DE1498901A1 - Diagnostisches Mittel und Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Harnsaeure im Blut - Google Patents
Diagnostisches Mittel und Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Harnsaeure im BlutInfo
- Publication number
- DE1498901A1 DE1498901A1 DE19641498901 DE1498901A DE1498901A1 DE 1498901 A1 DE1498901 A1 DE 1498901A1 DE 19641498901 DE19641498901 DE 19641498901 DE 1498901 A DE1498901 A DE 1498901A DE 1498901 A1 DE1498901 A1 DE 1498901A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- hydrogen peroxide
- uric acid
- blood
- detection
- value
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/62—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving uric acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
- C12Q2326/10—Benzidines
- C12Q2326/14—Ortho-Tolidine, i.e. 3,3'-dimethyl-(1,1'-biphenyl-4,4'-diamine)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Dr. W. Kühl
Telegramm-Adresset Döllnerpatent
Telefon: 346131
Miles
Beschreibimg
Ine-.
2OOO Hamburg 36, den
Esplanade 36 β
11. Juni 1964
H98901
1127 Mjn-tlo Street; SJ.kfeay?■*;» Indiana,'T.St.A.
gnostisches Mittel, und ¥®rfahren sum Nachweis
.?.'.??: Bestisitsung· von Harneäui's iai Blut.
l?ür disBö ΑΏ33©1άυΒ}5 wird dio !^"".os'itä-l; vom ",?, Juni 1963 aus
der XISA-PateBtatjiaeidavig Serial Ιο. 288 4-98 in Anspruoh genoia··
Die Erfindung betrifft ein verbessertes diagnostisches
Mittel und Verfahren zum Nachweis von Harnsäure. Insbesondere beeieht eich die Erfindung auf einen diagnostischen Test zur
quantitativen BeBtianung von Harnsäure in Blut.
Harnsäure oder 2,6,8-Trioxypurin besitet die Strukturfor-■•1
9 09835/0/4 9B
BAD ORIGINAL
BAD ORIGINAL
OH
X.
—OH
und ist ein Endprodukt des Stickstoffumsatzes im menschlichen Körper, Die Kerne aller Zellen sind reich an Nucleinsäuren,
die in Form von Nucleoproteinen an Proteine gebunden sind. Nucleinsäuren hydrolysieren leicht zu den sogenannten Nucleotiden, die Kombinationen von Purin- oder Pyrimidinbaeen Bit Phos
phorsäure und einer Pentose, nämlich d-Ribose, sind. Im Körper vorhandene Enzyme bauen ständig Nucleoproteine ab und setzen
die Purin- und PyrimJ.dinverbindungen in Freiheit, die dann wei
ter umgesetzt werden können. Die hauptsächlichen Purine sind
Adenin und Guanin. Die hauptsächlichen Pyrimidine sind Thymin, Cytosin und Uracil.
Mit der Nahrung ssugsführte Nucleoproteine werden bei der
Verdauung zu diesen und anderen Purin- und Pyrimidinbasen abgebaut.
Beim Stoffwechsel erleiden die Purinbasen eine Deaminie-
rung und-teilweise Oxydation zu Harnsäure<, Beim Menschen ist
die Harnsäure daa Bndprodukt dea Nueleoproteinstofiweohsels und
wird im Harn ausgeschieden, bei den meisten Säugetieren wird die Harnsäure jedoch weiter au Allantoin oxydiert.
Die Zuführung von purizihaitiger Nahrung hat normalerweise
- 2 -909835/04 9
BAD ORIGINAL
Iceinen Einfluss auf den Harnsäurespiegel im Blut, ausgenommen
bei unzulänglicher Punktion der Nieren, in welchem Palle der
ilamsäuregehalt des Blutes ansteigt. Bei gewissen anderen
pathologischen Zuständen» die nicht Kit der Aufnahme purinhaltiger nahrung in Zusammenhang stehen, z*Bo bei TJrämie, Leukämie»
Lungenentzündung und Gicht, findet eine anormale Erhöhung des
Harnsäurespiegele im Blut statt. Man weiss z.B., dass der HarnslLuregehalt
des Bltites unter Bedingungen ansteigt, die mit dem
übermässigen Abbau der Kerne der weissen Blutkörperchen in Zusammenhang
stehen, a.Bo bei Leukämie und Lungenentzündung«
In der medizinischen Wissenschaft ist der Wert von Analysenmethoden
zur Bestimmung von Harnsäure im Blut als Mittel zur Diagnose derartiger Krankheiten und unter Umständen zur Unterscheidung
zwischen den eng miteinander verwandten anormalen Zuständen, Z0B. Gicht und Arthritis, seit langem anerkannt.
Gicht kennzeichnet sich durch einen anormalen Anstieg des Harnsäurespiegels
im Blut, während bei Arthritis ein derartiger Anstieg des Harnsäuregehaltes nicht stattfindet. Ee besteht daher
ein beträchtliches Bedürfnis nach einem einfachen und wirtschaftlichen Test zur genauen quantitativen Bestimmung des
Harnsäuregehaltes flee Blutes.
