CH632092A5 - Verfahren und mittel zur bestimmung von hydroperoxiden. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mittel zur photometrischen Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxiden reagieren, in eiweisshaltigen Flüssigkeiten. Die Bestimmung von Hydroperoxiden, insbesondere von Wasserstoffperoxid, spielt eine wichtige Rolle in der klinischen Chemie. Viele enzymati-sche Substratbestimmungen werden mit Oxidasen durchgeführt, z. B. Cholesterin mit Cholesterinoxidase, Glucose mit Glucoseoxidase, Aminosäuren mit Aminosäureoxidase, Harnsäure mit Uricase usw. Das bei diesen Reaktionen in äquimola-ren Mengen entstehende Wasserstoffperoxid kann in bekannter Weise elektrochemisch oder photometrisch bestimmt werden. Dabei sind die elektrochemischen Verfahren wegen der Notwendigkeit spezieller Apparaturen und deren Anfälligkeit nachteilig. Günstiger und verbreiteter sind die photometrischen Bestimmungsmethoden.
Eine der bekanntesten photometrischen Bestimmungsmethoden beruht auf der Oxydation bestimmer Chromogene durch Wasserstoffperoxid zu einem Farbstoff mit Hilfe eines Katalysators. Im Zusammenhang mit Glucosebestimmungen sind als Katalysatoren Peroxidase sowie die Systeme Jodid/ Molybdat (DE-AS 1 284124), Jodid/Vanadat (DE-OS 1 598 828), und Jodid/Wolframat (DE-OS 2 163 421) bekannt.
Aus Anal. Chem. 34,452 (1962) ist ferner eine Glucosebe-stimmung bekannt, bei der ohne Verwendung eines Chromogens in Gegenwart des Katalysatorsystems Jodid/Molybdat das entstehende Trijodid direkt photometrisch gemessen wird. Diese Methode hat den Vorteil, dass der hohe Extinktionskoeffizient des Trijodids (ca. 20 cm2/|i,M) bei der spektrophotometri-schen Bestimmung ausgenutzt werden kann, wodurch eine hohe Präzision erreicht wird. Gleichzeitig werden die durch farbige Begleitstoffe in der Probe verursachten Störungen niedrig gehalten. Ausserdem ist die Reagenzlösung sehr stabil und kann deshalb bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden. Die Verwendung von cancerogenen und cocancerogenen Chromogenen kann vermieden werden.
Der entscheidende Nachteil dieser Methoden besteht darin, dass die zu untersuchende Probe der Körperflüssigkeit vorher enteiweisst werden muss, weil sonst die Färbung des Trijodids nicht beständig ist. Die zeitraubende Enteiweissung erschwert jedoch nicht nur die Bestimmungsmethode, sondern sie verhindert die Anwendung dieser an sich günstigen Methode in den Fällen völlig, in denen keine Enteiweissung möglich ist, wie z. B. bei der Cholesterinbestimmung in Körperflüssigkeiten, weil Cholesterin an Protein gebunden vorliegt.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Mittel zur photometrischen Bestimmung von Hydroperoxiden in eiweisshaltigen Flüssigkeiten auf der Basis einer Trijodidmessung zur Verfügung zu stellen, das ohne vorausgehende Enteiweissung exakte Analysenergebnisse liefert.
Erfindungsgemäss wurde die Aufgabe dadurch gelöst, dass das Katalysatorsystem in einer gegenüber den bekannten Konzentrationen um Grössenordnungen niedrigeren Konzentration zusammen mit einem Stabilisator verwendet wird.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxiden reagieren, in eiweisshaltigen Flüssigkeiten mit Hilfe eines wasserlöslichen Jodids, eines Redoxkatalysators und eines Stabilisators, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Redoxkatalysator in einer Konzentration von 5-500 jiM zusammen mit 5-100 mg/1 mindestens eines Stabilisators verwendet wird.
Ferner umfasst der Gegenstand der Erfindung das im Patentanspruch 5 definierte Mittel zur Ausführung des Verfahrens.
