DE2831083A1

DE2831083A1 - Analysengeraet und verfahren zu dessen behandlung

Info

Publication number: DE2831083A1
Application number: DE19782831083
Authority: DE
Inventors: Spaeter Genannt Werden Wird
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1977-07-15
Filing date: 1978-07-14
Publication date: 1979-02-08
Also published as: BE869022A; SE7807844L; FR2397636A1; NL7807581A; IE781422L; NO782452L; IE47123B1; IT1108116B; FI782252A; IT7868681A0; JPS5448592A; DK317078A; NZ187860A; FR2397636B3; LU79976A1; AU3804178A

Description

u.Z.: M SO5 .
Case: DUI-2056

GIST-BROCADES N.V.
Delft, Niederlande
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" Analysengerät und Verfahren zu dessen Behandlung "

Die Erfindung betrifft Geräte zur Durchführung von chemischen und mikrobiologischen Analysen, beispielsweise in Harn oder anderen biologischen Flüssigkeiten; ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung derartiger Geräte sowie Analyseverfahren unter Verwendung derartiger Geräte.

Für rasche Tests werden üblicherweise mit Reagentien imprägnierte Papierstreifen oder poröser Kunststoff oder Tabletten verwendet. Lediglich eine begrenzte Anzahl chemischer Reaktionen laufen in einem derartigen Teststreifen oder einer derartigen Tablette zufriedenstellend ab.

Die Streifen oder Tabletten werden in die zu analysierende Flüssigkeit eingetaucht, wo sie bei Vorliegen einer bestimmten Substanz in der Flüssigkeit ihre Farbe ändern. Diese Testverfahren ergeben im allgemeinen qualitative Daten; in einigen Fällen werden halbquantitative Daten erhalten. Beispielsweise kann bei Verwendung eines Reagensstreifens zusammen mit einem Reflektometer eine quantitative Bestimmung mit begrenzter Genauigkeit durchgeführt werden. Für genauere Bestimmungen

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f sind im allgemeinen komplizierte Maßnahmen erforderlich, die zeitraubend sind und eine aufwendige Ausrüstung erfordern. Im Prinzip können viele Tests automatisiert werden, doch ist dies im Hinblick auf die erforderlichen teueren Geräte in großen Laboratorien geeignet, in denen eine große Anzahl des gleichen Tests durchgeführt wird. ■

Es ist ferner bekannt, Radiο-Immuntests in Plastikröhrchen (K. Gatt und G.W. Tregear "Science" jL5_8, 1570 (1967) ) oder in Kapillaren mit Innenwänden aus Hochpolymeren einschließlich Glas (DE-PS 2 530 957) durchzuführen. Die Tests werden in Röhr chen oder Kapillaren durchgeführt, deren Innenwand mit einem Antikörper beschichtet ist. Entsprechend der DS-PS soll der Durchmesser der Kapillaren zweckmäßigerweise ein Millimeter oder weniger Getragen.

Es ist nun herausgefunden worden, daß eine große Anzahl von Analysereaktionen in geeigneter Weise in Kapillaren durchgeführt werden kann, deren Durchmesser größer als 1 mm ist. Derartige Kapillaren bilden billige, leicht zu handhabende Behälter zur Durchführung qualitativer, halbquantitativer und quantitativer chemischer Analysen. Das erfindungsgemäße Gerät besteht aus einer Kapillare aus inertem . Material, deren Innendurchmesser größer als 1 mm ist und an deren Innenfläche ein Reagens oder Reagentien anhaften. Die Menge des Reagens kann von einer monomolekularen Schicht bis zu einer Maximalmenge variieren, die in der Bohrung der Kapillare aufgenommen werden kann, ohne daß die Kapillarwirkung beeinträchtigt wird.