Normalerweise kommt Harnsäure im Blut in wechselnden geringen
Mengen sswischen etwa 0,-7 und 3$7 mg/100 ml vor. Bei den
oben genannten anormalen Zuständen erreicht der Harnsäurespiegel im Blut oft Werte von 27 ag/100 ml oder mehr.
Es sind bereits verschiedene Methoden sur Bestimmung oder
909835/0498
Sehätzung der Harasäurekonzentration im Blut bekannt. Zu ihnen
gehören die sehr häufig angewandten Methoden der kolorimetrischen Bestimmung an Blutfiltraten. Einige dieser Verfahren beruhen
auf der Ausfällung der Harnsäure aus dem Blutfiltrat,
z.B. als Silbersalz, in welchem Falle die Harnsäure kolorimetrisch durch Umsetzung mit Phosphorwolframsäure oder mit Arsenwolframsäure
bestimmt wird. Andere bekannte Methoden unter Verwendung von Blutfiltraten beruhen auf der direkten Behandlung
des filtrates mit Wolframsäure in Gegenwart einer Oyanid-Harnstofflöeung
und Ablesung der dabei entwickelten Farbe an einem Photometer.
In neuerer Zeit ist eine Methode bekannt geworden, die auf der enzymatisehen Umwandlung der in der Blutprobe enthaltenen
Harnsäure in Allantoin beruht. Biese Umsetzung wird in einem Spektrophotometer durchgeführt, mit dessen Hilfe das Verschwinden
des Harnsäurespektrums bei der Umwandlung zu Allantoin
festgestellt wird. Dieses Verfahren, das genauere Bestimmungen ermöglicht als die anderen bekannten Methoden, erfordert
jedoch weitgehend geschulte Arbeitskräfte und viel Zeit,
Die bekannten Methoden zur Bestimmung von Harnsäure im Blut
leiden an einem oder mehreren der folgenden Nachteile: sie erfordern
besonders auegebildete Arbeitskräfte j ihre Durchführung
erfordert viel Zeit; sie liefern keine zuverlässigen genauen Ergebnisse, und si?? müssen innerhalb äusserst enger Zeitgrenzen
durchgeführt werden. Ferner beruhen die bekannten Methoden entweder auf dem Nachweis der Harnsäure als solcher oder auf
der Geschwindigkeit ihrer Umwandlung in andere Stoffe.
- 4 -909835/0498
5 H98901
La wurde nun eine einfache, praktische und wirtschaftliche
diagnoatische kolorimetrisehe Methode zum Nachweis und zur genauen
quantitativen Bestimmung von Harnsäure im Blut gefunden. Diese Methode beruht nicht auf dem unmittelbaren Nachweis der
Larnsäure und auch *doht auf der G-eschwindlgkeit ihres Verachwindens
bei einer Umwandlungsreaktion und kann im Laboratorium von ungeschälten Arbeitskräften durchgeführt werden. Die
iiethode bietet die Vorteile einer äusserst raschen Farbentwicklung
und der Beständigkeit des maximalen Farbwertes über einen längeren Zeitraum hinweg»
Die Erfindung beruht auf der Feststellung, dass die Menge des bei der enzymatischen Umwandlung von Harnsäure in Allantoin
erzeugten Wasserstoffperoxyds direkt proportional der Menge der
im Blut enthaltenen Harnsäure ist. Das erzeugte Wasserstoffperoxyd
kann dann an einer Farbänderung gemessen werden, die bei der Oxydation einer farbbildenden Substanz in Gegenwart eines
Stoffes mit peroxydierender Aktivität stattfindet. Es wird angenommen,
dass sich hierbei die folgenden allgemeinen Reaktionen abspielen:
Harnsäure + O2 + 2 H2O
Allantoin + H2O2 + CO2
Stoff mit H2O2 + fortbildende SuDetana ,.
Farbänderung
Bisher war es nicht möglich, dia Menge des bei der Umwandlungsreaktion
erzeugten Wasserstoffperoxyds genau zu messen,
weil das Blutserum Enzyme, ZoB. KataXase» enthält, die das Wae-
- 5- 909835/049»
U9-8901
serstoffperoxyd serstören, sobald es sich bildet. Diese Schwierigkeit
wird durch die Erfindung beseitigt.
Im weitesten Sinne umfasst die Erfindung ein System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxyd aus Harnsäure und ein System
zur Bestimmung der Menge des so eriseugten Wasserstoffperoxyde.
Das System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxyd besteht
aus dem Harxisäureensyin Urat-Oxydase, vrelches auch als Uricase
bezeichnet wird, einem die Wirkung der Katalase hemmenden Stoff (Katalase-Inhibitor) und einem Puffer» der den pH-Wert auf dem
günstigsten Wert hält, bei dem die Urat-Oxydase die in der zu
untersuchenden Blutserumprobe enthaltene Harnsäure unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxyd in Allantoin umwandelt.