Überraschenderweise wird durch die niedrige Katalysatorkonzentration und durch den Zusatz mindestens eines Stabilisators eine stabile Färbung des Trijodids in der Probelösung auch in nicht enteiweissten Körperflüssigkeiten erreicht. Dieser Effekt tritt erstaunlicherweise nur dann ein, wenn sowohl der Katalysator als auch der Stabilisator im angegebenen Konzentrationsbereich kombiniert verwendet werden.
Als Redoxkatalysator können nach der Erfindung die Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze von Molybdänsäure, Wolframsäure oder Vanadinsäure verwendet werden, vorzugsweise Ammoniummolybdat. Die Konzentrationen liegen im Bereich von 5-500 jiM, wobei Ammoniummolybdat vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von 5-50 uM verwendet wird, insbesondere in einer Konzentration von 10 |xM. Die bevorzugten Bereiche bei Verwendung von Natriumwolframat liegen bei 50-200 |j.M und von Natriumvanadat bei 50-500 uM. Im Falle des bevorzugten Ammoniummolybdats z. B. ist die Konzentration gegenüber dem Stand der Technik(l-10 mM) um Grössenordnungen niedriger.
Geeignete Stabilisatoren nach der Erfindung sind z. B. Natriumazid, Hexamethylentetramin, Kaliumfluorid, Kaliumthiocyanat, Äthylendiamintetraessigsäure und/oder Nitrilotriessigsäure, vorzugsweise Natriumazid. Es kann entweder einer der genannten Stabilisatoren oder auch eine Mischung mehrerer Stabilisatoren eingesetzt werden. Die Konzentration sollte zweckmässig im Bereich von 5 bis 100 mg/1 liegen. Die bevorzugte Konzentration beträgt etwa 10 mg/1.
Als wasserlösliches Jodid wird vorzugsweise Natrium-, Kalium- oder Ammoniumjodid verwendet. Kaliumjodid ist besonders gut geeignet, weil es nicht hygroskopisch ist.
Um die enzymatischen Reaktionen in einem optimalen pH-Bereich ablaufen zu lassen, enthält das Mittel zweckmässig auch Puffersubstanzen, die einen pH-Bereich von 6,0-7,5 auf-
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Ammoniummolyb
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rechterhalten können. Als Puffer kommen die gebräuchlichen, 0,1 g/1 Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid wie z. B. Phosphat-, Citrat-, Borat- oder Tris(hydroxymethyl)- 10 |xM Ammoniummolybdat aminomethan-Puffer infrage. 10 mg/1 N atriumazid
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich zur Bestim- 0,2 M Kaliumphosphatpuffer pH-Wert 6,2
mung von Wasserstoffperoxid, von Substanzen, die unter Bil- 5
dung von Wasserstoffperoxid reagieren, sowie von peroxida- 5 ml der Puffer-Farbreagenz-Lösung werden mit 20 jxl was-
tisch wirksamen Substanzen in eiweisshaltigen Flüssigkeiten. serstoffperoxidhaltigem Serum gemischt, 20 bzw. 40 Minuten
Es ist insbesondere in den Fällen geeignet, in denen eine vor- lang bei 30 °C inkubiert, und anschliessend wird bei 366 nm die ausgehende Enteiweissung der zu untersuchenden Flüssigkeit Extinktion gemessen. Es werden 100% der eingesetzten Was-
nicht möglich ist, weil die nachzuweisende Substanz z. B. an io serstoffperoxidmenge wiedergefunden.
