NO782452L - Fremgangsmaate og innretning for gjennomfoering av kjemiske og mikro-biologiske analyser - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår innretninger for å ut-føre kjemiske og mikrobiologiske analyser, f.eks. i urin eller

andre biologiske væsker, fremgangsmåter for fremstilling av slike innretninger og analytiske metoder der disse benyttes.

For hurtigprøver er det kjent å benytte reagensimpreg-nerte bånd av papir eller porøs plastik eller tabletter. Kun et begrenset antall kjemiske reaksjoner skjer på riktig måte i slike bånd eller tabletter.

Nevnte bånd eller tabletter blir dyppet i fluidet som skal analyseres hvoretter de forandrer farge når en viss substans er tilstede i fluidet. Slike prøvemetoder gir generelt data av kvalitativ karakter; i visse tilfeller også semikvantitative data. Ved bruk av reagensbånd i kombinasjon med et reflektometer kan det f.eks. gjennomføres kvantitative bestemmelser med begrenset nøyaktighet. For mer nøyaktige bestemmelser er det generelt nødvendig å benytte mer kompliserte prose-dyrer som er tidkrevende og krever mer utstyr. I prinsippet kan mange prøver automatiseres, men i lys av den dyre appara-tur som er nødvendig er det kun mulig i større laboratorier hvori serier av samme forsøk blir gjennomført.

Det er videre kjent å gjennomføre radioimmunoprøver i plastikrør (K Catt og G. W. Tregear i "Science", 158, 1570

(1967) eller i kapillarer med indre vegger av høye polymerer

(inkludert glass) (tysk patent nr. 2530957). Disse prøver gjen-nomføres med rør eller kapillarer der innerveggene er belagt med et antilegeme. Ifølge det tyske patent er diameteren for disse kapillarer fortrinnsvis 1 mm eller mindre.

Det er nå funnet at et stort antall analytiske reaksjo ner hensiktsmessig gjennomføres i kapillarer med diametre på over 1 mm. Slike kapillarer gir billige beholdere som er lett å behandle for gjennomføring av kvalitative, semikvantitative og kvantitative bestemmelser. Oppfinnelsen tilbyr en innretning bestående av en'kapillar av et inert materiale med en indre diameter på mer enn 1 mm og med et•reagens eller flere slike adherende til den indre overflate. Mengden reagens kan variere fra et monomolekylært sjikt til den maksimale mengde som kan has opp i boringen i kapillarrøret uten å påvirke kapillarvirkningen.

I foreliggende beskrivelse angir uttrykket "reagens" ikke bare kjemiske stoffer, men også mikroorganismer som kan påvirkes av prøvefluidet.

Materialet i kapillaren bør være fuktbart av fluidet som skal prøves. For undersøkelse av vandige væsker er glasskapillarer mest egnet. Den indre diameter av kapillaren bør være slik at prøvefluidet stiger i kapillaren når denne dyppes i fluidet. Når diameteren er mindre enn 1 mm, vil reagenset kun la det være tilbake utilstrekkelig rom for fluidet og når kapillaren er for vid, vil kapillarvirkningen mangle eller det vil være en utilstrekkelig slik, noe som resulterer i at kun et meget lite volum væske suges opp,, noe som således forhindrer

skikkelig bruk. En indre diameter mellom 1 og 1,5 mm er foretrukket. Lengden av kapillaren er fortrinnsvis mellom 30 og 150 mm. Kommersielt tilgjengelige mikropipetter på ca. 100 yl. kan fordelaktig benyttes for oppfinnelsens formål.

Når kohesjonen av reagensen eller dettes adhesjon til kapillarmaterialet er utilstrekkelig til å holde materialet i kapillaren, kan et adhesiv benyttes. Polymerer av biologisk eller syntetisk opprinnelse slik som proteiner, cellulosederi-vater eller polyvinylpyrrolidon er eksempler på egnede adhe-siver. Det er klart at det bør velges et adhesiv som ikke påvirker prøven som skal gjennomføres.