Das System zum Naehweis von Wasserstoffperoxyd kann aus
einem Farbindikator oder !Farbbildner? dessen Farbe durch Wasserstoff
peroxyd beeinflusst wird, einem Stoff mit peroxydierender Aktivität und einem Puffer bestehen, der einen pH-Bereich
ergibt, bei dem der Stoff mit peroxydierender Aktivität die
Oxydation des -Farbindikators durch daa Wasserstoffperoxyd unter
Urzeugung einer beobachtbaren Farbänderung katalysiert. Gegebenenfalls können auch andere Systeme zum Nachweis von Wasserstoff
peroxyd verwendet werden.
Um Harnsäure im Blut gemäss der Erfindung nachzuweisen,
wird diese Harnsäure zunächst unter Verwendung des Wasserstoffperoxyd
erzeugenden Systems in Allantoin tibergeführt. Dann wird
das System zum Nachweis des Wasserstoffperoxyds verwendet, um
die Menge des bei der Umwandlung der Harnsäure in Allantoin gebildeten
Waeserstoffparoxyds zu bestimmen. Die von dem Farb-
- 6 909835/0498
H98901
indikator in dem System zum Nachweis des Wasserstoffperoxyde
entwickelte Farbe wird dann mit einer geeichten Farbtafel oder
mit Normalfarbmustern verglichen, um die in der ursprünglichen Probe enthaltene Harnsäuremenge zu bestimmen.
Im allgemeinen soll die Reaktion zur Erzeugung des Wasserstoffperoxyds
innerhalb 5 Minuten oder weniger vollständig verlaufen)
um den Test in der vorteilhaftesten Weise ausführen zu
können und die Dissoziation des Enzyms, die mit der Zeit ansteigt,
auf ein Minimum zu beschränken* Zu diesem Zweck kann
die Konzentration der TJrat-Oxydase so eingestellt werden, dass
die höchste zu erwartende Harnsäurekonzentration im Blutserum innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 5 Minuten
quantitativ in Allantoin übergeführt wird.
Das Enzym Ürat-Oxydase kann aus der leber oder den Nieren
aller Tiere gewonnen werden, die imstande sind, Harnsäure in Allantoin umzuwandeln, z.B. aus Leber oder Nieren von Schweinen
oder Sindern.
Da diesee Enzym innerhalb dee oben angegebenen Zeitraumes
seine maximale Aktivität im pH-Bereich von etwa 9,0 bis 9,2 entfaltet, ist es zweckmässig, zusammen mit der Urat-Oxydaae
einen Puffer ansuwenden, der das Gemisch in diesem pH-Bereich hält. In diesem Sinne verwendbare Puffer sind z.B» Bor at puff er,
Glycin und £ris-(hydroxymethyl)-aminomethan. Die Konzentration
des Puffers ist nicht besonders ausschlaggebend. Torzugsweise
verwendet man aber verhältnismässig verdünnte Pufferlösungen? Konzentrationen von 0,1 Mol/l sind empfehlenswert«
- 7 - ' . 909835/0498
I U9BJ01
Da Blutserum das Enzym Katalase enthält, welches, wie oben
erwähnt, das Wasserstoffperoxyd zerstört, muss dem für <lis Erzeugung
des Wasserstoffperoxids bestimmten Stoffgemisch noch
eine Substanz zugesetzt werden, die die Wirkung der Katalase
hemmt. Zu diesem Zweck ist Natriumazid besonders zu empfehlen. Gegebenenfalls können auch Cyanide, wie Kaliumcyanid oder Natriumoyanid,
verwendet werden.
Vielfach hat es sich als zweekmässig erwiesen, dem System zur Erzeugung des Wasserstoffperoxyds noch ein Stabilisiermittel
für die Urat-Oxydase zuzusetzen. Da Urat-Oxydase in verdünnter
!lösung gegen Spuren von Metallionen empfindlich ist, ist es
eweckmässig, die Urat-Oxydase mit einem Ohelatisierungemittel,
wie Ethylendiamin, 1,2-Propylendiamin oder anderen Diaminen
oder substituierten Diaminen, zu stabilisieren, die die hemmende Wirkung von zweiwertigen und anderen mehrwertigen Metallionen
auf die Urat-Oxydase wieder aufheben. Ein bevorzugtes Stabilisiermittel ist z.B. Ä'thylendiamintetraeasigsäure«
Ein System zur Erzeugung von Wasserstoff peroxyd, wie das
oben beschriebene, kann in verschiedenen Formen verwendet werden. Z.B. können die Bestandteile in flüssiger Form oder je
nach der Erhältlichkeit fester Enzyme in Pulverform miteinander gemischt werden. Die flüssigen Mittel können dann lyophilisiert
werden, und das dabei erhaltene Produkt kann zu jedem späteren Zeitpunkt durch einfachen Zusatz von Wasser wieder in lösung
gebracht werden. Gegebenenfalls können die Pulver in Form von Tabletten gebracht werden. Auoh andere Formen können angewandt
- 8 909835/0490
ORIGINAL INSPECTED
werden, was weltgehend von Fragen der Beständigkeit, der Yerpackung
und Lagerung abhängt.