Unter dem hier verwendeten Begriff "Reagens" werden nicht nur chemische Substanzen sondern auch Mikroorganismen verstanden, die durch die Testflüssigkeit beeinflußt werden können,

Das Kapillarmaterial sollte von der zu untersuchenden Flüssigkeit benetzbar sein. Am geeignetsten für die Untersuchung

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wäßriger Flüssigkeiten sind Glaskapillaren. Der Innendurchmesser der Kapillare sollte so bemessen sein, daß die Testflüssigkeit in der Kapillare ansteigt, wenn diese in die Flüssigkeit eingetaucht wird. Wenn der Durchmesser kleiner als 1 mm ist, verbleibt für die Flüssigkeit neben dem Reagens kein ausreichender Raum, und wenn die Kapillare zu großen Durchmesser aufweist, so führt das Fehlen der Kapillarwirkung oder unzureichende Kapillarwirkung dazu, daß lediglich ein geringes Volumen der Flüssigkeit angesaugt wird; dadurch wird eine geeig-•|0 nete Verwendung ausgeschlossen. Ein Innendurchmesser von 1 bis 1,5 mm ist bevorzugt. Die Länge der Kapillare beträgt vorzugsx-reise von 30 bis 150 mm. Erfindungsgemäß können kommerziell verfügbare Mikropipetten von etwa 100 ul verwendet werden.

Wenn die Kohäsion des Reagens oder dessen Adhäsion an dem Kapillarmaterial nicht ausreichend ist, um das Reagens an der Kapillare festzuhalten, so kann ein Klebstoff verwendet werden. Beispiele geeigneter Klebstoffe sind Polymere biologischen oder synthetischen Ursprungs, beispielsifeise Proteine, Cellulosederivate oder Polyvinylpyrrolidon. Der ausgewählte Klebstoff sollte den durchzuführenden Test nicht beeinträchtigen.

Erfindungsgemäß werden die Testkapillaren dadurch vorbereitet, daß sie in eine Flüssigkeit eingetaucht werden, in der ein Reagens-oder mehrere Reagentien aufgelöst oder susoendiert sind, und gegebenenfalls in einen Klebstoff, so daß die Lösung oder Suspension in der Kapillare unter dem Einfluß der Kapillarwirkung ansteigt] danach wird die Kapillare aus der Lösung oder Suspension entnommen und die in der Kapillare enthaltene Flüssigkeit beispielsweise durch Gefriertrocknen entfernt.

Erfindungsgemäß erfolgt eine chemische oder mikrobiologische Analyse dadurch, daß eine Flüssigkeit, zu der ein Reagens oder mehrere Reagentien zugegeben werden können, in eine Kapillare eingesaugt wird, an deren Innenwand ein Reagens oder Reagentien für die zu untersuchende Substanz anhaften.

^L 809886/0738 κ

In beiden Fällen wird die Wirkung des Reagens in der Kapillare auf die Testflüssigkeit beobachtet, beispielsweise durch Änderung der Farbe oder durch Wachstumsbeschleunigung der Mikroorganismen.
• 5

Die erfindungsgemäßen Kapillaren können für qualitative, semiquantitative und quantitative Analysen verwendet werden. Eine qualitative Analyse kann mit einer einzigen Kapillare erfolgen. Wenn eine Reaktion zwischen der Testflüssigkeit und dem Reagensin der Kapillare beobachtet wird,- so zeigt dies an, daß eine spezifische Substanz oberhalb einer bestimmten Minimalkonzentration vorhanden ist. Wenn mehrere .Kapillaren mit verschiedenen, vorher bestimmten Reagentienmengen verwendet werden,

kann eine halbquantitative Analyse erfolgen. 15

Erfindungsgemäß ist daher vorgesehen, daß an den Innenflächen der Kapillaren aus inertem Material vorbestimmte Mengen eines oder mehrere Reagentien anhaften. Die Menge des Reagens in der Kapillare kann dadurch kontrolliert werden, daß eine Flüssigkeit mit bekannter Konzentration des Reagens bis zu einer vorgegebenen Höhe in der Kapillare angesaugt wird. Die Analyse kann auf üblichen chemischen Reaktionen beruhen; als Reagens kann ferner eine Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet werden., so daß die Kapillaren bei Immuntests eingesetzt werden können.

Bei Tests unter Anwendung üblicher chemischer Reaktionen werden vorzugsweise Reagentien verwendet, die in der Test flüssig-* keit leicht lösbar oder suspendierbar sind. In diesen Fällen wird die Reagenskonzentration in der Flüssigkeit durch die Abmessungen der Kapillare und durch die darin enthaltene Menge des Reagens bestimmt.