Ifølge et ytterligere trekk ved oppfinnelsen fremstil-les prøvekapillarer ved å dyppe en kapillar i en væske med en eller flere reagenser oppløst eller suspendert og, hvis nødven-dig et adhesiv, slik at oppløsningen stiger i kapillaren under påvirkning av kapillarkreftene, deretter å fjerne kapillaren fra oppløsningen og deretter å fjerne væsken i kapillaren, f.eks.

ved lyofilisering.

Ifølge et annet trekk ved oppfinnelsen gjennomføres en kjemisk eller mikrobiologisk bestemmelse ved å suge opp en væske hvortil det kan være tilsatt en eller flere reagenser i en kapillar som-til sin innervegg har adherende en reagens eller flere slike for stoffene som skal bestemmes.

I begcfe tilfeller blir virkningen av reagensen i kapillaren på prøvefluidet observert, f.eks. fargeforandring eller en inhibering av veksten av mikroorganismer.

Kapillarene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for kvalitative, semikvantitative og kvantitative bestemmelser. En kvalitativ bestemmelse kan gjennomføres ved en enkelt kapillar. Når det observeres en reaksjon mellom et prøvefluid og reagensen i kapillaren', antyder dette at en spesifikk substans er tilstede over en viss minimal konsentrasjon. Når det benyttes en serie kapillarer med varierende og på forhånd valgte mengder av reagenser, kan det gjennomføres en semikvantitativ bestemmelse.

Kapillarer av inert materiale med på forhånd valgte mengder av en eller flere reagenser adherende til innerveggen er derfor et annet trekk ved oppfinnelsen. Mengden av reagens i kapillaren kan reguleres ved å suge opp en væske med en kjent konsentrasjon av reagensen til et valgt nivå i kapillaren. Bestemmelsen kan baseres på vanlig kjemiske reaksjoner, men reagensen kan også være en komponent av en antigen-antilegeme reaksjon slik at kapillarene kan benyttes i immunoprøveteknikker.

De prøvene som involverer vanlige kjemiske reaksjoner er det foretrukket å benytte reagenser som lett oppløses eller suspenderes i prøvefluidet. I slike tilfeller vil konsentrasjonen i reagensen i fluidet bestemmes ved dimensjonene for kapillaren og den mengde reagens som inneholdes i fluidet.

Ved immunoprøveteknikker blir en reagens (f.eks. antilegeme) benyttet som forblir fiksert til veggen slik at reaksjonen skjer på grenseflaten mellom fluid og reagensdekket ka-pillarvegg. I slike tilfeller har kapillarene den fordel at reagenssjiktet ikke lett blir skadet. Kapillarene kan lett dre-neres, f.eks. ved å bringe dem i kontakt med et stykke trekkpapir og de kan fylles igjen med en væske til et bestemt nivå, noe som tilsvarer et ønsket volum. Således kan kapillarene ifølge oppfinnelsen gi et middel for lett å gjennomføre fler- trinnsanalyser uten bruk av ytterligere utstyr slik som pipetter osv.

Opptredenen av en reaksjon kan lett observeres visuelt (fargeforandring, bunnfålldannelse osv.) eller ved instrumenter (f., eks. absorbs jons forandring i den ultrafiolette eller infra-røde del av spekteret).

Det er åpenbart at materialet i kapillaren bør være transparent for den eller de bølgelengder som benyttes når man anvender optiske metoder.

Vanlige analytiske teknikker kan benyttes for kvantita-tiv bestemmelse av konsentrasjonen av reaksjonsproduktet i kapillaren.

Optiske instrumenter kan. benyttes for å måle forandringer i farge eller absorbsjon i det synlige, i den ultrafiolette eller den infrarøde del av spekteret.

Radioaktive målinger kan benyttes i radioimmunoprøver der enten antigenet eller antilegemet er belagt eller kovalent bundet på veggen av kapillaren eller til et mellomliggende sjikt som adherer til veggen.

Der reaksjonen medfører forandringer av elektriske egenskaper (f.eks. ledningsevne) kan slike forandringer måles ved egnede instrumenter.

I enkelte tilfeller er en enkelt måling etter at reaksjonen er ferdig tilstrekkelig. I andre tilfeller kan det være nødvendig å følge forandringen av parametere under prøven i løpet av et visst tidsrom, f.eks. i enzymimmunoprøver der indi-kator enzymreaksjonen følges med et absorbsiometer..