Das Nachweissystem zur quantitativen Bestimmung der Menge des Wasserstoffperoxyds, welches bei der durch die Urat-Oxydaee
katalysierten Oxydation der Harnsäure zu Allantoin erzeugt worden ist, besteht im allgemeinen aus einem !Farbbildner, einem
Stoff mit peroxydierender Aktivität, der imstande ist, die Oxydation des Farbbildners durch das Wasserstoffperoxyd unter
Ausbildung einer farbänderung zu katalysleren, und einem Puffer,
der denjenigen pH-Bereich liefert, bei dem die Oxydation dee Farbbildners in wirksamer Weise durchgeführt werden kann.
Die Pufferung des Nachweissystems erfolgt zweckmäesig innerhalb
eines pH-Bereiches von etwa 4,5 bis 5,5· Hierfür können
als Puffer z.B. Gitrat, Sucoinat, Tris-(hydroxymethyl)-methylamin~glutamat
und 2ris-(hydroxymethyl)«methylamin-malonat,
aber auch andere Puffer verwendet werden, die für einen pH-Bereich von 4,5 bis 5»3 in Betracht kommen. Dieser saure pH-Bereich
1st erforderlich, damit sich die beständigste Farbe entwickelt. Es wurde gefunden, dasa bei höheren pH-Werten die
Farbe sehr schnell verblasst.
Obwohl die Konzentrationen der verschiedenen Beatandteile
sowohl in dem Wasserstoffperoxyd-Erzeugungssystem als auch in dem Naehweisaystem nicht besonders ausschlaggebend sind, lassen
sich doch in dieser Beziehung gewisse Richtlinien aufstellen. Die verschiedenen Stoffe werden im allgemeinen in solchen Konzentrationen
verwendet, dass der Konzentrationsbereioh der
- 9 909835/0498
Harnsäure, die bestimmt werden soll, dadurch umfasst wird. Abgesehen
davon» sind die Eonzentrationsbereiche in den betreffenden Reagenzien nicht besonders wichtig.. Hinsichtlich des
buffers wurde jedoch gefunden, dass beim Zusatz des zweiten
Buffers zwecks Herabsetzung des pH-Wertes auf den Bereich von etwa 4,5 bis 5»5 das Verhältnis der Menge dieses Puffere zu
derjenigen des alkalischen Puffers, der für das Erzeugungssy-
atem verwendet wird, unter der Annahme der gleichen molaren
Konzentration beider Puffer im allgemeinen etwa 3 : 1 betragen soll.
Um ein sichtbares Mass für die Menge des von dem Erzeugungssystem hervorgebrachten Wasserstoffperoxyds zu gewinnen,
können verschiedene Farbbildner oder Farbindikatoren verwendet werden. Insbesondere können verschiedene organische Stoffe verwendet
werden, und zwar hauptsächlich diejenigen, die von Anilin und Phenol abgeleitet sind. Z.B. eignen sich als Farbbildner
o-Tolidin, o-Toluidin, p-Toluidin, o-Phenylendiamin,
NjN'-Dimethyl-p-phenylendiamin, Benzidin, o-Anisidin,
p-Anlsidin, Dianisidin, o-Kresol, m-Kresol, α- und S-Naphthol,
Brenzcatechin, Guajakol, Pyrogallol, 2,7-Diaminofluoren, Leukoindophenole
und Guajakharz. Die einzige Beschränkung hinsichtlich
des Farbbildners ist die, dass er in Gegenwart von Wasserstoff per oxy d und einem als Oxydationskatalysator wirkenden
Stoff mit ρ er oxydierender Aktivität eine Farbänderung erleiden muss.
Das Enzym Peroxydase gehört zu einer Gruppe von Stoffen,
- 10 909835/0498
die für ihre peroxydierende Aktivität bekannt sind, d.h.« die
die Fähigkeit besitzen, die Umsetzung verschiedener Farbbildner
mit Wasserstoffperoxid su katalysieren. Peroxydaee kann
aus Meerrettich, Feigenglättern oder Kartoffeln gewonnen wer·»
den. Andere Stoffe mit peroxydierender Aktivität sind z.B. normales Blut, rote Blutzellen, lyophilisiertes Blut und ähnliche
natürliche und synthetische Metallporphyrine. Auch Gemische aus Kaliumiodid und Hatriummolybdat sowie aus anderen
wasserlöslichen Jodiden, wie Natriumiodid und Ammoniumjodid,
und anderen löslichen Molybdaten, wie Kaliummolybdat und Ammoniummolybdat,
können verwendet werden. Ebenfalls verwendbar ist Hatriummolybdat sowie andere Molybdate für sich allein·
Urohämin und andere, bekanntermassen als Oxydationskatalysatoren
bekannte Porphyrine sind ebenfalls verwendbar. Ton den Metallporphyrinen
wird zwar Häain bevorzugt; es können aber auch verschiedene komplexbildende Verbindungen, die gewisse andere,
an sich nicht verwendbare Metallporphyrine aktivieren, in Kombination mit dieeen anderen Ketallporphyrinen zur Herstellung
wirksamer Katalysatoren verwendet werden. Solche Stoffe sind ZoB. 2-Aminobenzchiazol, Pyridin, Bipyridyl, Bipyridylpyridin,
Nicotinsäure und dergleichen. Andere Stoffe von nioht-enzymatischem
Charakter, die die gewünschte Oxydationereaktion katalysieren, sind Verbindungen, wie Sisensulfooyanat, Bisentannat,
Ferroferrocyanid, Kaliumchromisulfat und andere.