Bei Immuntests wird ein Reagens, beispielsweise ein Antikörper, verwendet, der an der Wand haften bleibt, so daß eine Reaktion an der Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit und der mit dem

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Reagens bedeckten Kapillarwand stattfindet. In diesen Fällen haben die Kapillaren den Vorteil, daß die Reagensschicht nicht leicht beschädigt wird. Die Kapillaren können leicht geleert werden, beispielsweise durch Berühren der Kapillaren mit einem Stück löschpapier; das Wiederauffüllen mit einer Flüssigkeit bis zu einem vorbestimmten Niveau entsprechend einem gexiünschten Volumen ist ebenfalls einfach. Daher ermöglichen die erfindungsgemäßen Kapillaren die einfache Durchführung mehrstufiger Analysen, ohne daß Fülleinrichtungen, wie Pipetten usw., erforderlich sind.

Das Auftreten einer Reaktion kann visuell (beispielsweise durch Änderung der Farbe oder durch Bilden eines Niederschlags) oder durch Instrumente (beispielsweise durch Änderung der Absorption im UV- oder im IR-Spektrum) beobachtet werden. Bei Anwendung optischer Verfahren ist das Kapillarenmaterial vorzugsweise für die fragliche Wellenlängen durchsichtig.

übliche Analysentechniken können angewandt werden, um die Konzentration der Reaktionsprodukte in der Kapillare quantitativ

zu bestimmen.
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Zur Messung von Farbänderungen oder der Absorption im sichtbaren, ultravioletten oder infraroten Bereich, können optische Instrumente verwendet werden..

Radioaktivitätsmessungen können bei Radio-Immuntest-Analysen durchgeführt werden, wo entweder das Antigen oder der Antikörper auf der Wand der Kapillare oder auf einer an der Wand anhaftenden Zwischenschicht aufgebracht oder kovalent gebunden ist.

Wenn sich bei der Reaktion die elektrischen Eigenschaften ändern, beispielsweise die Leitfähigkeit, so können diese Änderungen durch geeignete Instrumente gemessen werden.

In einigen Fällen reicht eine einzige Messung nach dem Ab-Schluß der Reaktion aus. In anderen Fällen ist es erforderlich, die Änderung der untersuchten Parameter über einen bestimmten

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Zeitraum hinweg zu verfolgen, beispielsweise bei Enzym-Immuntests, wo die Reaktion des Indikator-Enzyms mit einem Absorptionsmeter verfolgt wird.

Gerinnungs- oder Verfestigungsreaktionen können durch Viskositatsmessungen festgestellt werden, beispielsweise durch Beobachten der Flüssigkeitsströmung, wenn die Kapillare umgedreht wird oder durch Bestimmen der Zeit, die erforderlich ist, um die Kapillare auf einem Stück Löschpapier zu entleeren. Das Wachstum von Mikroorganismen in der Kapillare kann mit Hilfe der Turbidimetrie gemessen werden. Dadurch kann die Empfindlichkeit gegen Antibiotika gemessen oder umgekehrt die Konzentration der Antibiotika bestimmt werden, und zwar mit Hilfe

einer Standardsuspension sensitiver Mikroorganismen. 15

Die Aufzählung der mit den Kapillaren anwendbaren Techniken ist lediglich beispielhaft und nicht einschränkend. Insbesondere können die Kapillaren ganz allgemein zur Analyse von biologischen Flüssigkeiten und Sekreten und bei der Bestimmung diagnostisch interessanter Substanzen verwendet werden.

Aufgrund des relativ großen Durchmessers der Kapillaren (im Vergleich zu denen gemäß dem DE-PS 2 530 957) haben kleine Dimensionsänderungen keinen großen Einfluß auf die Zuverlässigkeitsgrenzen quantitativer Analysen. In bestimmten Fällen, insbesondere bei quantitativen Analysen oder Verwendung optischer Techniken, sollten jedoch die Variationen innerhalb bestimmter Grenzen bleiben. Vorzugsweise sollten der Innendurchmesser und die Wanddicke von dem Mittelwert einer bestimmten Kapillare um nicht mehr als 2 % abweichen. Wenn bei der Analyse zwei oder mehr Kapillaren bei Vergleichsmessungen, beispielsweise bei der Lichtabsorption, verwendet werden, sollten die Unterschiede zwischen ihren Abmessungen ebenfalls vorzugsweise innerhalb der genannten Grenzwerte bleiben,

Erfindungsgemäß ist daher eine Analyseausrüstung mit zwei oder

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mehr Kapillaren vorgesehen, deren Wanddicken und Innendurchmesser um nicht mehr als 2 % von den Mittelwerten der Kapillaren der Analyseausrüstung abweichen.