Klumpdannelsesreaksjoner kan følges ved hjelp av vis-kositetsmålinger, f.eks. ved å notere strømmen av fluid når kapillaren er snudd opp ned eller den tid som er nødvendig for å tømme kapillaren på et stykke trekkpapir. Veksten av mikroorganismer i kapillaren kan måles ved turbidimetri. På denne måte kan sensitiviteten overfor antibiotika måles eller vice versa konsentrasjonen av antibiotika ved hjelp av en standard-suspensjon av følsomme mikroorganismer.

Denne oppramsing av teknikker hvori kapillarene kan benyttes er kun ment som eksempel og begrenser ikke oppfinnelsens ramme. Generelt sagt kan kapillarene benyttes ved analyse av alle biologiske fluider og sekreter og ved bestemmelse av

alle stoffer av diagnostisk interesse.

Som et resultat av den relativt store diameter i kapillarene (sammenlignet med de som benyttes ifølge det ovenfor angitte tyske patent) har mindre variasjoner i dimensjonen ingen stor innflytelse på pålitelighetsverdiene for kvantitative bestemmelser. For visse formål, spesielt i kvantitative bestemmelser som benytter optiske teknikker, bør variasjonene være. innen visse grenser. Fortrinnsvis avviker den indre diameter og veggtykkelsen ikke mer enn 2% fra den midlere verdi innen den samme kapillar. Når en bestemmelse involverer bruken av to eller flere kapillarer i en sammenlignende måling (f.eks. av lysabsorbsjon), bør forskjellen mellom disses dimensjoner også fortrinnsvis ligge innenfor disse grenser.

Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen er derfor en "pakning eller et sett omfattende to eller flere kapillarer

av hvilke veggtykkelsen og den indre diameter ikke avviker mer enn 2% fra de midlere verdier for kapillarene i denne pakning eller dette sett.

Eksempler på prøver som kan utføres er:

I urin: laktat, glukose;

i serum eller plasma: glukose, kolesterol, blodureanitrogen (B.U.N.), urinsyre, triglycerider, totalproteiner, alkalisk fosfatase, serumglutaminsyre oksaloeddiksyre transaminase (SGOT), serum glutaminsyre pyruinsyre transaminase (SGPT), kreatinfosfokinase (CPK), 3-hydroksybutyrat, laktat dehydro-genase (LDH);

i amniotiske væsker: enzymer eller metabolitter hvis fravær eller nærvær antyder innebyggede metabolismefeil, f.eks. galak-tokinase, galakto-l-fosfateridyl, 1.4-glucosidase, arylsufatase A, a 1-iduronidase, pyruvinsyre, melkesyre og 2-oksoglutarsyre;

i cerebro- spinal fluider: glukose, protein.

Generelt kjente reaksjoner kan benyttes ved disse bestemmelser. F.eks. kan laktat bestemmes med LDH og et fargestoff, f.eks. diklorfenolindofenol (DCIP), LDH kan bestemmes med laktat og et fargestoff (f.eks. DCIP); glukose kan bestemmes med glu-koseoksydase, peroksydase og et fargestoff (f.eks. ortotoluidin) ; kolesterol kan bestemmes med kolesteroloksydase, peroksydase og et fargestoff; protein kan bestemmes ved en biuretlignende reagens av pH-antydende fargestoff, ved bruk av den såkalte protein- effekt; 3-hydroksybutyrat kan bestemmes med 3-hydroksybutyrat-dehydrogenase og et fargestoff.

Fremstillingen av en prøvekapiIlar ifølge oppfinnelsen ér beskrevet i det følgende eksempel.

