DE2653537A1 - Verfahren und mittel zur bestimmung von hydroperoxiden - Google Patents

Verfahren und mittel zur bestimmung von hydroperoxiden

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DE2653537A1 DE19762653537 DE2653537A DE2653537A1 DE 2653537 A1 DE2653537 A1 DE 2653537A1 DE 19762653537 DE19762653537 DE 19762653537 DE 2653537 A DE2653537 A DE 2653537A DE 2653537 A1 DE2653537 A1 DE 2653537A1
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Description

Merck Patent Gesellschaft 23. liovember 1976
mit beschränkter Haftung
Darmstadt
Verfahren und Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mittel zur photometrischen Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxiden reagieren, in eiv;eißhaltigen Flüssigkeiten. Die Bestimmung von Hydroperoxide^ insbesondere von Wasserstoffperoxid, spielt eine wichtige Solle in der klinischen Chemie, Viele ensymatische Substratbestimmungen werden ra'it Oxidasen durchgeführt, z.B. Cholesterin mit Cholesterinoxidase, Glucose mit Glucoaeoxiäase, Aminosäuren mit Aminosäureoxidase, Harnsäure mit Uricase usv/. Das bei diesen Reaktionen in äquimolaren Mengen entstehende Wasserstoffperoxid kann in bekannter Weise elektrochemisch oder photometrisch bestimmt werden. Dabei sind die elektrochemischen Verfahren wegen der Notwendigkeit spezieller Apparaturen und deren Anfälligkeit nachteilig. Günstiger und verbreiteter sind die photometrischen Bestimmungsmethoden.
809822/015
Eine der bekanntesten photometrischen Bestimmungsmethoden beruht auf der Oxydation bestimmter Chromogene durch Wasserstoffperoxid zu einem Farbstoff mit Hilfe eines Katalysators. Im Zusammenhang mit G-lucosebestimmungen sind als Katalysatoren Peroxidase sowie die Systeme Jodid/ Molybdat (DAS 1 284 124), Joäid/Vanadat (DOS 1 598 828), und Jodid/Wolframat (DOS 2 163 421) bekannt.
Aus Anal. Chem. 3±, 452 (1962) ist ferner eine Glucosebestimmung bekannt, bei der ohne Verwendung eines Chromogens in Gegenwart des Katalysatorsystems Jodid/Molybdat das entstehende Trijodid direkt photometrisch gemessen wird. Diese Methode hat den Vorteil, daß der hohe Extinktionskoeffizient des Irijodids (ca. 20 cm /uM) bei der spektrophotometrischen Bestimmung ausgenutzt werden kann, wodurch eine hohe Präzision erreicht wird. G-Ieichzeitig v/erden die durch farbige Begleitstoffe in der Probe verursachten Störungen niedrig gehalten. Außerdem ist die Reagenzlösung sehr stabil und kann deshalb bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Die Verwendung von cancerogenen und cocancerogenen Chromogenen kann vermieden werden.
Der entscheidende !fachteil dieser Methoden besteht darin, daß die zu untersuchende Probe der Körperflüssigkeit vorher enteiweißt werden muß, weil sonst die Färbung des Trijodids nicht beständig ist. Die zeitraubende Enteiweißung erschwert jedoch nicht nur die Bestiramungsmethode, sondern sie verhindert die Anwendung dieser an sich günstigen Methode in den Fällen völlig, in denen keine Enteiweißung möglich ist, wie z.B. bei der Oholesterinbestimmung in Körperflüssigkeiten, weil Cholesterin an Protein gebunden vorliegt.
809822/01B4
Der Erfindung lag dalier die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Mittel zur photometrischen Bestimmung von Hydroperoxiden in eiweißhaltigen Flussigkeiten auf der Basis einer Trijodidmessung zur Verfügung zu stellen, das ohne vorausgehende Enteiweißung exakte Analysenergebnisse liefert.
Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß das Katalysatorsystem in einer gegenüber den bekannten Konzentrationen um Größenordnungen niedrigeren Konzentration zusammen mit einem Stabilisator verwendet -wird.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur photoraetrischen Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter. Freisetzung von Hydroperoxiden reagieren, in eiweißhaltigen Flüssigkeiten mit Hilfe eines wasserlöslichen Jodids, eines Redoxkatalysators und eines Stabilisators, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Redoxkatalysator in einer Konzentration von 5 ~ 500 JiM. zusammen mit 5. - 100 mg/1 mindestens eines Stabilisators verwendet wird.