Folgende Tests können beispielsweise durchgeführt werden: Im Harn: Lactat, Glucose

Im Serum oder Plasma:. Glucose, Cholesterin, der Blutharnstoffwert (BUN), Harnsäure, Triglyceride, Gesamtproteine, alkalische Phosphatase, Serum-Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (SGOT), Serum-Glutamat-pyruvat-Trans-

äminase (SGPT), Kreatinphosphokinase (CPK), S-Hydroxybutyrah-Lactatdehydrogenase (LDH) In einer Amnionflüssigkeit: Enzyme oder Metaboliten, deren

Vorhandensein oder Fehlen angeborene Fehler des Stoffwechselhaushalts anzeigen, wie Galactokinase,

Galactose-1-Phosphateridyl, 1,4-Glucosidase, Arylsulfatase A, o(-l-Iduronidase, Pyruvinsäure (Acetylameisensäure), Milchsäure und 2-Oxoglutarsäure In zerebrospinalen Flüssigkeiten: Glucose, Protein. 20

Für derartige Bestimmungen können allgemein bekannte Reaktionen verwendet werden. Beispielsweise kann. Lactat bestimmt werden mittels LDH und einem Farbstoff, wie Dichlorphenolindophenol (DCIP); LDH kann bestimmt werden mit Lactat und einem Farbstoff (beispielsweise DCIP); Glucose kann bestimmt werden mit Glucose-Oxidase, Peroxidase und einem Farbstoff (beispielsweise o-Toluidin); Cholesterin kann bestimmt werden mit Cholesterin-Oxidase, Peroxidase und einem Farbstoff; Protein kann bestimmt werden mit einem biuretartigen Reagens oder einem den pH-Wert anzeigenden Farbstoff unter Ausnutzung des sogenannten Proteineffekts; ß-Hydroxybutyrat kann bestimmt werden mit ß-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase und einem Farbstoff.

Die Vorbereitung der erfindungsgemäßen Testkapillare wird in dem folgenden Beispiel erläutert.

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Beispiell

In 1 Liter destilliertem Wasser werden 2,4 mMol Dichlorphenolindophenol (DCIP) aufgelöst, und dieser Lösung werden 10 Mikroliter In NaOH zugegeben. Um eine vollständige Oxidation zu erhalten, wird reiner Sauerstoff durch die Lösung geleitet. Diese Lösung wird mit 5 Liter einer Lösung verdünnt, in der pro Liter 0,19 KoI eines Kaliumphosphat-Puffers und 1,2 mMol EDTA enthalten sind. Dann werden 90 000 Einheiten Hefe-Lactatdehydro genase (Y-LDH) mit einer spezifischen Aktivität von 17,2 Einheiten pro mg Protein aufgelöst. Die erhaltene Konzentration an DCIP beträgt 0,4 mMol pro Liter. Glaskapillaren mit 1,5 mm Innendurchmesser und 60 mm Länge (Volumen etwa 100 Mikroliter) werden in diese. Lösung eingetaucht, so daß diese bis zu einer Höhe von etwa 22 mm ansteigen kann und so etwa 40 Mikroliter der Lösung in jeder der Kapillaren enthalten ist. Unmittelbar danach werden die Kapillaren auf Gefriertemperatur gebracht und während etwa 17 Stunden gefriergetrocknet. An den trockenen Kapillaren ist die Füllgrenze deutlich sichtbar.

Das bei dem obigen Verfahren verwendete Y-LDH wird in der folgenden Weise hergestellt.

800 g frische, gepreßte Bäckerhefe werden gefriergetrocknet und fein pulverisiert. Anschließend erfolgt eine Extrahierung und Fraktionierung mit Aceton gemäß der Beschreibung von A, Spyridakis und L.F. Naslin in "Biochemie" £3, 195-205 (1971), mit der Ausnahme, daß die Autolyse während 20 Stunden bei 4°C erfolgt. Der rosa Niederschlag wird während 1 Stunde bei -2°C bis 0⁰C mit einer wäßrigen Lösung extrahiert, in der pro Liter 0,15 Mol Natriumlactat, 0,1 mMol Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mMol MgSO₂₁ und I50 g Aceton enthalten sind. Der pH-Wert der Lösung beträgt 6,8, Dadurch wird die Dialyse des rosafarbenen, klebrigen Niederschlags vermieden, was zu einem ernstlichen Aktivitätsverlust führen würde. Der Extrakt wird dann in der bei R.K. Morton und K. Shepley in "Biochem. J." 89, 257-262 (1963) beschriebenen Weise behandelt, bis der