Eksempel 1

I en liter destillert vann ble det oppløst 2,4 millimol diklorfenolindofenol (DCIP) og til denne oppløsning ble det satt 10 yl IN NaOH. Rent oksygen ble deretter boblet gjennom oppløsningen for å oppnå totaloksydasjon. Denne oppløsning ble fortynnet med 5 liter av en oppløsning som pr. liter inneholdt 0,18 mol av en kaliumfosfatbuffer og 1,2 millimol EDTA. Deretter ble gjærlaktatdehydrogenase (Y-LDH) oppløst i en mengde inneholdende 90.000 enheter og med en spesifikk virkning på 17,2 enheter pr. mg protein. Den endelige konsentrasjon av DCIP ble "bestemt til å være 0,4 m mol pr. liter. Glasskapillarer med en indre diameter på 1,5 mm og en lengde på ca. 60 mm (kapasitet ca. 100 yl) ble dyppet i denne oppløsning og oppløsningen ble tillatt å stige til en høyde på ca. 22 mm slik at ca. 40 yl av oppløsningen ble tatt opp i hvert av kapillarene. Umiddelbart deretter ble disse frosset og lyofilisert i ca. 17 timer. På

de tørre kapillarer var grensen hvortil de var fylt klart syn-lig.

Den Y-LDH som ble benyttet ved den ovenfor angitte fremgangsmåte ble fremstilt som følger: 800 g frisk, presset bakegjær ble lyofilisert og pul-verisert. Den ble deretter ekstrahert og fraksjonert med aceton slik det er beskrevet i detalj av A. Spyridakis'og L.F. Naslin i "Biochemie", 53, 195-205 (1971) bortsett fra at autolysen ble gjennomført i 20 timer ved 4°C. Det rosa bunnfall ble ekstrahert i 1 time ved -2°C til 0°C med en vandig oppløsning som pr. liter inneholdt 0,15 mol natriumlaktat, 0,1 mmol etylendiamin-tetraeddiksyre (EDTA), 1 mmol MgSO^og 150 g aceton. pH-verdien for oppløsningen var 6,8. Dette forhindret dialyse av det rosa klebrige presipitat, noe som ville resultere i alvorlige akti-vi tetstap. Ekstrakten ble deretter behandlet som beskrevet av R.K. Morton og K. Shepley i "Biochem", J. 89, side 257-262

(1963) inntil pyrofosfatekstraktet ble oppnådd og dette ble mettet med ammoniumsulfat til 70% og denne oppløsning ble lagret over natten ved -20°C. Etter sentrifugering i 50 minutter ved 11.000 g og 0°C ble den urene Y-LDH oppløst i 10 ml av en 0,1 mol buffer.(trihydroksymetylaminometan-HCl) ved pH 8,0 og kro-matografert ved 4°C på en kolonne av dietylaminoetylcellulose ("Sephadex A 25") med en lengde på 30 cm og en diameter på 2,5 cm. Den oppnådde Y-LDH ble eluert med en 0,1 mol oppløsning av en buffer med pH 8,0 (trihydroksymetylaminometan-HCl). Enzym-oppløsningen, mettet med ammoniumsulfat til 70%, kan lagres ved -20°C og den kan konsentreres ved sentrifugering. Den spe-sifikke virkning for dette produkt ble funnet å være opp til 17 enheter enzym pr. mg totalt protein.

En enhet av Y-LDH er definert i foreliggende beskrivelse som den mengde som reduserer et mikromol jern(III)cyanid pr. minutt ved 25°C i en oppløsning som inneholder pr. liter 0,1 mol• av en fosfatbuffer med pH 7,2, 5,0 millimol jern(III)cyanidion, 20,0 millimol L (+) litiumlaktat slik dette ble målt ved å følge ekstingsjonsreduksjonen ved 420 nm (jern(III)cyanids absorbsjonsmaksimum).

Den Y-LDH som ble oppnådd ved denne prosedyre hadde en tilstrekkelig høy spesifikk virkning for laktatbestemmelse slik som er beskrevet i eksempel 2. Det ble funnet at en spesifikk aktivitet mellom 10 og 20 enheter pr. mg totalprotein er hensiktsmessig for bestemmelsen. En lavere spesifikk aktivitet vil kreve heller store mengder av totalprotein for å ha tilstrekkelig enzym og dette har en tendens til. å stappe til kapillarene.

En høyere spesifikk aktivitet vil medføre ufullstendig protein til å sementere den faste reagens til veggene i kapillarene og i det tilfelle vil et eksternt sementeringsmateriale være nødvendig.