Bas oben beschriebene Haohweissystem kann ebenfalls in
verschiedenen Formen zur Verfügung gestellt werden. Z.B. kann
- 11 909835/0498
H9
U&Ö1
dieses System in Form einer Flüssigkeitr ale lyophilis£@s?t©
Flüssigkeit oder als lyophilisiertee Pulver hergestellt
Gegebenenfalls können die Stoffe in trockener Form und ale Pulver oder in Form von !ableiten verwendet v?®s?
Eine andere Form, in der das Nachweissystem angevrs&dt werfen
kann, let die Form von Stäbchen oder Streifen aus ssugfähigem
Material, wie absorbierendem Papier, welches mit den Bestandteilen getränkt ist. Das Mittel kann auch in verschiedenen an
deren Formen angewandt werden.
Die folgenden Stoffe werden gemischt, lyophilisiert und
in Wasser wieder in Lösung gebracht:
Natriumborat als Puffer
(0,1-molar, pH = 9,2) 0,1 ml
Athylendiamintetraessigsäure (1 #) 0,01 ml
Natriumazid (0,1-molar) 0,05 ml
Urat-Oxydase (0,02 Einheiten*) 0,03 ml
* Eine Einheit an Urat-Oxydase-Aktivität ist diejenige Enzymmenge,
die die Umwandlung von Harnsäure in Allantoin mit einer Geschwindigkeit von 1 Mikromol je Minute bei 25° C
katalysiert, wenn die Harnsäure in einer Konzentration von 20 mg/1 angewandt wird.
Dann werden 0,02 ml Blutserum zugesetzt, welches 9»2 mg Harnsäure
je 100 ml enthält. Die Umsetzung wird 5 Minuten fortgesetzt.
Nach Beendigung der anfänglichen Umsetzung wird das folgende
Stoffgemisch lyophilisiert, dann in Wasser in lösung ge-
- 12 909835/0498
bracht und zu der obigen Lösung zugesetzt:
Natriumcitrat als Puffer
(0,2-molar, pH = 4,5) 0,15 ml
Peroxydase (1 mg/ml - Aktivität 200 Binheiten*/mg) 0,06 ml
o-Iolidin (25 mg/10 ml) 0,06 ml
* Eine Einheit an Peroxydase-Aktivität ist diejenige Menge
des Enzyms, die die Zersetzung von Wasserstoffperoxyd mit einer Geschwindigkeit von 1 Mikromol/Minute bei 25° C katalysiert.
Innerhalb 10 Sekunden entwickelt sich eine blaue Farbe· Die Farbe wird mit einer geeichten Farbtafel verglichen und ergibt
einen Harnsäuregehalt von 9 mg je 100 1.
Um dieses Verfahren weiter zu prüfen, werden die naoh dem obigen Verfahren für verschiedene Serumproben erhaltenen Ergebnisse
mit denjenigen verglichen, die aus spektrophotometrlsohen
Werten erhalten worden sind. Die nachstehende Tabelle gibt eine Übersicht über diese Werts.
Harnsäurekonaentration in der Serumprobe, mg/100 ml
Farbtafel
ier serumprooe, mg/
Spektrophotometer
1,7 2,6
3 2,6
3 3,4
4 4,2 6 5
6 7,1
7 6,3 7 6,4 9 9,2
11 10,8
- 13 909835/049
Das folgende Beispiel zeigt die Wirksamkeit niedrigerer
Konzentrationen an Urat-Oxydaee.
Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch mit 0,01 ml (0,007
Einheiten) an Urat-Oxydase. Dae lyophilieierte Pulver wird mit 0,1 ml Wasser wieder in Lösung gebracht. Die durch Vergleich
mit einer geeichten Farbtafel und auf spektrophotometrisohem Wege erhaltenen Werte stimmen mit der Genauigkeit des Beispiels
1 miteinander überein.
Das folgende Beispiel erläutert die Verwendung eines anderen Puffere für das Wasserstoffperoxyd-Erzeugungssystem»
Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch mit einer 0,1-molaren
Lösung von Tris-{hydrozymethyl)-aminomethan als Puffer anstelle
des Boratpuffers. Dieser Puffer liefert einen pH-Wert von 9,2.
Die Ergebnisse sind die gleichen wie in Beispiel 1.
Das folgende Beispiel erläutert die Verwendung eines anderen Katalase-Inhibitors.
Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch mit einem 0,2-molaren
Boratpuffer bei einem pH-Wert von 8,5 und mit Kaliumoyanid als Inhibitor für die Katalase. Die Ergebnisse sind die gleichen
wie in Beispiel 1.
Es wurde gefunden, dass man bei allen pH-Werten von etwa 8,5 bis 10,0 zufriedenstellend arbeiten kann.
909835/0498
fs ■ .149890'
Das folgende Beiepiel erläutert i;S* -.isswe&c&ims etsiee anderen
Nachweissystems für das Wasserstoff geroßt ο
Man arbeitet nach Beiepiel 2, 3®doeh siit dass folgern^®':.