Ferner umfaßt der Gegenstand der Erfindung ein Mittel zur photometrischen Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxiden reagieren, in eiweißhaltigen Flüssigkeiten, bestehend aus einem wasserlöslichen O'odid, 5 - 500 uM eines Redoxkatalysators und 5 - 100 mg/1 mindestens eines Stabilisators.
809822/0 1 5
Überraschenderweise wird durch die niedrige Katalysatorkonzentration und durch den Zusatz mindestens eines Stabilisators eine stabile Färbung des Trijodids in der Probelösung auch in nicht enteiweißten Körperflüssigkeiten erreicht. Dieser Effekt tritt erstaunlicherweise nur dann ein, wenn sowohl der Katalysator als auch der Stabilisator im angegebenen Konzentrationsbereich kombiniert verwendet werden.
Als Redoxkatalysator werden nach der Erfindung die Fatrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze von Molybdänsäure, Wolframsäure oder Vanadinsäure verwendet, vorzugsweise Ammoniummolybdat. Die Konzentrationen liegen im Bereich von 5 - 500 uM, wobei Ammoniummolybdat vorzugsweise in
einem Eonzentrationsbereich von 5~5O pM verwendet wird, insbesondere in einer Konzentration von 10 uM. Die bevorzugten Bereiche bei Verwendung γοη Hatriumwolframat liegen bei 50 - 200 \M und von !Tatriuravanadat bei 50 - 500 pH. Im Falle des bevorzugten Ammoniummolybdats z.B. ist die Konzentration gegenüber dem Stand der !Technik (1-10 mM) um Größenordnungen niedriger.
Geeignete Stabilisatoren nach der Erfindung sind Hatriumazid, Hexamethylentetramin, Kaliurafluorid, Kaliumthiocyanat, Ä'thylendiamintetraesaigsäure und/oder Nitrilotriessigsäure, vorzugsweise Natriuraazid . J3s kann entweder einer der genannten Stabilisatoren oder auch eine Mischung mehrerer Stabilisatoren eingesetzt werden. Die Konzentration sollte im Bereich von 5 bis 100 mg/1 liegen. Die bevorzugte Konzentration beträgt etwa 10 mg/1.
Als wasserlösliches Jodid wird vorzugsweise Natrium-, Kalium- oder Ammonium jodid verwendet. Kai iuta jodid ist besonders gut geeignet, weil es nicht hygroskopisch ist.
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r-
Utn die enzymatischen Reaktionen in einem optimalen pH-Bereich ablaufen zu lassen, enthält das Mittel auch Puffersubstanzen, die einen pH-Bereich von 6,0 - 7,5 aufrechterhalten können. Als Puffer kommen die gebräuchlichen, wie z.B. Phosphat-, Citrat-, Borat- oder Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer infrage.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, von Substanzen, die unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren, sowie von peroxidatisch wirksamen Substanzen in eiweißhaltigen Flüssigkeiten. Es ist insbesondere in den Fällen geeignet, in denen eine vorausgehende Enteiweißung der zu untersuchenden Flüssigkeit nicht möglich ist, weil die nachzuweisende Substanz z.B. an Eiweiß gebunden vorliegt. Ein wichtiges Beispiel für ein^-s^u-fihe^Sub^__ stanz ist das Cholesterin im Blut oder Serum.
Bei der enzymatischen Cholesterinbestimmung muß das Cholesterin und seine Ester aus den Lipoproteinen freigesetzt werden. Das kann z.B. durch eine Protease erfolgen oder durch Behandlung mit bestimmten Detergentien, durch Gallensäuren oder durch Detergentien zusammen mit Gallensäuren. Um das freigesetzte Cholesterin und seine Ester in Lösung zu halten, ist ebenfall ein Detergens notwendig. Für die erfindungsgemäße Cholesterinbestiraraung hat si'ch zu diesem Zweck eine Detergent ienkoTflbination aus Polyäthylenglycol-mono-(1.1.3.3.-tetramethylbutyl)-phenyläther und Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid als besonders günstig erwiesen. Diese Detergentienkombination hat den Vorteil, daß sie im Vergleich zu anderen in diesem Zusammenhang bekannten Detergentien den Reagenzienleerwert praktisch nicht erhöht und daß ein Cholesterinoxidase hemmender Gallensäurezusatz vermieden werden kann. Außerdem findet die
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Zersetzung der Lipoproteine "bei Verwendung von Alkyldimethylbenzylamraoniumchlorid bereits bei Raumtemperatur statt, während bei den zu diesem Zweck bekannten Detergentien höhere Temperaturen notwendig sind.