Bestemmelsen av laktat med en kapillar fremstilt ifølge eksempel 1 er beskrevet i det følgende eksempel 2.

Eksempel 2

Noen av de tørre kapillarer ble prøvet ved å fylle dem med 40 yl av en oppløsning inneholdende kjente mengder av natriumlaktat pr. liter, rystet for å oppnå grundig blanding og ob-servasjon av fargeforandring. Oppløsningene som inneholdt opp til 0,4 millimol pr. liter avfarget ikke kapillarene i løpet av 2 minutter, men oppløsninger som inneholdt mer enn 0,4 millimol natriumlaktat forårsaket avfarging i løpet av 2 minutter. Tiden som var nødvendig for avfarging ble notert og de angitte data ble benyttet for å konstruere en standardiseringskurve. Denne kurve er vist i fig. 1. Fra denne kurve kan overskuddet av laktationer anslås. En laktatkonsentrasjon.over 0,4 millimol pr.' liter er betraktet som overskudd, da konsentrasjoner opp til denne verdi er vanlig i menneskeurin og høyere konsentrasjoner er en indikasjon på en patologisk betingelse slik som diabetes, glykogenlagringssykdommer, kongenital laktisk, asidose, neoplastisk proliferative mangler eller forringede renalfunksj oner.

Urinprøver inneholdende varierende kjente mengder av

natriumlaktat og ascorbinsyre ble prøvet på følgende måte: Først ble det til hver prøve tilsatt en liten mengde pulverformig aktiv karbon og blandingen ble rystet for å oppnå en homogen dispersjon. Umiddelbart deretter ble karbon filtrert av og filtratet ble prøvet ved å benytte en kapillar som beskrevet i eksempel 1. Det ble funnet at adsorbsjonen av ascorbinsyre på det aktive karbon praktisk talt var fullstendig og adsorbsjonen av laktat på karbonet var neglisjerbar. Fjerning av ascorbinsyre er nødvendig, da denne forbindelse også kan oksyderes i denne prøve.

1-hydroksybutyrationer er også funnet i urin, men denne

forbindelse påvirker ikke laktatprøven.

Et antall av kapillarene som ble fremstilt ifølge eksem- ■ pel 1 ble lagret i tidsrom på opp til 6 måneder ved -20°C i mørke. Ved prøving av de lagrede kapillarer ved bruk av prose-dyren i eksempel 2 fant man ingen vesentlige forskjeller når resultatene ble sammenlignet med nye kapillarer fra samme lodd.

I de prøver som er beskrevet i eksempel 2 kan LDH som er oppnådd fra muskler av pattedyr benyttes i stedet for Y-LDH. den førstnevnte LDH har en optimal aktivitet ved en pH-verdi lik 10 og den virker tilfredsstillende ved pH-verdier mellom 9,6 og 10,3.

Et hvilket som helst annet sammenlignbart enzym kan også benyttes. Uansett hvilket enzym som benyttes, vil det alltid være nødvendig å justere pH-verdien til en egnet verdi nær den optimale pH-verdi for enzymet ved å tilsette en bufferblanding til reagensen fordi pH-verdien i urin kan variere innen vide grenser.

I tillegg til DCIP foreligger det forskjellige fargede oksydanter som har et egnet oksydasjonspotensial som ikke oksyderer de fleste av de forbindelser som opptrer regulært eller enkelte ganger i urin i fravær av et katalyserende enzym og som i nærvær av et LDH selektivt oksyderer laktationene.

Eksempler på andre oksydanter som er egnet til bruk med Y-LDH er jern(III)cyanidion, metylenblått og o-fenantrolin■ jern(III)ion. Når man imidlertid benytter muskel-LDH, kan en blanding av nikotinamid-adenindinukleotid, fenazinmetosulfat og nitroblått tetrazoliumklorid benyttes. I oksydert form er hver av disse forbindelser farget og i redusert form er de enten fargeløse eller har en annen farge. Fortrinnsvis bør oksydanten som benyttes undergå en hurtig og sterk fargeforandring på det øyeblikket all oksydant er redusert og den reduserte form av oksydanten bør ikke for lett kunne underkastes reoksydasjon ved luft da dette kan forkludre resultatene. Oksydanten bør ikke være hydroskopisk og den bør fortrinnsvis være hurtig opp-løselig i vann.

