Normalurin entnommen, zu denen
Ditaurat-Bilirubin in Konzentrationen von 0,6 und 10 mg/dl
zugegeben wurde.
-
In einer spektrophotometrischen Küvette wurden 0,5 ml Wasser
und 1 ml der Testprobe, 0,5 ml des Reagenses A und 1 ml des
Reagenses B vermischt. Fünf Sekunden nach der Zugabe des
Reagenses B wurde die erste photometrische Ablesung (A&sub1;) bei
610 nm durchgeführt. Dann wurde die Zeit bis zu einer
50%igen Erhöhung von A&sub1; gemessen.
-
Aus der folgenden Tabelle 7 ist ersichtlich, wie die
Erhöhung des DMSO-Prozentgehaltes in dem Reagens einer Erhöhung
der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit (l/t) mit sowohl 0,6
mg/dl als auch 10 mg/dl Bilirubin entspricht. Dies bedeutet,
daß eine Proportionalität zwischen der Konzentration von
DMSO und der Zeit, die erforderlich ist, um A&sub1; um 50% zu
erhöhen, besteht, d.h., eine inverse Proportionalität der
Konzentration von DMSO und der Reaktionsgeschwindigkeit.
Tabelle 7
Ditaurat Bilirubin (mg/dl)
Vergleichsbeispiel 8
Vergleich zwischen der Spezifizität des erfindungsgemäßen
Reagenses und einem der derzeit verwendeten Verfahren.
-
Unter Verwendung der Reagentien und des Verfahrens von
Beispiel 6 wurden vier Urinproben jeweils mit den folgenden
Eigenschaften analysiert:
-
Probe 1: klares Aussehen, strohfarben
-
Probe 2: etwas trübes Aussehen, strohfarben
-
Probe 3: klares Aussehen, hellgelb
-
Probe 4: trübes Aussehen, orange
-
Die Proben 1 und 2 wurden analysiert, da ein klinisches
Analyselabor fehlerhafte und stark positive Ergebnisse in
Abwesenheit von zusätzlichen pathologischen Eigenschaften und im
Gegensatz zu dem, was aus der Blutanalyse, die normal war,
erwartet werden konnte, bei Verwendung der "deep and read"-
Methode, das derzeit verfügbar ist, erhielt. Die Proben 3
und 4 wurden als negative und positive Kontrollproben
analysiert.
-
Die oben erwähnten Urinproben wurden gemäß der folgenden
Verfahren analysiert:
-
a) manuelles semi-quantitatives Verfahren mit
Reagensstreifen COMBUR-9 (Boehringer Biochemia Robin);
-
b) manuelles semi-quantitatives Verfahren mit
Reagensstreifen N-MULTISTIX (Ames-Miles);
-
c) automatisches semi-quantitatives Verfahren mit
Reagensstreifen URIFLET (Kyoto Daiichi) in einem KYOTO
URINE ANALYZER -Instrument (Kyoto Daiichi);
-
d) quantitatives spektrophotometrisches Verfahren in der
Verwendung von Bilirubinoxidase, modifiziert für die
Bestimmung von Bilirubin im Urin (vergleiche US-PS
4 571 383 und Doumas B.T., Perry B., Jendrzejczak B.
und Davis L., Clin. Chem., 33, 1349, 1987);
-
e) qualitatives Fouchet-Verf ahren (vergleiche Strasinger
S.D., F.A. Davis Co., Philadelphia, 1985).
-
Die Verfahren a), b) und c) sind Diazo-Kupplungsverfahren,
bei denen trockene Reagentien, die am Reagensstreifen
immobilisiert sind, verwendet werden und die überwiegend in
den meisten chemischen Analyselaboratorien verwendet werden.
Die Verfahren d) und e) wurden als Vergleich und Kontrolle
verwendet; sie beruhen beide auf den Variationen im
Absorptionsspektrum von oxidiertem Bilirubin. Bei dem Verfahren d)
wird die enzymatische Oxidation von Bilirubin verwendet, bei
dem Verfahren e) wird die chemische Oxidation von diesem
verwendet.
-
Die Analysenergebnisse der vier geprüften Proben sind aus
folgender Tabelle 8 ersichtlich.
Tabelle 8
Verfahren
Probe
Beispiel 6(mg/dl)
COMBUR-9
N-MULTISTIX
URIFLET
Bil.oxidase (mg/dl)
Fouchet
neg
Spuren
pos