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Pyrophosphatextrakt erhalten wird; dieser wird dann mit Ammoniumsulfat bis zu 70 % gesättigt, und diese Lösung wird dann über Nacht bei -20⁰C gelagert. Nach dem Zentrifugieren während 50 Minuten bei 11 000 g und 0⁰C wird das rohe Y-LDH in 10 ml eines 0,1 molaren Puffers (Tri-(hydroxymethyl)-aminoinethan-HCl) bei einem pH-Wert von 8,0 gelöst und bei 4°C in einer Säu le mit Diäthylaminoäthylcellulose-Füllung (Sephadex A 25 von Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) chroraatographiert, wobei die Länge der Säule 30 cm und der Durchmesser 2,5 cm beträgt. Das Y-LDH wird mit einer 0,1 molaren Lösung eines Puffers bei einem pH-Wert von 8,0 (Tri-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl) eluiert. Die mit einem Gehalt von bis zu 70 % Ammoniumsulfat angereicherte Enzymlösung kann bei -20 C gelagert und durch Zentrifugieren konzentriert werden. Die spezifische Aktivität des Produkts beträgt bis zu 17 Enzymeinheiten pro mg des Gesamtproteins.

Eine Einheit des Y-LDH ist hier so definiert, daß diese Menge ein Mikromol von Pe(III)-cyanid pro Minute bei 25°C in einer Lösung reduziert, die pro Liter 0,1 Mol eines Phosphatpuffers (pH-Wert = 7,2), 5,0 mMol des Fe(III)-cyanid-ions, 20,0 mMol L (+) Lithiumlactat enthält, und zwar gemessen durch die Verfolgung der Extinktionsabnähme bei 420 nm (Absorptionsmaximum des Fe(III)-cyanids).

Das bei diesem Verfahren erhaltene Y-LDH weist eine ausreichend hohe spezifische Aktivität für eine Lactatbestimmung gemäß Beispiel 2 auf. Für eine derartige Bestimmung ist eine spezifische Aktivität zwischen 10 und 20 Einheiten pro mg Gesamtprotein geeignet. Eine niedrigere spezifische Aktivität würde ziemlich große Gesamtproteinmengen erfordern, um genügend Enzym zu haben, doch dies kann zu Verstopfungen der Kapillaren führen.

Eine höhere spezifische Aktivität würde dazu führen, daß das Protein nicht ausreichen würde, um das feste Reagens an den

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Wänden der Kapillaren festzukitten; in diesem Fall ist ein äußerer Kitt erforderlich.

Die Lactatbestimmung mit einer nach dem Beispiel 1 vorbereitaten Kapillare wird in den folgenden Beispiel beschrieben.

Beispiel 2

Einige der trockenen Kapillaren werden getestet, indem sie mit 40 ul einer Lösung, die eine bestimmte Menge an Natriumlactat pro Liter enthält, gefüllt und zum Erhalten eines Gemisches geschüttelt vrerden und beobachtet wird, ob eine Farbänderung auftritt. Die Lösungen, die bis zu 0,4 mMol Dro Liter enthalten, entfärben die Kapillaren innerhalb 2 Minuten nicht, während die Lösungen, die mehr als 0,4 mMol des Natriumlactats enthalten, eine Entfärbung innerhalb 2 Minuten verursachen. Die zum Entfärben erforderliche Zeit wird festgehalten, und die Daten werden zur Konstruktion einer Standardkurve benutzt. Diese Kurve ist in der Figur dargestellt. - Aus dieser Kurve kann der Überschuß an Lactationen bestimmt werden. Eine Lactatkonzentration oberhalb 0,4 mMol pro Liter wird als Überschuß angesehen, da Konzentrationen bis zu diesem Wert im menschlichen Urin normal sind, während höhere- Konzentrationen pathologische Zustände anzeigen, wie Diabetes, Glycogen-Speicherkrankheit, angeborene Milchsäureazidose, neoplastische proliferierende Störungen oder herabgesetzte Nierenfunktion.