Im Rahmen, der bevorzugten Reagenzienkombination besteht ein besonders geeignetes Mittel zur Cholesterinbestimmung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aus einer Puffer-Farbreagenz-Lösung und einer Enzymlösung:
Puf f e r-ga^rb re a ge nz-Lo s ung
10 - 30 g/l Kaliumiodid,
5-50 uM Amraoniummolybdat,
5-15 mg/1 Matriumazid,
2 g/l Polyäthylenglycol-mono-(1.1.3.3-tetramethylbutyl)-phenylather, 0,1 g/l Alkyldimethylbenzylammoniumehlorid, 0,1-0,5 M . Puffer pH 6,2.
Enzymlösung
0,2 - 0,6 U/ml Cholesterinesterase, 0,3 - 1,0 IT/ml Cholesterinoxidase.
Zur Durchführung des erfindungsgefi]äi3en Verfahrens wird eine Seruraprobe mit der Pufxer-Farbreagenzlösung gemischt und ein abgemessener Teil der Enzymlösung zugegeben. Fach einer Inkubationszeit von etwa 15 bis 45 Minuten bei einer geeigneten Temperatur wird die Extinktion der Probe gegen den Leerwert bei 366 nm gemessen.
B09822/015A
Die Snzymlösung besteht im Ealle einer Glucosebestimtnung aus Glucoseoxidase, im Ealle einer Aminosäurebestimtnung aus Aminosäureoxidase, im Ealle einer Harnsäurebestiramung aus TJricase usw.
Beispiel 1
Bestimmung von Wasserstoffperoxid in einer eiweißhaltigen •Lösung
Puffer-Ear-breagenz-Lösung:
Kaliumiodid,
2,0 g/l Polyäthylenglycol-mono-Ö.1.3.3-tetramethyl~
butyl)-phenyläther,
Alkyldiraethylbenzylammoniumchloriä, Ammoniuramolybdat,
mg/1 Fatriumazid, .
0,2 M Kaliuraphosphatpuffer pH 6,2.
5 ml der Puffer-Earbreagenz-Lösung werden mit 20 μΐ wasserstoffperoxidhaltigera Serum gemischt, 20 bzv/. 40 Minuten lang bei 3O0O inkubiert und anschließend bei 366 nm die .Extinktion gemessen, Ss werden 100 °fi der eingesetzten Wasserstoffperoxideenge wiedergefunden.
Das Verfahren wird mit verschiedenen Amiaoniummolybdatkonzentrationen und Kombinationen von Aramoniuramolybdat und Fatriumazid wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt als Wiederfindung der eingesetzten Wasserstoffperoxidmengein Prozent, zeigt die nachstehende Tabelle.
20 g/l
2,0 g/l
0,1 g/l
10 uM
10 mg/
0,2 M
809822/0164
Sr·. AO
7ersuch Ammoniuramolyb-
dat [μΜ]		 JTatriumazid
[ tag/1 ]		 ¥iederfindu-
[ * ]
nach 20 Min		 ng
nach 40 Min
1 1000 1000 0 0
2 - - 83 86
3 1000 - 89 88
4 10 - 96 95
5 10 10 100 100
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß unter den angewandten Bedingungen nur die erfindungsgeraäß verwendete Kombination eine ausreichend schnelle Reaktion und eine stabile Färbung gewährleistet und deswegen für eine quantitative Bestimmung geeignet ist.
Analoge Ergebnisse v/erden erhalten, wenn man anstelle von 10 μΜ Ammoniuramolybdat z.B. 100 uM Natriumwolfraraat oder 200 μΜ Uatriuravanadat einsetzt, sowie beira Austausch von Batriumazid durch Hexamethylentetramin, Kaliurafluorid, Kaliumthiocyanat, Äthylendiamintetraessigsäure und/oder Nitrilotriessigsäure«
Beispiel 2
Bestimmung von Cholesterin im Serum
Die Puffer-I'arbreagenz-Lösung ist die gleiche wie im Beispiel 1 beschrieben. Die Ensym-Lösung besteht aus 0,4 IT/ml Cholesterinesterose und 0,6 U/ral Cholesterinoxidase.
