DE3238339A1 - Chromogenes mittel zur kolorimetrischen bestimmung von peroxiden - Google Patents
Chromogenes mittel zur kolorimetrischen bestimmung von peroxidenInfo
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Description
Chromogenes Mittel zur kolorimetrischen Bestimmung
von Peroxiden
Die Erfindung betrifft ein System von Reagentien, das die Durchführung eines Verfahrens zur Bestimmung
von Peroxiden ermöglicht, gegebenenfalls auch solchen die gebildet worden sind 5 durch enzymatische und/oder chemische Reaktionen.
Es ist bekannt, daß bei zahlreichen Reaktionen Enzyme dazu beitragen eine höhere Reaktionsgeschwindigkeit
zu erreichen und in einigen Fällen
10 möglicherweise eine genauere Steuerung der Reaktion
zu erzielen: Viele der enzymatisehen Reaktionen
umfassen eine Wechselwirkung zwischen dem
Substrat und Sauerstoff, wobei eines der Produkte Wasserstoffperoxid ist, dessen Menge proportional
15 ist zu der Menge der Ausgangsverbindungen.
Andererseits gibt es einen weiten Bereich von Reaktionen, die ausschließlich chemische Reaktionen
sind und die beim Fortschreiten im Laufe der Zeit
/2
BAD ORIGINAL
als Endprodukte Peroxide ergeben deren Menge wiederum proportional ist",- der Menge an eingesetztem
Ausgangsmaterial.
Außerdem ist es ebenfalls bekannt, daß Wasserstoffperoxid
und allgemein alle Peroxide als Substrate angewandt.werden können um
eine Reaktion durchzuführen, die mit Hilfe spezieller Enzyme abläuft wie Peroxidase (POD)
und Katalase.
Derartige Enzyme katalysieren die Oxidation von ' entsprechenden Substanzen auf Kosten des Peroxids,
das reduziert wird (im speziellen Falle von Wasserstoffperoxid
führt die Reaktion zur Bildung von Wasser)»die Menge an oxidierter Substanz,
die gebildet wird ist wieder proportional zu der Menge an Peroxid, das(.zu Beginn der Reaktion)vorhanden
ist und damit der Menge an Ausgangssubstrat, das an der ersten Reaktion zur Bildung des Peroxids
teilnimmt.
Es sind verschiedene Reagentien zur kolorimetrischen
Bestimmung von Vasserstofperoxid bekannt, entsprechend
dem folgenden allgemeinen Schema
(POD)
Reduzierter Akzeptor + H2Og ■—^ Oxidierter
farblos Akzeptor + HO
gefärbt 30
Als reduzierter Akzeptor wurden verschiedene Substanzen angewandt, wie zum Beispiel o-Dianisidin,
o-ToüuidJn, o-Phenylendiamin, Guajak-HarZjAdrenalin,
Phenolphtalein, ABTS (Ammonium-salz von 2,2'-Azinodi-(3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonsäure),
Ferrocyanid und andere.
/3
O O Ο O
-X-H
1937 bis 1943 zeigten Eisenstaedt (und später
Emerson), daß es möglich ist, daß 4-Amino-antipyrin in Gegenwart von zahlreichen aromatischen
Verbindungen oder heterocyclischen Verbindungen gefärbte Reaktionsprodukte ergibt durch Einwirkung
von oxidierenden Substanzen wie zum Beispiel dem Perrozyanid.
Diese Daten wurden später von Trinder erneut untersucht, der ein kolorimetrisches Verfahren
zur Bestimmung von Glucose in biologischen Flüssigkeiten entwickelte, entsprechend der folgenden
Gleichung
Glucose + HpO + Op ^ Gluconsäure + HpOp
Glucose-oxidase
H9O0 + 4-Aminoantipyrin + Phenol ^ Chinon + HpO
(P0Cr>
(gefärbt)
Zu den aromatischen .Verbindungen, die imstande sind<
mit 4-Aminoantipyrin in Gegenwart von Oxidationsmitteln zu kondensieren, hat Eisenstaedt im Jahre
1938 auch die aromatischen Amine gezählt. Aufgrund dieser Angaben haben verschiedene Autoren eine Reihe
von chromogenen Systemen entwickelt, bei denen zusammen mit 4-Aminoantipyrin aromatische Amine verwendet
werden, die am Stickstoff substituiert sind (N,N-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin) sowie Amine,
die am Ring substituiert sind, wie N,N-Diethyltoluidin, N-Ethyl-N-e'thylacetarnid-m-toluidin.
Es hat sich nun erfindungsgemäß gezeigt, daß eine Anzahl von aromatischen Aminosäuren im Stande ist
mit 4-Aminoantipyrin oder ähnlichen Verbindungen in Gegenwart von oxidierenden Substanzen eine
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'-χ- S '. ■■■■ '-"■
Kondensations -Reaktion einzugehen unter Bildung von gefärbten Verbindungen.