Eiweiss gebunden vorliegt. Ein wichtiges Beispiel für eine Das Verfahren wird mit verschiedenen Ammoniummolyb-
solche Substanz ist Cholesterin in Blut oder Serum. datkonzentrationen und Kombinationen von Ammoniummo-
Bei der enzymatischen Cholesterinbestimmung müssen lybdat und Natriumazid wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse, Cholesterin und seine Ester aus den Lipoproteinen freigesetzt ausgedrückt als Wiederfindung der eingesetzten Wasserstoffwerden. Das kann z. B. durch eine Protease erfolgen oder durch 15 peroxidmenge in Prozent, zeigt die nachstehende Tabelle. Behandlung mit bestimmten Detergentien, durch Gallensäuren oder durch Detergentien zusammen mit Gallensäuren. Um das freigesetzte Cholesterin und seine Ester in Lösung zu halten, ist ebenfalls ein Detergens notwendig. Für die erfindungsgemässe Cholesterinbestimmung hat sich zu diesem Zweck eine Deter- :
gentienkombination aus Polyäthylenglycol-mono-(1.1.3.3-tetra-methylbutyl)-phenyläther und Alkyldimethylbenzylammoni-umchlorid als besonders günstig erwiesen. Diese Detergentien-kombination hat den Vorteil, dass sie im Vergleich zu anderen in diesem Zusammenhang bekannten Detergentien den Rea-genzienleerwert praktisch nicht erhöht und dass ein Cholesterinoxidase hemmender Gallensäurezusatz vermieden werden kann. Ausserdem findet die Zersetzung der Lipoproteine bei Verwendung von Alkyldimethylbenzylammonium- P'e obigen Ergebnisse zeigen, dass unter den angewandten chlorid bereits bei Zimmertemperatur statt, während bei den zu 30 Bedingungen nur die erfindungsgemäss verwendete Kombina-diesem Zweck bekannten Detergentien höhere Temperaturen ^on e'ne ausreichend schnelle Reaktion und eine stabile Fär-notwendig sind. bung gewährleistet und deswegen für eine quantitative Bestim-
Im Rahmen der bevorzugten Reagenzienkombination mung geeignet ist.
besteht ein besonders geeignetes Mittel zur Cholesterinbestim- Analoge Ergebnisse werden erhalten, wenn man anstelle mung nach dem erfindungsgemässen Verfahren aus einer Puf- 35 von Ammoniummolybdat z. B. 100 |J.M Natriumwolfra-
fer-Farbreagenz-Lösung und einer Enzymlösung: mat oder 200 M-M Natriumvanadat einsetzt, sowie beim Austausch von Natriumazid durch Hexamethylentetramin, Kalium-
Puffer-Farbreagenz-Lösung fluorid, Kaliumthiocyanat, Äthylendiamintetraessigsäure, Nitri-
10-30 g/1 Kaliumjodid lotriessigsäure oder einem Gemisch solcher Substanzen.
5-50 p.M Ammoniummolybdat 40
5-15 mg/1 Natriumazid Beispiel 2
2 g/1 PolyäthylenglycoI-mono-( 1.1,3.3-tetramethylbutyl)- Bestimmung von Cholesterin im Serum phenyläther Die Puffer-Farbreagenz-Lösung ist die gleiche wie im Bei-
0,1 g/1 Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid spiel 1 beschrieben. Die Enzym-Lösung besteht aus 0,4 U/ml
0,1-0,5 M Puffer pH-Wert 6,2 45 Cholesterinesterase und 0,6 U/ml Cholesterinoxidase.
5 ml der Puffer-Farbreagenz-Lösung werden mit 20 (il Enzymlösung Serum einer bekannten Cholesterinkonzentration gemischt. 50
0,2-0,6 U/ml Cholesterinesterase ^ der Enzym-Lösung werden zu 1 ml dieser Mischung pipet-
0,3-1,0 U/ml Cholesterinoxidase tiert, gemischt und 20 bzw. 40 Minuten lang bei 30 °C inkubiert.
50 Anschliessend wird die Extinktion der Probe gegen einen Leer-Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wert bei 366 nm gemessen. Es werden 100% der eingesetzten wird z. B. eine Serumprobe mit der Puffer-Farbreagenzlösung Cholesterinmenge wiedergefunden.
gemischt und ein abgemessener Teil der Enzymlösung zugege- ^er Cholesteringehalt des Serums wird wie folgt berech-ben. Nach einer Inkubationszeit von 15 bis 45 Minuten bei einer net:
geeigneten Temperatur wird die Extinktion der Probe gegen 55 Cholesteringehalt [mg/100 ml] = À E • 440
den Leerwert bei 366 nm gemessen. Der Kalibrierungsfaktor wird durch Messungen mit einem
Die Enzymlösung besteht im Falle einer Glucosebestim- primären Standard ermittelt.
mung aus Glucoseoxidase, im Falle einer Aminosäurebestim- Analog Beispiel 1 wird das Verfahren mit verschiedenen mung aus Aminosäureoxidase, im Falle einer Harnsäurebestim- Konzentrationen von Ammoniummolybdat und Mischungen mung aus Uricase usw. 6o m't Natriumazid wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse, ausge drückt als Wiederfindung der eingesetzten Cholesterinmenge Beispiel 1 in Prozent, zeigt die nachstehende Tabelle.