En meget god kombinasjon av slike egenskaper finnes i DCIP som har en sterk blå farge i form av de oksyderte alkali-salter (pH over ca. 6) og som er fargeløs både i den oksyderte syreform og i redusert form.

Den blå form av DCIP har et absorbsjonsmaksimum ved 600 nanometer med en ekstingsjonskoeffisient på o 20,1 x 10<3>cm 2/millimol. Ved denne bølgelengde har LDH som er isolert fra muskler en meget bemerkelsesverdig lysabsorbsjon, i det minste i den foretrukket benyttede form der den fremdeles inneholder noe av de opprinnelig ledsagende proteinstoffer og av denne grunn er det foretrukket å benytte denne oksydant i kombinasjon med LDH oppnådd fra gjær, hvilken ikke viser slik absorbsjon. Y-LDH har den ytterligere fordel at den optimale pH-verdi er nærmere pH-verdien som vanligvis foreligger i urin og som kan være så lave som 4,4. Bruken av et enzym med lavere optimal pH resulterer i at det er nødvendig med mindre mengder buffermateriale for å opprette optimal pH uavhengig av pH-verdien i urinprøven.

En annen forskjell mellom de to typer LDH ligger i at LDH som er oppnådd fra muskler underkastes en hurtigere reoksydasjon av oksydanten og dette er selvfølgelig uønsket.

Claims (16)

1. Analyseinnretning, karakterisert ved at den består av en kapillar av et inert materiale med en indre diameter på over 1 mm og med en eller flere reagenser adherende til den indre overflate.

2. Analyseinnretning ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r't v e d at den er laget av glass.

3. Analyseinnretning ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den indre diameter er mellom 1 og 1,5 mm.

4. Analyseinnretning ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at volumet av boringen er ca. 100 yl.

5. Analyseinnretning ifølge kravene 1 til 4, karakterisert ved at avviket for veggtykkelsen og den indre diameter ikke er mer enn 2% fra middelverdien.

6. Sett på to eller flere innretninger ifølge krav 5, karakterisert ved at den indre diameter og veggtykkelsen for hver kapillar ikke avviker mer enn 2% fra den midlere verdi for settet.

7. Pakning eller sett, karakterisert ved at den inneholder et antall kapillarer ifølge krav 6.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en analyseinnretning ifølge kravene 1-5, karakterisert ved at en egnet kapillar dyppes i et oppløsningsmiddel eller en suspen-sjon inneholdende en eller flere reagenser og hvis nødvendig et adhesiv, slik at væsken stiger opp i kapillaren under påvirkning av kapillarkreftene, hvoretter kapillaren fjernes fra væsken og oppløsningsmidlet eller suspensjonsmidlet inneholdt i kapillaren fjernes.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at oppløsningsmidlet eller suspensjonsmidlet fjernes ved lyofilisering.

10. Fremgangsmåte for gjennomføring'av en kjemisk eller mikrobiologisk bestemmelse, karakterisert ved at en væske hvortil en eller flere reagenser er tilsatt blir suget opp i et kapillar ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 inneholdende en reagens eller flere slike for substansen som skal bestemmes, hvorved virkningen av reagensen eller rea gensene i kapillaren og prøvefluidet observeres.

11. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at den inneholder en eller flere på forhånd valgte mengder av en eller flere reagenser.

12. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 eller 11, karakterisert ved at reagensen eller reagensene lett oppløses eller suspenderes av prøvefluidet.

13. Kapillar ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 eller 11, karakterisert ved at reagensen eller reagensene forblir festet til veggen, direkte eller ved hjelp av et mellomliggende sjikt.

14. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, 11 eller 12, karakterisert ved at den inneholder reagensene diklorfenolindofenol og gjærlaktatdehydrogenase.

15. Fremgangsmåte ifølgekrav 8 eller 9, karakterisert ved at væsken som suges opp i kapillaren inneholder diklorfenolindofenol og gjærlaktatdehydrogenase.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at innretningen som krevet i krav 14 benyttes for bestemmelse av laktat.