Solche Verbindungen führen als Ersatz für die
oben erwähnten Amine zu zahlreichen Vorteilen, nämlich;
1. Das erhaltene gefärbte Kondensationsprodukt besitzt einen molaren Extinktionskoeffizienten,
der höher ist als derjenige der gefärbten Produkte, die erhalten werden mit den entsprechenden
aromatischen Aminen.
2. Die erwähnten aromatischen Aminosäuren sind Feststoffe, so daß sie in festen Gemischen
enthalten sein können im Unterschied zu den entsprechenden aromatischen Aminen, die flüssig
s ind.
3. Die aromatischen Aminosäuren sind nicht toxisch im Gegensatz zu den entsprechenden aromatischen
Aminen.
Die DE-OS 27 44 812 betrifft ein bestimmtes chromogenes·
Mittel, das wiederum geeignet ist zur Be-Stimmung von Peroxiden und das besteht aus 4-Aminoantipyrin
(oder einer analogen Verbindung) und einem Bestandteil, der im Molekül mindestens einen
aromatischen Ring enthält mit mindestens einer phenolischen OH-Gruppe.
Bei der Bestimmung, des Wasserstoffperoxids, das in
biologischen Flüssigkeiten enzymatisch, freigesetzt wird, ist es mit Hilfe dieses Mittels möglich,
zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. In vielen Fällen ist es jedoch wichtig ein empfind-
/5 ■
O L O O O O
3 ichcres Chromogen zu haben um das Wasserstoffperoxid
zu bestimmen, das enzymatisch durch Substanzen und Metaboliten freigesetzt wird, die in sehr geringen
Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten enthalten sind. Wenn es möglich istj ein chromogenes System zugänglich
zu machen, das in einigen der oben erv/ähn-"ten
Fälle ungefähr k mal empfindlicher lsi als ein solches .bei dem 'Ί-Aminoantipyrin und Phenol oder
p-Hydroxybenzoat verwendet v/erden, wäre es möglich kleine Mengen biologische Flüssigkeiten anzuwenden
(während die Bestimmung der betreffenden Substanz ausreichend genau und zuverlässig bleibt) mit dem
weiteren Vorteil, daß in dem Reaktionsgemisch die Konzentration an möglicherweise störenden Substanzen
verringert λ-zird die gleichzeitig in der zu untersuchenden
Probe vorhanden sein können.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein neues chromogenes Mittel zu entwickeln, das geeignet ist zur
Bestimmung von Peroxiden, insbesondere geeignet zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, das enzymatisch
aus Substraten freigesetzt wird, die in biologischen Flüssigkeiten enthalten sind. Dieses Mittel
besteht aus einer Verbindung mit mindestens einer reaktionsfähigen Gruppe die an eine von 1-Phenyl-5-pyrazolinon
abgeleitete Struktur gebunden ist, sowie einer aromatischen Aminosäure der Formel
R
■ COOX
in der R und R- gleich oder verschieden sind
und jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Kohlenwasserstoffrest,
vorzugsweise eine Alkylgruppe, insbesondere eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlen-
/6
-Sr- \
stoff atomen: bedeuten, und X ein Yfasserstoffatom
oder ein einwertiges Kation ist.
Von diesen zuletzt genannten Verbindungen haben sich als besonders interessant erwiesen, die
o- oder m-Aminobenzoesäuren und die N-Alkyl-rrsaiTiino-benzoesäurederivate,
sowie die N,N-Dialkyl-m-aminobenzoesäurederiv^te,
insbesondere die m-substituierten Derivate. Von diesen zuletzt
genannten Verbindungen zeigen die deutlichste Wirkung Säuren, die am Stickstoffatom vollständig
substituiert sind.
Zu den wichtigsten Verbindungen, die in dem erfindungsgemäßen
System anstelle von ^i-Aminoantipyrin verwendet
v/erden können, gehören Aminophenazone(= 4-Diethyiamino--2,3»-dimethy1-1-phenyl-3-pyrazolin-5-on);
oulphamipyriniixTatrium- 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon-4-aminomethansulfonat);
Ώ^υρ>'Γεη6".(Ν3ΪΓίυΐΐι-(1-ρη6η37·1-2,3-dimethyl-5-pyrazolon-4-yl)-isobutylaminomethansulfonat);
Propylphenazon: (4-Isopropyl-2,3-diinethy 1-1 -phenyl-3-pyrazolin-3-on);
Thozalinon;(2-Dimethylamino-5-phenyl-2-oxazolin-4-on);
Thozalinon;(2-Dimethylamino-5-phenyl-2-oxazolin-4-on);
Methampyron:(Natrium-1-phenyl-2,3-dimethyl-5-pyrazoion-4-methylaminomethan-sulfonat).
In dem folgenden allgemeinen Reaktionsschema ist die
Oxidationsreaktion der hier beschriebenen Chromogene angegeben, bei denen Wasserstoffperoxid
in Gegenwart von Peroxidase als Oxidationsmittel für das Chromogen angewandt wird, obwohl auch andere
Peroxide und entsprechende Oxidationsmittel für die
/7
erfindungsgemäßen Zwecke geeignet sind.