Gemisch zum Nachweis des Waeeerstofffei?$3^1s!
Natriumsuccinat (pH s 5,0) If,7 sog
Peroxydase 0,06 mg
o-Iolidln 0,15 ag
Das Gemisch wird lyophilisiert und wieder in Wasser gelöst. Die
Ergebnisse sind die gleichen wie in Beiepiel 2.
Das folgende Beispiel erläutert die Anwendung eines Mittels zur Erhöhung des Farbunterschiedes.
Beiepiel 6
Man arbeitet nach Beiepiel 4» jedoch unter Zusatz von 0,017 mg Tartrazin (PD & C-GeIb Nr. 5) au dem Farbbildner. Die
sich entwickelnden Farben liegen ia Bereich Von gelb-grün bis blau-grün und gestatten eine klare Unterscheidung zwischen verschiedenen
Harnsäurekonzentrationen im Blutserum, wie im Beispiel 5·
Kurz zusammengefasst, betrifft die Erfindung ein Mittel
und ein Verfahren zum Nachweis der Menge der in Blutserum enthaltenen Harnsäure. Das Mittel besteht aus einem Wasserstoffperoxyd-Erzeugungsaystem,
wie einem Gealsoh aus Urat-Oxydase und einem Katalase-Inhibitor, welches auf einen pH-Wert gepuffert
ist, der nahe bei dem für die Urat-Oxydase-Aktivität gün-
- 15 909835/0498
H989Ö1
»tigsten Wert liegt, und einem Wasserstoff peroxyd-NaaJiweiasystem,
wie einem Gemisch aus einem Farbbildner und eineis Stoff
mit peroxydierender Aktivität, der imstande ist, die Oxydation
des Farbbildners durch das Wasserstoffperoxid au katalysieren,
wobei dieses System auf einen pH-Wert in der Hätte des für die
Farbentvieklu.!g günstigsten Wertes gepuffert let.
-1(5 909835/049$
Claims (1)
149890Ί
Mies Laboratories, Inc.
Patentansprüche
Patentansprüche
Patentansprüche
1 ο Diagnostisches Mittel sum Nachweis bzw. zur Bestimmung
von Harnsäure im Blut, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem zur Erzeugung von Waseerstoffperoxyd bei der Oxydation
von Harnsäure befähigten Enzyrasystem, eine» die Dissoziation
des Viasserstoffperoxyds verhindernden System und einem System
zum Nachweis bzw* zur quantitativen Bestimmung des erzeugten
Wasserstoffperoxyds baateht.
2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass das System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxyd
aus Urat-Oxydase und einem Katalase-Inhibitor besteht und auf
einen pHrWert in ctare Hähe des für die Aktivität der Urat-Oxydase
günstigsten Viertes gepuffert ist.
3. Diagnostisches Mittel naoh Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
dass das System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxyd auf einen pH-Wert gepuffert ist, bei dem die Urat-Oxydase die
Harnsäure unter gleichzeitiger Wasserstoffperöxydblldung in
Allantoin umwandelt.
- Π
909835/04
909835/04
■ U U98901
4. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
dass das System zum Nachweis des Wasserstoffperoxyds
aus einem Farbbildner, einem die Oxydation des Farbbildners durch Wasserstoffperoxid katalysierenden Stoff mit peroxydierender
Aktivität und einem Puffer besteht, der den pH-Wert in der Nähe des für die Farbentwicklung günstigsten Wertes hält.
5. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
dass das Wasserstoffperoxyd-Erzeugungssysteo auf einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 10 gepuffert ist.
6. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasserstoffperoxyd-Erzeugungssystein auf
einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 10 und das Wasserstoffperoxyd-Nachweissystem
auf einen pH-Wert von etv/a 4,5 bis 5» 5 gepuffert ist.
7* Diagnostisches Mittel nach Anspruch 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
dass der Katalaee-Inhibitor ein Alkaliazid oder
ein Alkalicyanid ist.
8ο Diagnostisches Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
dass der Stoff alt peroxydierender Aktivität Peroxydase ist,
9ο Diagnostisches Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
dass der Farbbildner o-Tolidin ist.
10. Diagnostisches JtLttel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
dass das Wasserstoffperoxyd-Erzeugungssystem sowie
- 18 909835/049*
13 U98901
das Wasserstoffperoxyd-Haehweiesyetem in Pora lyophilisierter
fester Stoffe vorliegen.
11. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasseretoffperoxyd-Erzeugungseystera ein
Stabilisieraittel für die TJrat-Oxydaee enthält.
12. Diagnostisches Mittel naoh Anspruch. 2, dadurch gekennzeichnet, dass das WaBeeretoffperoxyd-Erzeugungseystem ein zur
Verhinderung der Hemmung der Urat-Qxydase-Aktivität durch
Schwermetallβ geeignetes Chelatisierungseittel enthält.