Bestimmung von Wasserstoffperoxid in einer eiweisshaltigen Lösung
Puffer-Farbreagenz-Lösung:
20 g/1 Kaliumjodid
2,0 g/1 Polyäthylenglycol-mono-(1.1.3.3-tetramethylbutyl)-phe-nyläther
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Ammoniummolyb
Natriumazid
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10
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50 n.1 der verdünnten Probe gegeben und bei 25 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird die Extinktion der Probelösung bei 366 nm gemessen. Die Konzentrationen der Probelösungen werden durch Vergleich mit einem primären Glucosestandard 5 (2,0 g/1) berechnet:
Konzentration in der Probe =
2,0 x Extinktion der Probe Extinktion des Standards
10
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass unter den angewandten Bedingungen nur die erfindungsgemäss verwendete Kombination eine ausreichend schnelle Reaktion und eine stabile Färbung gewährleistet und deswegen für eine quantitative Cholesterinbestimmung geeignet ist.
Analoge Ergebnisse werden bei der Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase, der Aminosäurebestimmung mit Amino-säureoxidase und der Harnsäurebestimmung mit Uricase erhalten.
Beispiel 3
Bestimmung von Glucose in einer eiweisshaltigen Lösung
Die Reaktionslösung besteht aus der Puffer-Farbreagenz-Lösung analog Beispiel 1 mit einem Zusatz von 10 U/ml Glu-cose-Oxidase. Die Proben werden 1 +10 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Zu 1 ml der Reaktionslösung werden
Durch Messung nach verschiedenen Inkubationszeiten wurde die Stabilität der Färbung anhand mehrerer Proben überprüft:
Inkubations- Gefundene Glucosekonzentration [g/1]
zeit (min) Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5
15
0,896
0,950
0,979
1,064
2,223
20 20
0,903
0,952
0,982
1,077
2,218
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0,900
0,958
0,991
1,079
2,216
30
0,904
0,959
0,992
1,087
2,212
Probe 2 und Probe 3 waren zwei handelsübliche Kontrollse-25 ren, bei denen mit Referenzmethoden eine Glucosekonzentration von 0,95 bzw. 0,988 [g/1] festgestellt worden war.
Claims (8)
1. Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxiden reagieren, in eiweisshaltigen Flüssigkeiten mit Hilfe eines wasserlöslichen Jodids, eines Redoxkatalysa-tors und eines Stabilisators, dadurch gekennzeichnet, dass der Redoxkatalysator in einer Konzentration von 5-500 jxM zusammen mit 5-100 mg/1 mindestens eines Stabilisators verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Redoxkatalysator Molybdat, Wolframat oder Vanadat verwendet wird.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Redoxkatalysator Ammoniummolyb-dat in einer Konzentration von 5-50 p.M verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Stabilisator Natriumazid, Hexamethy-lentetramin, Kaliumfluorid, Kaliumthiocyanat, Äthylendiamin-tetraessigsäure, Nitrilotriessigsäure einzeln oder im Gemisch untereinander verwendet wird.
5. Mittel zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend ein wasserlösliches Jodid, 5-500 |iM eines Redoxka-talysators und 5-100 mg/1 mindestens eines Stabilisators.
6. Mittel nach Anspruch 5, enthaltend Kaliumjodid, 5-50 jiM Ammoniummolybdat und 10 mg/1 Natriumazid.
7. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zur photometrischen Bestimmung von aus Cholesterin mit Cholesterin-oxidase freigesetztem Wasserstoffperoxid in eiweisshaltigen Flüssigkeiten.
8. Anwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung in Gegenwart von Polyäthylenglycol-mono-(1.1.3.3.-tetramethylbutyl)-phenyläther und Alkyldimet-hylbenzylammoniumchlorid durchgeführt wird.
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