Urinproben, die verschiedene, bekannte Mengen an Natriumlactat und Ascorbinsäure enthalten, werden in der folgenden Weise untersucht:

Zunächst ϊϋΙγο jeder Probe eine geringe Menge pulverisierter Aktivkohle zugegeben, und das Gemisch wird zur Erzeugung einer homogenen Dispersion geschüttelt. Unmittelbar danach wird der Kohlenstoff abgefiltert, und das Filtrat wird unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Kapillare untersucht. Die Adsorption der Ascorbinsäure an der Aktivkohle ist praktisch vollständig, während die Adsorption des Lactats am

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Kohlenstoff vernachlässigbar ist. Die Entfernung der Ascorbinsäure ist erforderlich, da diese Verbindung bei diesem Test ebenfalls oxidiert werden kann.

In dein Harn werden ferner 1-Hydroxybutyrat-ionen festgestellt, doch diese Verbindung beeinflußt nicht den Lactat-Test.

Eine Anzahl der nach dem Beispiel 1 vorbereiteten Kapillaren wird bis zu 6 Monaten bei -20⁰C und bei Dunkelheit gelagert. Bei der Untersuchung der gelagerten Kapillaren unter Anwendung des Verfahrens nach Beispiel 2 werden die Resultate mit frischen Kapillaren der gleichen Grup_ye verglichen, wobei sich keine bedeutsamen Unterschiede ergeben,

Bei dem in Beispiel 2 beschriebenen Test kann anstelle des Y-LDH aus Muskeln von Säugetieren erhaltenes LDH verwendet werden. Dieses LDH weist optische Aktivität bei pH = 10 auf und arbeitet zufriedenstellend bei einem ρH-Viert von 9,6 bis

10,3.
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Irgendein anderes vergleichbares Enzym kann ebenfalls verwendet werden. Unabhängig davon, welches Enzym eingesetzt wird, muß immer der pH-Wert auf einen geeigneten Wert nahe dem optima len pH-Wert des Enzyms eingestellt werden, indem dem Reagens ein Puffergemisch zugegeben wird, da der pH-Wert des Harns in einem großen Bereich variieren kann.

Neben .dem DCIP existieren verschiedene, gefärbte Oxidationsmittel mit einem geeigneten Oxidationspotential, die die rasisten Verbindungen nicht oxidieren, die regelmäßig oder manchmal im Harn beim Fehlen eines katalysierenden Enzyms auftreten und die bei Vorliegen eines LDH das Lactat-Ion selektiv oxidieren.

Beispiele für andere, zur Verwendung mit Y-LDH geeignete Oxidationsmittel, sind Fe(III)-cyanid-ionen, Methylenblau und o-

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Phenanthrolin sowie Fe -Ionen. Wenn Jedoch Muskel-LDH verwendet wird, kann ein Gemisch aus Nikotinamid-Adenin-Dinucleotld, Phenazinmethosulfat und Nitroblautetrazollumehlorld eingesetzt werden. In der oxidierten Form ist jede dieser Verbindungen gefärbt, während sie in der reduzierten Form jeweils entweder farblos sind oder eine andere Farbe aufweisen. Vorzugsweise sollte das Oxidationsmittel zu dem Zeitpunkt eine rasche und starke Farbänderung vornehmen, wenn das gesamte Oxidationsmittel reduziert worden ist, und die reduzierte Form des Oxidationsmittels sollte durch Luft nicht leicht reoxidiert herden, da dadurch die Ergebnisse verfälscht werden können. Das Oxidationsmittel sollte vorzugsweise in Wasser rasch ; lösbar und nicht hygroskopisch sein.

Eine sehr gute Kombination dieser Eigenschaften liegt im DCIP vor, das in seinen oxidierten Alkalisalzen (pH-Wert oberhalb etwa 6) eine stark blaue Farbe aufweist und das entweder als oxidierte Säure oder in seiner reduzierten Form farblos ist.