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5 ml der Puffer-Farbreagenz-Lösung werden mit 20 μί. Seruia einer bekannten Cholesterinkonzentration gemischt. 50 ul der Enzym-Lösung werden zu 1 ml dieser Mischung plpettiert, gemischt und 20 "bzw. 40 Minuten bei 300C inkubiert. Anschließend wird die Extinktion der Probe gegen einen Leerwert bei 366 nm gemessen. Es werden 100 ^ der eingesetzten Cholesterinmenge wiedergefunden.
Der Cholesteringehalt des Serums wird wie folgt berechnet:
10 Cholesteringehalt [mg/100 ml] =
440
Der Kalibrierungsfaktor wird primären Standard ermittelt.
durch Messungen mit einem
Analog Beispiel 1 wird das Verfahren mit verschiedenen Konzentrationen von Ammoniummolybdat und Mischungen mit ITatriumazid wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt als Wiederfindung der eingesetzten Cholesterin menge in Prozent, zeigt die nachstehende Tabelle.
V.ersuch Ammoniummolybdat
[ uM ]		 Natri-umazid
Lmg/1 ]		 Wiederfi
20 min		 ndung
40 min
1 1000 1000 0 0
2 - - 91 98
3 1000 — 92 90
4 · 10 - 93 91
5 10 10 100 100
809822/01S
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß unter den angewandten Bedingungen nur die erfindungsgemäß verwendete Kombination eine ausreichend schnelle Reaktion und eine stabile Färbung gewährleistet und deswegen für eine quantitative Cholesterinbestiimiiung geeignet ist.
Analoge Ergebnisse werden bei der Glueosebestinnnung mit Glucoseoxidase, der Aminosäurebestimmung mit Aminosäureoxidase und der Harnsäurebestimmung mit Uricase erhalten.
809822/0154

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    1. Verfahren zur photometrischen Bestimmung von Hydroperoxideh "bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxiden reagieren, in eiweißhaltigen Plüsssigkeiten mit Hilfe eines wasserlöslichen Jodids, eines Redoxkatalysators und eines Stabilisators, dadurch gekennzeichnet, daß der Redoxkata-
    .; lysator in einer Konzentration von 5 - 500 uM zusammen mit 5 - 100 rag/1 mindestens eines Stabilisators verwendet wirdi
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Redoxkatalysator Molybdat, Yfolframat oder Yanadat verwendet wird.
    3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Redoxkatalysator Ammoniutamolyhdat in einer Konzentration von 5 ·- 50 uM verwendet wird. - .
    4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 "ois 3> dadurch gekennzeichnet, daß als Stabilisator Hatriuinazid, Hexainethylentetramin, Kaliumfluorid, Kaliurathiocyanat, Ithylendiamintetraessigsäure und/oder liitrilotriessigsäure verwendet wird.
    5. Verfahren aur photoraetrischen Bestimmung von aus Cholesterin mit Cholesterinoxidase freigesetztem l'/asserstoffperoxid in eiweißhaltigen Flüssigkeiten mit Hilfe eines wasserlb'slichen Jodids, eines Redoxkatalysatora und eines Stabilisators, dadurch gekennzeichnet, daß der Redoxkataiysator in einer Konzentration von 5 - 500 jaM zusammen mit 5 -100 mg/1 mindestens eineB Stabilisators verwendet vv .Lx1U.
    8.09 822/01 B-4 original inspected
    6. Verfahren nach. Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in Gegenwart von Polyäthylenglycol-mono-(1.1.3.3.-tetratne thy lbutyl)-pheny lather und Alkyldimethylbenzylafflraoniumchlorid durchgeführt wird.
    7. Mittel zur photoraetrischen Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxiden reagieren, in eiweißhaltigen Flüssigkeiten, enthaltend ein wasserlösliches Jodid, 5 - 500 μΐί eines Redoxlcatalysators und 5-100 mg/1 mindestens eines Stabilisators.
    8. Mittel nach Anspruch 7, enthaltend Kaliumiodid, 5-50 pM. Ammoniuimnolybdat und 10 mg/l ITatriuraazid.
    809822/0154
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