COOX
5 Ύυ°*
H3C NH2
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele
näher erläutert.
Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Peroxiden.
Das Prinzip der Reaktion ist folgendes: Eine Lösung, die Peroxide in entsprechenden Konzentrationen enthält,
wird mit einer gepufferten Lösung vermischt, die eines der oben beschriebenen chromogenen Mittel
und Peroxidasen enthält.
Bei vollständiger Farbentwicklung wird die Farbe photometrisch bei einer entsprechenden Wellenlänge
gemessen. Die entwickelte Farbe ist proportional der Konzentration an Peroxiden. Das Reagens kann
folgendermaßen zusammengesetzt sein:
Pulverförmiges Reagens enthaltend:
a) ein Puffersystem, das bestehen kann aus Phospha-
/8
ten, TRIS, Aminopropandiolacetat anderen Derivaten oder äquivalenten Verbindungen.
b) antiseptische und Antischimmelmittel,
c) ein chromogenes System, bestehend aus 4-Aminoantipyrin
oder ähnlichem und einer aromatischen Aminosäure
d) Peroxidase
Beispiel 2
10
10
Manuelle oder automatische Bestimmung von Harnsäure mit Endablesung
Das Prinzip der Bestimmung ist folgendes: Die zu untersuchende Probe wird manuell oder automatisch
mit dem Reagens vermischt, das Enzyme (Uricase und Peroxidase) und das chromogene Mittel in einer
gepufferten Lösung enthält. Nachdem die Harnsäure durch das Enzym oxidiert ist, und sich die durch die Reaktion
auftretende Farbe entwickelt hat, wird die photometrische Ablesung entweder manuell (visuell) oder automatisch
bei einer entsprechenden Wellenlänge vorgenommen.
Die entstandene Farbe ist proportional der Menge an Harnsäure in der Probe.
Bei diesem Reaktionsschema kann ein Reagens folgendermaßen zusammengesetzt sein;
In einem einheitlichen Gemisch sind alle Substanzen enthalten, die notwendig sind für die enzymatische
und chromogene Reaktion,oder die Enzyme Uricase und POD» der Puffer (Phosphat, TRIS, Acetat, Aminopropandiol
oder Derivate davon usw.), die aromatisehe Aminosäure und das 4-rAminoantipyrin (oder eine
ähnliche Verbindung), antibaüerielle Mittel, Tenside und Verbindungen, die mögliche Störungen verhindern.
/9
--9T- AO
Manuelle Bestimmung von Harnsäure in menschlichem Blutserum
Die Konzentrationen in einem gebrauchsfertigen Reaktionssystem waren:
100 mM Phosphatpuffer pH 7,4; 0,05 mM 4-Aminoantipyrin;
1 mM Ν,Ν-Dimethyl-rn-aminobenzoesäure;
2000 Einheiten/ljPeroxidase, 50 Einheiten/l Uricase.
Ergebnisse: Linearität:
Der Zusammenhang zwischen (der Extinktion) A bei 550 nm und der Konzentration an Harnsäure war bis
zu 20 mg/dl Harnsäure in der Probe linear.
Vergleich:
Ein Vergleich mit dem Verfahren nach Fossa ti, P,, Prencipe, L. (Quad. Sclavo Diagn. 14.2.1978) ergab
die folgenden Ergebnisse:
(y = Fossati-Verfahren) y = 1,001 χ - 0,036 mg/dl r =
25' 0,985.
Genauigkeit innerhalb einer Reihe:
20 Versuche, Mittel 4,6 mg/dl SD 0,08 mg/dl C.V.% =
1,84.
Genauigkeit zwischen (verschiedenen) Reihen:
20 Versuche, Mittel 4,7 mg/dl S.D. 0,12 mg/dl C.V.%
2,84.
6238
Claims (2)
1.) Chromo genes Mittel zur kolorimetrischen
Bestimmung von Peroxiden, umfassend eine Verbindung mit mindestens einer reaktionsfähigen
Gruppe, die an eine Struktur gebunden ist, die abgeleitet ist von 1-Phenyl-5-pyrazolinon und
eine aromatische Verbindung, dadurch g e kenn ze i chnet , daß die aromatische
Verbindung eine aromatische Aminosäure ist der Formel
R-N-R.
in der R und R> gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder
einen Kohelnwasserstoffrest bedeuten und X
ein Wasserstoffatom oder ein einwertiges
Kation ist.
20
2. Chromogenes Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die von 1-Phenyl-5-pyrazolinon abgeleitete
Verbindung 4-Aminoantipyrin ist.
6238
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| IT24634/81A IT1168043B (it) | 1981-10-22 | 1981-10-22 | Cromogeno per la determinazione colorimetrica dei perossidi e metodo impiegante lo stesso |
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- 1982-10-22 ES ES517130A patent/ES517130A0/es active Granted
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| ES517130A0 (es) | 1983-12-01 |
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