"■·":■

Die blaue Form des DCIP hat ihr Absorptionsmaximum bei 600 nm mit einem Extinktionskoeffizienten ~~ ^Λ χ 1O^J cm/mKol. Bei dieser Wellenlänge hat das aus Muskeln isc ί. ':^r ^TrvH eine merkliche Lichtabsorption, und zwar zumindest in der bevorzugten Form, bei der es noch etwas von dem ursprünglich vorhandenen Proteinmaterial enthält; aus diesem Grund wird, dieses Oxidationsmittel vorzugsweise in Kombination mit dem aus Hefe erhaltenen LDH verwendet, das eine derartige Absorption nicht zeigt. Das Y-LDH hat den weiteren Vorteil, daß sein

³^ optimaler pH-Wert näher an den pH-Werten liegt, die normalerweise im Harn vorliegen und bis herunter zu UjU betragen können. Die Verwendung eines Enzyms mit einem niedrigeren optimalen pH-Wert führt dazu, daß geringere Mengen an' Puffermaterial erforderlich sind, um den optimalen pH-Wert unabhängig von dem der Harnprobe einzustellen.

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] Ein anderer Unterschied zv;ischen den zwei Arten von LDH besteht darin, daß die Reoxidation des Oxidationsmittels durch Luft mit dem aus Muskeln erhaltenen LDH rascher ist; dies ist natürlich unerwünscht»

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Claims

VOSSiUS · VOSSlUS · HILl L · TAUCHNER · HEUNEMANN

PATENTANWÄLTE ? 8 ^ 1 Ω 8 ^

SIEBERTSTRASSE A ■ 8OOO MÖNCHEN 86 - PHONE: (089)474075 CABLE; BENZOLPATENT MÜNCHEN -TELEX 5-29 4-5 3 V O P AT D

u.Z.: M 305 (He/lco)
Case: DUI-2056

I⁴JUl. WB

GIST-BROGADES N.V. .

DeIft, Niederlande
10

¹¹ Analysengerät und Verfahren zu dessen Behandlung "

Priorität: 15. Juli 1977, Großbritannien, Nr. 29 878/77 15

Patentansprüche

1J Analysengerät, gekennzeichnet durch eine Kapillare aus inertem Material, deren Innendurchmesser mehr als 1 mm beträgt und an deren Innenfläche ein Reagens oder mehrere Reagentien haften.
2. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Glas besteht. "" '
3. Gerät nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

der Innendurchmesser von 1 bis 1,5 mm beträgt. 30
4. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen der Bohrung etwa 100 ul beträgt.
5. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Abweichungen der V/anddicke und des Innendurchmessers von ihren Mittelwerten höchstens 2 % betragen.

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ORIGINAL INSPECTED
6. Gerätesatz aus mindestens zwei Geräten nach Ansoruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Innendurchmesser und die Wanddicke jeder Kapillare von den Mittelwerten des Gerätesatzes um höchstens 2 % abweichen.
7. Analyseausrüstung, gekennzeichnet durch einen Kapillarsatz nach Anspruch 6.
8. Verfahren zur Vorbereitung eines Analysegeräts nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine geeignete Kapillare in ein Lösungs- oder ein Suspensionsmittel mit einem oder mehreren Reagentien und gegebenenfalls mit einem Klebstoff eintaucht, so daß die Flüssigkeit unter dem Einfluß der Kapillarkräfte in der Kapillare ansteigt, daft man die Kapillare aus der Flüssigkeit entnimmt und daß das in der Kapillare enthaltene Lösungs- oder Suspensionsmittel entfernt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel oder das Suspensionsmittel durch Gefriertrocknen entfernt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 3 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die in die Kapillare eingesogene Flüssigkeit Dichlorphenolindophenol und Hefe-Lactatdehydrogenase (Y-LDH) enthält.
11. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß es vorbestimmte Mengen an einem oder mehreren

Reagentien enthält.
30
12. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens oder die Reagentien durch die Testflüssigkeit leicht aufgelöst oder suspendiert werden.
13. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 5, H oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens oder die Reagentien an

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der Wand direkt oder über eine Zwischenschicht anhaften.
14. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es als Reagentien Dichlorphenolindophenol und Hefe-Lactatdehydrogenäse (Y-LDH) enthält.
15» Chemisches oder mikrobiologisches Analyseverfahren unter Verwendung der Kapillaren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in eine Kapillare, die ein Reagens oder Reagentien für die zu untersuchende Substanz enthält, eine Flüssigkeit eingesaugt und die Auswirkungen des oder der Reagentien in der Kapillare auf die Testflüssigkeit beobachtet wird. .
l6. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung von Lactat ein Gerät nach Anspruch 14 verwendet wird, · " - ■ ■
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder l6, dadurch gekennzeichnet, daß .der Flüssigkeit ein Reagens oder mehrere Reagentien zugegeben werden.

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