13· Diagnostisches Mittel zum Hachweis bzw. zur Bestimmung τοη Harnsäure in Blut, daduroh gekennzeichnet, dass es aus
einem Wasseretoffperoxyd-Erzeugungesyetem, bestehend aus Urat-Oxydase, Hatriumazid, Äthylendiamintetraessigeäure und einem
einen pH-Wert von 9,2 innehaltenden Hatrluoboratpuffer, und
einem Wasserstoffperoxyd-Naohweissyeten, bestehend aue Peroxydaae, o-Tolidin und einem einen pH-Wert von 4,5 innehaltenden Natriumoitratpuffer, besteht.
H. Verfahren zum Hachweis bzw. zur Bestimmung von Harnsäure
im Blut, dadurch gekennzeichnet, dass das Blutserum mit einem Enzymsystem, welches imstande ist, bei der Oxydation von Harnsäure Wasserstoffperoxyd zu erzeugen, in Gegenwart eines die
Dissoziation des Wasserstoffperoxydes verhindernden Systems
lange genug umgesetzt wird, um alle in dem Blut enthaltene Harnsäure unter gleichzeitiger Bildung von Wasseretoffperoxyd
- 19 -909835/0490
1488901
in Allantoin überzuführen, worauf das so erzeugte Waseeretoffperoxyd
nachgewiesen bzw« bestimmt wird«
15. Verfahren nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet, dass
das Blutserum mit eines System zur Erzeugung von Wasserstof£-
peroxyd umgesetzt wird, welches aus Urat-Oxydase und einem Katalase-inhibitör
"besteht und auf aen für die Aktivität der
Ürat-Oxydasa gunstigsten pH-Wert gepuffert ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass
das Wasseretoffperoxyd-Erzeugungesysteni auf den pH-Wert gepuffert
ist« bei dem die Ilrat-Oxydaee a±m Harnsäure unter gleichzeitiger
Bildung von Wasserstoffperoxyd in Allantoin überführt.
17. Verfahren nach Anspruch 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet,
dass das Gemisch nach der Bildung des Wasserstoffperoxyds
mit einem System zum Nachweis des Wasserstof fperoxyds in Berührung
gebracht wird, welches aus einem Farbbildner» einem die
Oxydation des Farbbildners durch Wasserstoffperoxyd unter Ausbildung einer Farbänderung, katalysierenden Stoff mit peroxydierender Aktivität und einen Suffer besteht» der das Gemisch
in der Nähe des fir ate Farbentwicklung günstigsten pH-Wertes
hält«
ΐβ« Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet»; dass
das System zur Erzeugung von Wasserstoff peroxyd nicht langer
als etwa 5 Minuten mit dem Bluteerum umgesetzt wird.
19· Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass
das System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxyd ein Stabilisiermittel
für Urat-Qxydase enthält.
20. Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Harnsäure in Blut, dadurch gekennzeichnet, dass Blutserum mit eines System
zur Erzeugung von Wasserstoffperoxyd, bestehend aus Urat-Oxydase,
Natriumazld, Xthylendiamintetraessigsäure und einem
einen pH-Wert von 9,2 innehaltenden Natriumboratpuffer, umgesetzt
und das so erhaltene Gemisch ansohliessend mit einem System
zum Nachweis von Wasserstoffperoxyd, bestehend aus Peroxydase,
o-Tolidin und einem einen pH-Wert von 4,5 innehaltenden Natriumeitratpuffer in Berührung gebracht wird.
- 21 90 9 835/0498
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US288498A US3349006A (en) | 1963-06-17 | 1963-06-17 | Process and composition for the enzymatic determination of uric acid |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1498901A1 true DE1498901A1 (de) | 1969-08-28 |
| DE1498901B2 DE1498901B2 (de) | 1973-04-05 |
| DE1498901C3 DE1498901C3 (de) | 1973-10-25 |
Family
ID=23107374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1498901A Expired DE1498901C3 (de) | 1963-06-17 | 1964-06-11 | Diagnostisches Mittel und Ver fahren zum Nachweis bzw zur Be Stimmung von Harnsaure im Blut |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3349006A (de) |
| BE (1) | BE649402A (de) |
| BR (1) | BR6460061D0 (de) |
| CH (1) | CH473389A (de) |
| DE (1) | DE1498901C3 (de) |
| DK (1) | DK130180B (de) |
| GB (1) | GB1073172A (de) |
| NL (2) | NL6406883A (de) |
| SE (1) | SE304623B (de) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3649198A (en) * | 1970-05-19 | 1972-03-14 | Pfizer & Co C | Diagnostic method for the determination of uric acid in blood |
| DE2237940C3 (de) * | 1972-08-02 | 1980-12-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure |
| DE2307052C2 (de) * | 1973-02-13 | 1974-10-31 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Harnsäure-Standard |
| AT347600B (de) * | 1974-11-11 | 1979-01-10 | Wellcome Found | Testeinrichtungen |
| CA1048390A (en) * | 1975-02-14 | 1979-02-13 | James B. Dugle | Method, composition, and device for determining the specific gravity of a liquid |
| GB1524731A (en) * | 1976-01-15 | 1978-09-13 | Wellcome Found | Determination of uric acid |
| US5055398A (en) * | 1987-05-22 | 1991-10-08 | Kabushiki Kaisha Meidensha | Process for measuring the concentration of a component in body fluid such as urine or blood |
| US9034593B2 (en) | 2010-11-22 | 2015-05-19 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Vaginal indicator to detect biomarkers of good health |
| JP7110360B2 (ja) | 2017-10-09 | 2022-08-01 | テルモ ビーシーティー バイオテクノロジーズ，エルエルシー | 凍結乾燥方法 |
| JP7495426B2 (ja) | 2019-03-14 | 2024-06-04 | テルモ ビーシーティー バイオテクノロジーズ，エルエルシー | 凍結乾燥容器用充填治具、システム及び使用方法 |
| CN114441516A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-05-06 | 苏州百源基因技术有限公司 | 一种尿酸检测试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2990338A (en) * | 1959-11-24 | 1961-06-27 | Gibson Jacob John | Composition for determination of glucose in body fluids |
-
0
- NL NL134608D patent/NL134608C/xx active
-
1963
- 1963-06-17 US US288498A patent/US3349006A/en not_active Expired - Lifetime
-
1964
- 1964-06-11 DE DE1498901A patent/DE1498901C3/de not_active Expired
- 1964-06-11 CH CH763564A patent/CH473389A/de not_active IP Right Cessation
- 1964-06-16 SE SE7311/64A patent/SE304623B/xx unknown
- 1964-06-17 GB GB25127/64A patent/GB1073172A/en not_active Expired
- 1964-06-17 NL NL6406883A patent/NL6406883A/xx unknown
- 1964-06-17 BR BR160061/64A patent/BR6460061D0/pt unknown
- 1964-06-17 DK DK305064AA patent/DK130180B/da unknown
- 1964-06-17 BE BE649402D patent/BE649402A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BE649402A (de) | 1964-10-16 |
| DK130180B (da) | 1975-01-06 |
| US3349006A (en) | 1967-10-24 |
| DE1498901C3 (de) | 1973-10-25 |
| NL134608C (de) | |
| CH473389A (de) | 1969-05-31 |
| GB1073172A (en) | 1967-06-21 |
| DE1498901B2 (de) | 1973-04-05 |
| SE304623B (de) | 1968-09-30 |
| NL6406883A (de) | 1964-12-18 |
| DK130180C (de) | 1975-06-23 |
| BR6460061D0 (pt) | 1973-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0186134B1 (de) | Mittel zur Verbesserung des Nachweises Wasserstoffperoxid liefernder Oxidase-Reaktionen und seine Verwendung | |
| DE1598752A1 (de) | Zubereitung zum Nachweis chemischer Substanzen | |
| DE2833612B2 (de) | Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd | |
| DE3239236A1 (de) | Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen | |
| DE2913553B1 (de) | Verfahren und Reagenz zur enzymatischen Bestimmung von Enzymsubstraten | |
| DE1498901A1 (de) | Diagnostisches Mittel und Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Harnsaeure im Blut | |
| DE1598809B2 (de) | Diagnostiziermittel fuer glukose in fluessigkeiten | |
| DE69830556T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung von glykosylierten Proteinen | |
| EP0054146B1 (de) | Nachweis von NAD (P) H oder Salicylat | |
| CH622555A5 (de) | ||
| DE3125667C2 (de) | Verfahren und Mittel zum Nachweis von Wasserstoffperoxid | |
| DE2237940A1 (de) | Verfahren zur quantitativen bestimmung von harnsaeure | |
| Thunberg | The hydrogen-activating enzymes of the cells | |
| DE2439348B2 (de) | Diagnostisches mittel zum nachweis und zur bestimmung von cholesterin und cholesterinestern in koerperfluessigkeiten | |
| EP0105443B1 (de) | Verfahren zur selektiven Herstellung reduzierter Sauerstoffspezies und hierfür geeignete Reagentien | |
| DE2224132B1 (de) | Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin | |
| DE3851304T2 (de) | Verfahren und Testzusammensetzung zur Bestimmung von Enzym-Aktivität. | |
| DE3851635T2 (de) | Testsatz und verfahren zur bestimmung von aniliden. | |
| EP0048347B1 (de) | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin | |
| DE3406770A1 (de) | Nucleosidtriphosphat-abhaengige 1-methylhydantoinase und ihre verwendung | |
| CH651318A5 (de) | Verfahren und reagenz zur bestimmung der peroxidase. | |
| EP0498260B1 (de) | Verfahren zur Stabilisierung von 1-Methylhydantoinase, Verwendung einer stabilisierten 1-Methylhydantoinase zur Bestimmung eines Analyten, entsprechendes Bestimmungsverfahren sowie hierfür geeignete Mittel | |
| DE2558536B2 (de) | Verfahren zur kinetischen Substratbestimmung und Reagens zu seiner Durchführung | |
| WO2019238887A1 (de) | Verfahren zur entfernung von gelöstem sauerstoff bei einem elektrochemischen biosensor der als sensorenzym eine oxidase verwendet | |
| DE2737290A1 (de) | Analytisches verfahren zur bestimmung einer substanz in einer fluessigkeit |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |