DE3239236A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen - Google Patents

Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen

Info

Publication number
DE3239236A1
DE3239236A1 DE19823239236 DE3239236A DE3239236A1 DE 3239236 A1 DE3239236 A1 DE 3239236A1 DE 19823239236 DE19823239236 DE 19823239236 DE 3239236 A DE3239236 A DE 3239236A DE 3239236 A1 DE3239236 A1 DE 3239236A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
bilirubin
concentration
oxidase
calibration curve
reaction mixture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19823239236
Other languages
English (en)
Other versions
DE3239236C2 (de
Inventor
Kosaka Dr Akira
Hirano Kenichi
Matsunaga Kuniyoshi
Tanaka Noriaki
Murao Sawao
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amano Enzyme Inc
Original Assignee
Amano Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP57025613A external-priority patent/JPS6012032B2/ja
Priority claimed from JP12763282A external-priority patent/JPS5917999A/ja
Priority claimed from JP12763382A external-priority patent/JPS5918000A/ja
Application filed by Amano Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Amano Pharmaceutical Co Ltd
Publication of DE3239236A1 publication Critical patent/DE3239236A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3239236C2 publication Critical patent/DE3239236C2/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/62—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving uric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/103332—Bilirubin or uric acid standard or control
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
    • Y10T436/144444—Glucose
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/145555—Hetero-N
    • Y10T436/146666—Bile pigment
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von physiolo gischen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten oder Gasen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum quantitativen Bestimmen physiologischer Komponenten in biologischen Strömungsmitteln (Flüssigkeiten oder Gasen) im allgemeinen und auf Verfahren zum quantitativen Bestimmen physiologischer Komponenten in biologischen Strömurigöinitteln durch Verwendung von Bilirubin-Oxidase entweder allein oder zusätzlich, im-be^ou- · deren.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf dieses Verfahren aber durch das Verwenden von Lakkase. Unter Bilirubin-Oxidase versteht man ein neuartiges Enzym. Demnach wird zunächst dieses Enzym im einzelnen erläutert.
Bilirubin (C, ,IUgN^Og) ist ein Pigment, das in biologischen Flüssigkeiten, wie Blutserum, Urin usw. verkommt. Ein im Gehirn von Ratten oder Guineaschweinen vorkommendes Enzym und ein aus einem Pilz der Art Agaricus hergestellte Enzym wirken nach bisherigen Berichten auf Bilirubin. Die enzymologischen Eigenschaften dieser Enzyme sind noch nicht geklärt.
Bei einer Suche nach Mikroorganismen, die eine auf Bilirubin wirkendes Enzym erzeugen, hat gezeigt, daß einige Mikroorganismen, die zu den Arten Myrothecium und Coprinus gehören, ein Enzym erzeugten, das Bilirubin oxidierten. Diese Mikroorganismen der Art Myrothecium wiesen beispielsweise Myr.verrucaria MT-1 (FEEM-P 59 18), das neuerdings isoliert worden ist, und Artenkulturen wie Myr.verrucaria IFO 6113, IFO 635I und IFO 9056, Myr cinctum IFO 9950, Myr roridum IFO 9531 usw. auf.
Diese Mikroorganismen der Art Coprinus enthalten beispielsweise Artkulturen wie Cop.cinereus IFO 8371, Cop.Lagopides IFO 30120 usw.
Zum Herstellen dieses Enzym durch Verwenden eines Mikroorganismus der Art Myrothecium oder Coprinus wird der Mikroorganismus in Art routinemäßiger Tauchkultur kultiviert und das Filtrat der kultivierten Brühe durch Beigabe von Ammoniumsulfat ausgesalzen. Die so gewonnenen Abscheidungen werden in deionisiertem Wasser gelöst, wobei die Lösung dann dialysiert wird. Die innere Dialyselösung ist nach dem mit aktivierter Holzkohle erfolgter Entfärbung der Spaltenchrometographie unterzogen und seine aktiven, ein-gesammelten Bruchstücke werden lyophilisiert, um eine pulverige Herstellung zti erhalten.
Beim Analysieren durch Scheibenelektrophorese hatte die Herstellung gezeigt, daß das Enzymprotein ein einzelnes Band lieferte das lagemassig mit der Enzym tätigkeit zusammenfiel.
Die so erhaltene Enzymgewinnung wurde als Bilirubin-Oxidase erkannt. Das Bilirubin zu Biliverdin (0„ H, N4 Og) oxidierte durch einen Elektronakzeptor von molekularem Sauerstoff.
Das Enzym ist auch nicht durch Ausbildung von Wasser stoffperoxid im Laufe der Oxidation gekennzeichnet. Die enzymologischen Eigenschaften der Bilirubin-Oxidase werden noch dadurch beschrieben werden, das die anderen Werte in Parentesen diese Enzyme der Art Coprinusursprungs darstellen.
■ii-
1.) Substrat-Besonderheit: Außer Bilirubin wirkt das Enzym an Chlorophyllin und Hemin, aber nicht an Hemoglobin, Chlorophyll und Vitamin
2.) Temperaturstabilität: Mehr als 90% Aktivität wird bei 500G gehalten, während 100% Aktivität bei 70°C verloren geht.
3.) Optimale Temperatur: 40°C (3O0C)
4.) pH-Stabilität: pH 6 bis 10 (pH 5 bis 9).
5.) optimaler pH-Wert: ph 8
6.) Molekulargewicht: etwa 52,000;
7.) Isoelektrischer Punkt: 4,1 (3,8);
8.) Effekt der Metallionen: Fühlbar gehemmt durch Fe++, aber nicht von anderen Metallionen beeinträchtigt.
9·) Inhibitoren: Kalium-zyanid und Thiourea;·
10.) Absorption von sichtbarem Licht: 1% Enzym-Lösung zeigt keine Absorption in der Nähe von 375 und 460 mm;
11.) Zuckergehalt: etwa 7»8 % als Glykose; und 12.) Kupfergehalt: 1 Mol Kupfer pro ein Mol Enzym.
Zusätzlich zur Bilirubin-Oxidase wurden weiter eine große Zahl konventioneller Enzyme untersucht.
D.H.. es wurde geprüft, ob sie Bilirubin zu Biliverdin ohne Bildung von Wasserstoffperoxid oxidieren können. Es hat sich gezeigt, daß Lakkase, Tyrosinase und ascorbate Oxidase oxidieren kann, worunter Lakkase vorzu-2c ziehen ist. Laufend erhältliche Herstellungen von Lakkase enthält solche, die aus einer sogenannten Lackfabrik (Rhus verniciflua) und aus kultiviertem Materialien eines Basidiomycete z.B. Polyporus versicolor IFO
BAD ORIGINAL
0I -/C-
9791 stammen (siehe Biochimeca et Biophysica Acta, 30, 44 - 1955; Acta chemica scabdinavia 21, 2367 - 1967 -), die beide Bilirubin zu Biliverdin oxidieren können.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum quantitativen Bestimmen der spezifischen physiologischen Komponenten, die in biologischen Flüssigkeiten (oder Gasen) durch Verwenden von entweder der Bilirubin-Oxidase, wie vorstehend, hergestell oder in der üblichen Lakkase enthalten ist. Die physiologischen Komponenten, die von den Verfahren nach der Erfindung bestimmt werden können, enthalten Bilirubin, Glukose, Cholesterol, neutrale Fette, freie Fettsäuren, Phospholipide und Harnsäure. Nach einem Merkmal der Erfindung enthält das Verfahren das quantitative Bestimmen des in biologischen Flüssigkeiten enthaltenen Bilirubins durch Verwenden von BiIirubin-Oxidase oder Lakkase. Nach einem anderen Merkmal enthält das Verfahren das quantitative Bestimmen physiologischer Komponenten wie Glukose, Cholesterol, neutrale Fette, freie Fettsäuren, Phospholipide und Harnsäure, die alle in biologischen Flüssigkeiten enthalten sind,' durch Verwenden von Bilirubin-Oxidase oder Lakkase wie die Reagense zur Benutzung beim herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen der physiologischen Komponenten.
Figur 1 zeigt die Eichkurve, die beim Beispiel 1 erhalten wird, das noch erläutert werden wird. Diese Kurve zeigt die Beziehung zwischen der Bilirubin-Konzentration und Absorptions-fähigkeit. (Abnahme)}
Figur 2 zeigt die beim Beispiel 4 erhaltene Eichkurve, das noch beschrieben werden wird. Die Kurve zeigt die
Beziehung zwischen Glucosekonzentration und Absorptionsfähigkeit;
Figur 3 zeigt die im Beispiel 6, das noch beschrieben wird, erhaltene Eichkurve, die die Beziehung zwisehen Cholesterolkonzentration und Absorptionsfähigkeit darstellt;
Figur 4 zeigt die beim Beispiel 7» das noch beschrieben werden wird, erhaltene Eichkurve, die die Beziehung zwischen Trioleinkonzentration und Absorptionsfähigkeit darstellt.
Figur 5 zeigt lie beim Beispiel 9» das noch beschrieben werden wird, erhaltene Eichkurve, die die Beziehung zwischen Oleinsäurekonzentration und Absorptionsfähigkeit darstellt; und . . _ -.—
Figur 6 zeigt die beim Beispiel 10 erhaltene Eichkurve, die die Beziehung zwischen Cholinkonzentration und Absorptionsfähigkeit darstellt.
Vor allem ist ein Merkmal der Erfindung ein Verfahren zum quantitativen Bestimmen von Bilirubin in biologisehen Flüssigkeiten. Dieses Verfahren wird nachstehend erläutert:
Bilirubin ist im freien Zustand in biologischen Flüssigkeiten nicht zwingend vorhanden, aber in Form von sogenanntem konjugiertem Bilirubin (d.h. Bilirubin kombiniert mit glukuronischer Säure, schwefeliger Säure, Salzsäure oder dergl.) oder von sogenanntem unkonjugiertem Bilirubin (d.h. Bilirubin kombiniert mit Albumin).
Es wird geaagt, UhH konjugiertes Bilirubin in Fällen von Leberzellenleeion, hepatitischer Jaundiz, posthepatitischer Jaundiz und dergl. zunimmt, während unkonjugiertes Bilirubin in Fällen von Leberdysfunktion und dergl. ansteigt. Deshalb wird es als notwendig"erachtet, sowohl konjugiertes als auch unkonjugiertes als auch unkonjugiertes Bilirubin hinsichtlich der klinischen Medizin unterschiedlich zu bestimmen.
Das unterschiedliche Bestimmen von Bilirubin wurde bisher mit einem chemischen Verfahren durchgeführt, bei dem Bilirubin mit einem Diazo-Reagens reagiert wurde, um Azobilirubin zu erhalten, dessen purpurrote Färbung dann kolorimetrisch bestimmt wird. Das Verfahren besitzt jedoch die Nachteile, daß mühsame Operationen notwendig sind und es ungenau ist.
Es wurde erkannt, daß die Reaktivität von Bilirubin-Oxidase wie auch von Lakkase mit Bilirubin sich in biologischen Flüssigkeiten befindet und daß diese ' Enzyme bei alleiniger Verwendung hauptsächlich auf konjugiertes. Bilirubin einwirken können, während sie keine oder nur eine geringe Wirkung auf unkonjugiertes Bilirubin besitzen. Insbesondere besitzt Bilirubin-Oxidase, das durch einen Mikroorganismus der Art des Myrothecium hergestellt worden ist, keiije Wirkung auf unkonjugiertes Bilirubin, während Bilirubin-Oxidase, das mit einem Mikroorganismus der Art des Ooprinus und Lakkase hergestellt worden ist, eine geringe Wirkung auf unkonjugiertes Bilirubin aufweist.
Andererseits ist festgestellt worden, daß bei der XQ Durchführung der Reaktion dieser Enzyme mit Bilirubin
- 7
— op —
in einer biologischen Flüssigkeit bei Vorliegen von mindestens einem aus aktiven Oberflächenwirkstoffen, aromatischen Karbonsäuren, Sulfa-Drogen und Proteisen gewählten Zusätzen diese Enzyme nicht nur auf konjugiertes Bilirubin sondern auch auf nicht konjugiertes Bilirubin einwirken können, vielleicht, weil die Bindung zwischen Albumin und Bilirubin im unkonjugiertem Bilirubin geschwächt werden würde.
Hinsichtlich der erwähnten Ergebnisse hat es sich gezeigt, daß konjugiertes Bilirubin, das sich in einer biologischen Flüssigkeit befindet, durch die Verwendung von Bilirubin-Oxidase, die von einem Mikroorganismus der Art Myrothecium allein gewonnen worden wird, während totales Bilirubin, das die Summe von konjugiertem und nicht konjugiertem Bilirubin ist, die beide sich in der biologischen Flüssigkeit befinden, durch die Verwendung von Bilirubin -Oxidasen oder Lakkasen zusammen mit dem genannten Zusatz bestimmt.'.
werden kann. Der Pegel des unkonjugiertem Bilirubin kann leicht durch Subtraktion des ersteren vom letzteren errechnet werden.
Das vorliegende Verfahren der differentiellen Bestimmung von Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten wird, wie folgt, besonders erläutert: Zunächst wird im wesentlichen in derselben Weise wie beim chemischen Verfahren mit Verwendung eines Diazo-Reagens jede von wäßrigen Lösungen von kommerziell erhältlichen kristalinen Bilirubin mit sich verändernden Konzentrationen mit Bilirubin-Oxidase reagiert, das durch einen Mikroorga-
nismus der Art Myrothecium gewonnen worden ist. Für jede sich, ergebende Reaktionsmischung wird die Abnahme der Absorption bei der Wellenlänge von 440 mm oder die Zunahme der Absorption bei einer Wellenlänge von 530 und 380 mm-gemessen. Die gemessenen Werte werden gegen entsprechende Konzentrationen der Bilirubinlösungen gesetzt, um eine sogenannte Eichkurve zu erhalten, die die Beziehung zwischen diesen darstellt. Dann wird eine Probe einer biologischen Flüssigkeit mit einer unbekannten Bilirubinkonzentration mit dem Bilirubin-Oxidase reagiert, das von einem Mikroorganismus der Art Myrothecium gewonnen worden ist, und es wird die Abnahme oder Zunahme der sich ergebenden Reaktionskurve gemessen. Die konjugierte Bilirubinkonzentration in der Probe kann durch Vergleich des gemessenen Wertes mit der Eichkurve errechnet werden.
Dieselben Verfahren werden durchgeführt, mit Ausnahme, daß eine Bilirubin-Oxidase oder Lakkase zusammen mit dem Zusatz anstelle von nur Bilirubin-Oxidase verwendet wird, die von einem Mikroorganismus der Art Morothecium gewonnen worden ist. Die Eichkurve ist somit ähnlich aufgebaut und die gesamte Bilirubinkonzentration in der Probe kann dann aus dem gemessenen Wert der Absorption und der Eichkurve errechnet werden.
Beim Verfahren zum Bestimmen des gesamten Bilirubins nach der Erfindung kann die Bilirubin-Oxidase von entweder des Myrothecium-Ursprungs oder des Coprinus-UrSprungs verwendet werden. In ähnlicher Weise kann die Lakkase entweder aus einer Lackfabrik oder aus einem kultiviertem Material aus einem Basidiomycet verwendet werden. Besondere Beispiele von Additiven enthalten aktive Oberflächen-
agense wie sukrosefettige saure Estere, Natrium-Cholat, taurocholische Säure, Natriumdodecyl-Sulfat, p-toluenesulfonische.Säure, Zetyl-Pyridiumchlorid, Monylphenolethoxylat und Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Kondensat, aromatische carboxylische Säuren wie salicylische Säure und sulfosalicylische Säure, Sulfa-Drogen wie SuIfanilamide und azetosulfamines Natriunisalz, Protease wie Pronase P (Warenzeichen der Fa. Kaken Chemical Co.) enthalten. Unter diesen Verbindungen werden Natrium-Cholat, taurocholische Säure, Natrium-Dodezyl-Sulfat, p-toluenesulfonische Säure, salicylische Säure und sulfosalicylische Säure bevorzugt. Beim Verfahren zum differentiellen Bestimmen von Bilirubin nach der Erfindung können ferner Puffer, Enzymstabilisatoren und dergl. verwendet werden, wenn dies notwendig ist.
Die Enzymmenge zum Verwenden beim Verfahren zum differentiellen Bestimmen von Bilirubin ist das, daß seine Konzentration in der Reaktionsmischung gleich 0,003 bis 0,40 U/ml für Bilirubin-Oxidase oder gleich 0,06 bis 0,07 U/ml für Lakkase ist, ausgedrückt durch die Bilirubin-Oxidase aktivität, dessen Definition noch angegeben werden wird. Die Mengen der Additiven sind wie folgt: Beispielsweise wird Natrium Dodecylsulfat in einer solchen Menge verwendet, daß sich eine Konzentration von 0,5 bis 10 mM in der Reaktionsmischung ergibt. Natrium-Cholat wird in einer solchen Menge verwendet, daß sich eine Konzentration von 2 bis 30 mM in der Reaktionsmischung ergibt.
Die Einheit des Bilirubin-Oxidase-Aktivität wird wie folgt angegeben: Fünf mg Bilirubin-Kristale werden in
- 10 -
250 ml einer 0,2 M tris-HC1-Pufferlösung (PH 8,4) mit Ethylenediaminetetraazetät-Säure (1 mM) gelöst. Ein 2 ml-Teil dieser Lösung wird mit 0,2 ml der Enzymlösung gemischt/Diese Mischung wird bei 370C bebrütet und seine Absorptionsabnahme bei 44-0 nm wird dann gemessen. Die Enzymmenge, die 1 mikromole Bilirubin pro Minute oxidiert, wird als eine Einheit definiert.
Danach wird nach einem anderen Merkmal der Erfindung ein Verfahren zum quantitativen Bestimmen von physiologischen Komponenten wie Glukose, Cholesterol, neutrale Fette, freie Fettsäuren Phaspholipide und Harnsäure angegeben, die alle in biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind. Dieses Verfahren wird nachstehend erläutert.
Analytische Verfahren zum quantitativen Bestimmen von physiologischen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten durch Verwenden eines oxidierenden Enzyms (z.B. Glukose-Oxidase, Cholesterol-Oxidase, Harnstoff, Azylkoenzym-A-Oxidase, Cholin-Oxidase, Glycerol-3-Phosphat-Oxidase oder dergl.) wurden bisher auf dem Gebiet der klinischen Chemie durchgeführt. Nach diesen Verfahren wird das Wasserstoffperoxid, das aus einer physiologischen interessierenden Komponente gewonnen ist, zerlegt und die Absorption der Reaktionsmischung wird dann gemessen. Der gemessene Wert wird mit der Eichkurve vergl-ichen, die vorher durch Verwenden der physiologischen Komponente in reiner Form gewonnen worden ist, wodurch die Konzentration der physiologischen Komponente in der biologischen Flüssigkeit errechnet werden kann. Diese Verfahren zum Bestimmen von physiologischen Komponenten wurden jedoch von anderen physiolo-
- 11 -
gischen Komponenten beeinträchtigt, die sich nicht in der biologischen Flüssigkeit befinden. Bilirubin ist einer dieser interferierenden Stoffe für diese Verfahren, dessen Konzentration im Blutserum nicht größer als 1 mg/dl im gesunden Menschen ist.
Sie steigt unter pathologischen Bedingungen auf 20 mg/dl an. Es wurden somit bisher mehrere Verfahren vorgeschlagen, die verhindern, daß Bilirubin mit der Bestimmung von physiologischen Komponenten interferiert. Beispielsweise geschieht dies durch Beigabe eines Ferrocyanats, askorbischer Säure, eines EDTA-Eisen-Komplexes oder einer sogenannten spezifischen BiIirubin-Fungal-Enzym-Präparation zum Reaktionssystem (siehe Japanische Patentauslegeschrift Nr. 2584-0/80 und die Offenlegungsschriften 29718/80, 71398/82 und 151193/79. Diese Veröffentlichungen zeigen jedoch ihre Nachteile und diese Verfahren könnten nicht als befriedigend angesehen werden.
Es ist festgestellt worden, daß bei den herkömmlichen Verfahren zum quantitativen Bestimmen von physiologi-* sehen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten durch Verwenden oxidierender Enzyme, wie sie vorstehend beschrieben werden, die Beigabe von Bilirubin-Oxidase oder Lakkase wie auch die Additive zum Reaktionssystem, das das konjugierte und unkonjugierte Bilirubin, die beide in M(»loslachen Flüssigkeiten vorkommen, vollkommen zu ttluav unschädlichen Substanz wie BiIiverdin ohne Auabildung von Wasserstoffperoxid oxidiert. Dadurch wird verhindert, daß Bilirubin das Bestimmen physiologischer Komponenten beeinträchigt. Es war jedoch zu erkennen, daß sie sogenannten farberzeugenden
BAD ORIGINAL
Substanzen (at. Ii1, 4 «minoantipyrin, Phenol) in den Reagensen zu Verwendung bei herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen von physiologischen Komponenten enthalten waren, die wesentlich mit dem zugegebenen Bilirubin-Oxidase oder Lakkase reagiert haben, was eine Unbequemlichkeit beim Messen der Absorptionsfähigkeit zum Folge hatte. Hierfür ist weiter festgestellt worden, daß diese durch Beigeben von Natriumfluorid, Phenanthrolin oder Hydroxylamin zum Reaktionssystem behoben werden könnte.
Das vorliegende Verfahren zum quantitativen Bestimmen physiologischen Komponenten (d.h. Glukose, Cholesterol, neutrale Fette, fettfreie Säuren, Phospholipide und Harnsäure) in biologischen Flüssigkeiten wird nachstehend besonders beschrieben: zunächst ist es im wesentlichen dieselbe Weise wie das herkömmliche Verfahren zum Bestimmen interessierender physiologischer Komponenten. Jede der Lösungen der Komponente in reiner Form (Kristalle, Pulver oder öl) mit sich ändernden Konzentrationen reagiert mit den Reagensen (einschließlich eines oxidierenden Enzyms) zur Verwendung bei dem herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen der Komponente beim Vorliegen von Bilirubin-Oxidase oder Lakkase zusammen mit den genannten Additiven wie auch, wenn nötig, Natriumfluorid, Phenanthrolin oder Hydroxylamin. Danach wird die Absorptionsfähigkeit jeder Reaktionsmischung gemessen. Die gemessenen Werte werden gegen die jeweiligen Konzentrationen der Komponente zum Aufbauen einer Eichkurve eingesetzt, die die Beziehung zwischen diesen darstellt. ■
- 13 -
Somit wird die Probe einer biologischen Flüssigkeit mit einer unbekannten Konzentration der Komponente der Reaktion in der beschriebenen Weise unterworfen und es wird die Absorptionsfähigkeit der Reaktionsmischung gemessen. Die Konzentration der Komponente in der Probe kann dann durch Vergleichen des gemessenen Wertes mit der Eichkurve errechnet werden.
Unter den physiologischen Komponenten, die bei diesem Verfahren untersucht werden sollen, sind neutra-Ie Fette, freie Fettsäuren und Phaspholipide genannt, wie es aus den folgenden Beispielen zu entnehmen ist, wie Triolein, Oleinsäure und Cholie-Chlorid, wie es in solchen Fällen üblich ist. Die zu untersuchenden physiologischen Komponenten sind beim vorliegenden Verfahren durchweg im Handel in Form von Kristellen, Puder oder Oil erhältlich und die kommerziellen Herstellungen dienen zum Aufbau der jeweiligen Eichkurve bei diesen Beispielen.
Bei den Verfahren zum Bestimmen der physiologischen Komponenten run'l» <l«xr Erfindung kann die Bilirubin-Oxidase entweder vom Myrothecium-Ursprung oder vom Coprinus-Ursprung verwendet werden. In ähnlicher Weise kann Lakkase verwendet werden, die entweder aus einer Lackfabrik oder von kultivierten Materialien stammt. Besondere Beispiel der Additive sind dieselben, wie sie in Verbindung mit dem Verfahren zum Bestimmen des gesamten Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten aufgezählt worden sind. Die Menge von sowohl Bilirubin-Oxidase als auch die der Additiven können bei dem vorliegenden Verfahren verwendet werden und auch dieselben sein, wie sie in Verbindung mit dem Verfahren zum Be-
BAD
/3
stimmen des gesamten Bilirubins in biologischen Flüssigkeiten beschrieben worden sind. Natrium-Fluorid, Phenathrolin oder Hydroxylamin wird in einer solchen Menge verwendet, daß sich eine Konzentration von 0,5 bis 10 mM in der Eeaktionsmischung ergibt.
Die Erfindung wird ferner durch folgende Beispiele erläutert. Diese dienen jedoch nicht zum Beschränken des Umfangs der Erfindung.
Beispiel 1 (lu*nt Immun von konjugiertem Bilirubin)
Jeder wäßrigen Lösung von 0,1 ml von 0, 2,5 5»0 7»5 10,0 15,0 und 20,0 mg% Bilirubin (Kristalle) wurden 3 ml einer 0,1 tris-HC1-Pufferlösung (pH 8,4) mit Bilirubin-Oxidase von Myrothecium-Ursprung (0,1 U/ml) zugesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37 C 30 Minuten lang bebrütet und die Abnahme ihrer Absorptionsfähigkeit wurde gemessen. Die gemessenen Werte wurden gegen die jeweiligen Konzentrationen der Bilirubinlösungen eingesetzt, um eine Eichkurve zu erhalten (Figur 1).
Dann wurde eine Probe von Blutserum von 0,1 ml mit unbekannter Bilirubinkonzentration (fällt in den Bereich von 0 bis 20 mg% und danach dasselbe) in der beschriebenen Weise reagiert und die Absorptionsfähigkeitsabnähme der sich ergebenden Reaktionsmischung wurde gemessen. Durch Vergleich des Wertes mit der Eichkurve nach Figur 1 wurde der gernessere Wert mit der Eichkurve gemessen und die Bilirubinkonzentration im Beispiel zu 2,8 mg% errechnet.
- 15 -
ίο
Beispiel 2 (Bestimmen des gesamten Bilirubins)
jeder wäßrigen T-öeung von 0,1 ml aus O, 2,5 5»0 7,5 10, O 1i*,o und 20,0 mg% Bilirubins (Kristallen) wurden 3 ml einer Bilirubin-Oxidase von Myrothecium-Ursprung (0,1 u/ml) enthaltenden und Natrium Cholat (14 mM) -enthaltenden Pufferlösung zugesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37 C 30 Minuten lang bebrütet und ihre. Absorptionsfähigkeitsabnahme wurde bei 440 nm gemessen. Die gemessenen Wer- te wurden gegen die jeweiligen Konzentrationen der Bilirubinlösungen eingesetzt, wodurch eine der Figur 1 gleichen Eichkurve erhalten wurde.
Dann wurde eine Blutserumprobe mit einer unbekannten Bilirubinkonzentration in der beschriebenen Weise reagiert und die Absorptionsfähigkeitsabnahme der sich ergebenden Reaktionsmischung gemessen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mit der Eichkurve nach Figur 1 wurde die (gesamte ) Bilirubinkonzentration in der Probe zu 5»2 mg% errechnet.
Beispiel 3 (Bestimmen des Gesamtbilirubins)
Das Verfahren nach Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Bilirubin-Oxidase von Coprinus-Ursprung (3 mU/ml), Lakkase mit Polyporus-Ursprung (0,1 mU/ml) oder Lakkase aus einer Lackfabrik (1 mU/ ml) anstelle von Bilirubin-Oxidase mit Myrothecium-Ursprung verwendet werden. Es wurde in allen Fällen eine Eichkurve ähnlich der nach Figur 1 erhalten. Die Menge des gesamten Bilirubins in der Blutserumprobe wurde auf 5,3 mg% bzw. 5,1 mg% geschätzt.
- 16 -
©AD ORIGINAL
Beispiel 4 (Bestimmen von Glukose im Blutserum)
Jeder wäßrigen Lösung von 0,02 ml aus 0, 100, 200 und 400 mg% Glukose wurden 3 ml von 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7»5) mit den Reagenzen zur Verwendung bei herkömmliehen Verfahren zum Bestimmen von Glukose in biologischen Flüssigkeiten, d.h. Aminoantipyrin (0,4mH), Phenol (15MH), Glukose-Oxidase (17 U/ml) und Peroxidase (0,3 U/ml) wie auch Biliburin-Oxidase von Myrοthecium-Ursprung (0,1 U/ml) und Natrium-Cholat (14mH) zugesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37°C 20 Minuten lang bebrütet und ihre Absorptionsfähigkeiten bei 505 nm gemessen. Die gemessenen Werte wurden gegen die Jeweiligen Konzentrationen der Glukoselösungen eingesetzt und es wurde eine Eichkurve (Figur 2) erhalten. Dann wurde eine Blutserumprobe mit unbekannter Glukosekonzentration (und einer gesamten Bilirubinkonzentration von 12,5 mg%) in der beschriebenen Weise der Reaktion ausgesetzt und die Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktionsmischung gemessen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mit der Eichkurve nach Figur 2 wurde die Glukosekonzentration in der Probe zu 96,1 mg% errechnet. Als Kontrolltest wurde dieses Verfahren wiederholt mit der Ausnahme, daß keine Bilirubin-Oxidase und kein Natrion-Cholat beigegeben wurde, wodurch die Glukosemenge in der Probe auf 90,2 mg% geschätzt wurde. Dieses Verfahren wurde noch einmal wiederholt, aber Natrium-Fluorid (ImM) diente in diesem Fall als zusätzlicher Reagens. Obwohl die Form der Eichkurve und die geschätzte Glukosemenge in der Probe gegen die im vorliegenden Beispiel nicht verändert wurden, war der Testwert so niedrig wie gewöhnlich bei der Messung der Absorptionsfähigkeit der Reaktionsmischungen.
Il
Beispiel 5
Das Verfahren des Beispiels 4 wurde wiederholt mit Ausnahme, daß Bilirubin-Oxidase von Coprinus-Ursprung (3 mM/ml), Lakkase von Polyporus-Ursprung (0,1 mU/ml) oder Lakkase aus der Lackfabrik (1 mU/ml) anstelle von Bilirubin-Oxidase mit Myrothecium-Ursprung verwendet wurde. Es ergab sich in allen Fällen eine der Figur 2 ähnliche Eichkurve. Die Glukosemenge in der Blutserumprobe wurde auf 95»8 mg% und 95 > 9 mg% geschätzt.
Beispiel 6 (Bestimmen des gesamten Cholesterol im Blutserum)
Jeder Dioxanlösung von 0,02 ml aus , 100, 200 und 400 mg% Cholesterol (Kristalle) wurden 3 ml von 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 715) mit den Reagensen zur Verwendung beim herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen des gesamten Cholesterolgehalts in biologischen Flüssigkeiten, d.h. 4 Aminoantipyrin (0,4 mM), Phenol (I5 mM), Cholesterol-Esterase (1 U/ml) Peroxidase (6,0 U/ml) und Triton X-100 (Warenzeichen der Fa. Wako Pure Chemical Industries Ltd.) wie auch Bilirubin-Oxidase von mit Myrothecium-Uruprung (0,1 U/ml), Natriumdodecylsulfat (2,5 mM) und Natriumfluorid (2,5 mM) zugesetzt.
Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37° 20 Minutenlang bebrütet und ihre Absorptionsfähigkeit wurde gemessen. Die gemessenen Werte wurden gegen die jeweiligen Konzentrationen des Cholesterollösungen eingesetzt und so wurde eine Eichkurve (Figur 3 erhalten.
Dann wurden eine Blutserumprobe von 0,02 ml mit einer unbekannten Gesamtcholesterolkonzentration (und einer
Gesamtbilirubinkonzentration von 15,2 mg%) in derselben Weise der Reaktion ausgesetzt und es wurde die Absorptionsfälligkeit der sich ergebenden Reaktionsmischung gemessen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mit der Eichkurve nach Figur 3 wurde die Gesamtcholesterolkonzentration zu 163 mg% errechnet. Als Kontrolltest wurde dieses Verfahren mit der Ausnahme wiederholt, daß die Baigabe von Bilirubin-Oxidase, Natriumdedecylsulfat und Natriumfluorid weggelassen worden ist, wodurch die Menge des gesamten Gholesterols in der Probe auf 145 mg% geschätzt wurde,
Beispiel 7 (Bestimmen des gesamten Cholesterols im Blutserum)
Das Verfahren nach Beispiel 6 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß Bilirubin-Oxidase von Coprinus-Ursprung (3 mU/ml), Lakkase von Polyporus-Ursprung oder Lakkase aus der Lackfabrik (1 mU/ml) anstelle von Bilirubin-Oxidase von Myrothecium-TJrsprung verwendet wurde. Es ergab sich in allen Fällen eine der Figur 3 ähnliche Eichkurve. Die gesamte Cholesterolmenge in der Blutserumprobe wurde auf 160 mg%, 163 . und 160 mg% geschätzt.
Beispiel 8 (Bestimmen der neutralen Fette (wie Triolin) im Blutserum)
Jeder Azetonlösung von 0,02 ml aus 0, 100, 200, und 400 mg% Triolin (öl) wurden 3 ml einer 0,1 M-Trispufferlösung (pH 7»5) mit den Reagensen zur Verwendung beim herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen neutraler Fette in biologischen Flüssigkeiten, d.h. 4-Aminoantpyrin (0,4 mM) Phenol (I5 mM) Lipopotein-Lipase (200 U/ml),
- 19—
Glycerol-Kinase (0,3 U/ml), Glycerol-3-Phosphate-Oxidase (4 U/ml), Peroxidase (2 U/ml), Adebosin-Trophosphat (0,8 mM) und Triton X-100 (0,1%) wie auch Bilirubin-Oxidase von Coprinus-Ursprung(0,05 U/ml), Natriumcholat (14 mM) und Phenanthrolin (2,5 U/mM) zugesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 370C 20 Minutenlang bebrütet und ihre Absorptionsfähigkeit wurde bei 505 nm gemessen. Die gemessenen Werte wurden gegen die jeweiligen Konzentrationen der Triolinlösungen eingesetzt, um eine Eichkurve zu erhalten. (Figur 4).
Dann wurde eine Blutserumprobe von 0,02 ml mit unbekannter Fettkonzentration (und einer Gesamtbilirubinkonzentration von 14.2 mg%) der Reaktion in der beschrie· benen Weise ausgesetzt und die Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktionsmischung gemessen. Durch Vergleich de-s gemessenen Wertes mit der Eichkurve nach Figur 4 wurde die Konzentration der neutralen Fette zu 78»0 mg% Triolin errechnet. Als Kontrolltest wurde dieses Verfahren mit der Ausnahme wiederholt, daß keine Bilirubin-Oxidase, kein Natriumcholat und kein Phenthrolin ituK«K«b«n worden ist, wodurch die Menge der neutralen Fette in der Probe auf 68,6 mg% geschätzt wurde.
Beispiel 9 (Bestimmen der freien Fettsäuren (wie
ölische Säure) im Blutserum)
Jeder ethanolischen Lösung von 0,02 ml aus 0, 250, 5OO und 100 uE^/1 Oleinsäure (öl) wurden 3 ml einer Pufferlösung (pH 6,75) mit den Reagensen zur Verwendung bei der herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen von freien
- 20 -
BAD ORIGINAL
IS
Fettsäuren in biologischen Flüssigkeiten, d.h. Azylcoenzym-A-Synthetase (0,4 U/ml), Azylcoenzym-A-Oxidase (5 U/ml), Peroidas (5 U/ml), Adenorintriphosphat (4 uM), koenzym A (0,5 uM)T Farbbilder MMX (Warenzeichen der Fa. Kyowa-Medix Co.) (5OuM) und Triton X-IOO (0,1%) wie auch Bilirubin-Oxidase mit Myrithecium-Ursprung (0,1 U/ml), Natriumcholat (14 mM) und Natriumfluorid (2,5 mM) beigegeben. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 37 C 10 Minuten lang inkubiert und ihre Absorptionsfähigkeit wurde bei 660 nm gemessen. Die gemessenen Werte wurden gegen die jeweiligen Konzentrationen der Oleinsäure - Lösungen eingesetzt und so wurde eine Eichkurve (Figur 5) erhalten.
Dann wurden 0,02 ml einer Blutserumsprobe mit unbekannter freien Fettsaurekonzentration (und einer Gesamtbilirubinkönzentration von 10,8 mg%) der Reaktion in der beschriebenen Weise ausgesetzt und es wurde die Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktionsmischungen gemessen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mitder Eichkurve nach Figur 5 wurde die Konzentration der freien Fettsäure in der Probe zu 210 uEq/1 als Oleinsäure errechnet. Als Kontrolltest wurde das beschriebene Verfahren mit der Ausnahme wiederholt, daß die Beigabe von Bilirubin-Oxidase, iTatriumcholat und Natriumf luorid weggelassen wurden, wodurch die Menge freier Fettsäure in der Probe auf 182 uEq/1 geschätzt wurde.
Beispiel 10 (Bestimmen von Phospholipiden -als Cholinchorid- im Blutserum)
Jeder wäßrigen Lösung von 0,02 ml aus 0, I50, 3OO, 450, ·
• - 21 -
600 und 900 mg% Cholinchlorid (Puder) wurden 0,3 ml einer 0,1 M-Phosphatpufferlösung -(pH 7iO) mit den Reagensen zur Verwendung bei dem üblichen Verfahren zum Bestimmen von Phoapholipiden in biologischen Flüssigkeiten, d.h. 4-Aminoantipyrin (0,4 mM), Phenol (15 m M), Phospholipase D (800 U/ml), Cholin-Oxidase 61 u/+m17 und Peroxides (2 U/ml) Natriumdodecylsulfat (2,5 mM) und Phenanthrolin (2,5 mM) zugesetzt. Die sich ergebenden Mischungen wurden bei 370C 20 Minuten lang bebrütet und ihre Absorptionsfähigkeit bei 500 nm wurde gemessen. Die gemessenen Werte wurden dann gegen die jeweiligen Konzentrationen der Cholinchloridlösungen zum Erhalt einer Eichkurve (Figur 6) eingesetzt.
Dann wurde eine Blutserumprobe von 0,02 ml mit unbekannter Phospholipidkonzentration (und eine Gesamtbilirubinkonzentration von 14,1 mg%) in der beschriebenen Weise der Reaktion ausgesetzt, und die Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktionsmischungen gemessen. Durch Vergleich des gemessenen Wertes mit der Eichkurve nach Figur 6 wurde die Phospholipidkonzentration in der Probe zu 277 mg% als Cholinchlorid errechnet. Als Kontrolltest wurde dieses Verfahren mit der Ausnahme wiederholt, daß die Beigabe von Bilirubin-Oxidase, Natriumdodecylsulfat und Phenant-hrolin weggelassen wurde, wodiaeh die Menge Phospholipid in der Probe auf 262 mg% geschätzt wurde.
BAD ORIGINAL
Leerseite

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    / 1 ,yVerf ahren zum quantitativen Bestimmen von konjugiertem Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten gekennzeichnet durch folgende Schritte:
    a) Reagieren jeder von wäßrigen Lösungen aus Bilirubin mit sich ändernden Konzentrationen mit Bilirubin-Oxidase, die von einem Mikroorganismus mit Ursprung von der Art Myrothecium zum Erstellen einer Eichkurve, die die Beziehung zwischen der Absorptionsfähigkeit der Reaktionsmischung und der Konzentration des Bilirubin darstellt;
    b) Veranlassen des Reagierens einer biologischen Flüssigkeit mit unbekannter Bilirubinkonzentration mit Bilirubin-Oxiden, die von einen Mikroorganismus der Art Myrotheeium gewonnen wird, und Messen der Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktionsmischung; und
    TELEX. TELEGRAMM TELEFON BANKKONTO: POSTSCHECKKONTO 1-85644 INVENTION BERLIN BERLINERBANKAG. P MEISSNER BLN-W inven d BERLIN 030/891 60 37 BERLIN 31 404737-103 030/89130 26 3695716000
    c) Errechnen der Bilirubinkonzentration in der
    biologischen Flüssigkeit durch Vergleichen des
    gemessenen Wertes, der beim Schritt b) aus der
    Eichkurve gewonnen wird.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
    a) Reagieren jeder von wäßigen Lösungen von Bilirubin mit sich änderenden Konzentrationen mit Bilirubin-Oxidase oder - Lakkase bei Bestehen von mindestens einem Additiv, das aus der Gruppe aus oberflächenaktiven Agensen, aromatischen karbolischen Säuren, Sulfa-Drogen und Proteasen zum Erstellen einer Eichkurve, die
    die Beziehung zwischen der Absorptionsfähigkeit der
    Reaktionsmischung und der Konzentration von Bilirubin darstellt;
    b) Veranlassen des Reagierens einer biologischen
    Flüssigkeit mit einer unbekannten Bilirubinkonzentration mit Bilirubin-Oxidase oder -Lakkase beim Bestehen des Additivs und Messen der Absorptionsfähigkeit der.
    sich ergebenden Reaktionsmischung; und
    c) Errechnen der Bilirubinkonzentration in der biologischen Flüssigkeit durch Vergleichen des beim Schritt b) erhaltenen gemessenen Wertes mit der Eichkurve.
    5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bilirubin-Oxidase ein Enzym
    ist, das von einem Mikroorganismus mit Ursprung der
    Art Myrothecium oder Goprinus ist.
    4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lakkase ein Enzym entweder
    BAD ORIGINAL
    aus einer Lackfabrik oder aus kultivierten Materialien eines Basidiomycets stammt.
    5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die benötigte Enzymmenge so groß ist, daß seine Konzentration in der Reaktionsmischung gleich 0,003 bis 0,40 U/ml für Bilirubin-Oxidase oder 0,06 bis 7>0 mU/ml für Lakkase ist.
    6. Verfahren nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet, daß das Additiv mindestens eine Verbindung aus der Gruppe von Natriumcholat, taurocholischer Säure und sulfosalicylischer Säure ist.
    7« Verfahren nach Anspruch 6, dadurch g e k e η η ζ e i c hne t, daß Natriumdodecylsulfat in einer solchen Menge verwendet wird, daß sich eine Konic zentration von 0,5 bis 10 mM in der Reaktionsmischung ergibt.
    8. Verfahren nach Anspruch 6,dadurch gekennzeichnet, daß Natriumcholat in einer solchen Menge verwendet wird, daß sich eine Konzentration von 2 bis 30 mM in der Reaktionsmischung ergibt.
    9. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Herstellen mehrerer Lösungen aus einer physiologischen Komponente mit sich änderden Konzentrationen, von denen jede die Reagensen (einschließlich eines oxidierenden Enzyms) zur Verwendung beim herkömmlichen Verfahren zum Bestimmen dieser Komponente wie auch von Bilirubin-Oxidase oder -Lakkase und mindestens einem
    Additiv aus der Gruppe von oberflächenaktiven Agensen, aromatischen karbolischen Säuren, SuIfa-Drogen und Poteasen und somit Erstellen einer Eichkurve, die die Beziehung zwischen der Absorptionsfähigkeit der Reaktionsmischung und der Konzentration dieser Komponente darstellt;
    b) Aussetzen einer biologischen Flüssigkeit mit einer unbekannten Konzentration der Komponente zur Reaktion in derselben Weise wie unter a) und Messen der Absorptionsfähigkeit der sich ergebenden Reaktionskurve ; und
    c) Errechnen der Konzentration der Komponente in der biologischen Flüssigkeit durch Vergleichen des beim Schritt b) erhaltenen gemessenen Wertes mit der Eichkurve.
    10. Verfahre-n nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, daß in den Schritten a) und b) eine Verbindung aus der Gruppe von ITatriumfluorid, Phenathrolin und Hydroxylamin der Reaktionssystem beigegeben wird.
    11. Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das oxidierende Enzym, das in den Reagenten zum Bestimmen der Komponente enthalten iat, ein Glied aus der Gruppe aus Glukose-Oxidase, Harnatoff, Azyloenzym A-Oxidase, Cholin-Oxidase und Glycerol-3-Phosphat-Oxidase ist.
    12. Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß Bilirubin-Oxidase ein Enzym ist, das von einem Mikroorganismus mit Ursprung ■
    BAD ORIGINAL
    aus der Art Myrothecium oder Coprinus ist.
    13. Verfahren nach, den Ansprüchen 9 und 10, da durch gekennzeichnet, daß die Lakkase ein Enzym ist, das aus einer Lackfabrik oder aus kultivierten Materialien eines Basidiomycets ist.
    14. Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, d a durch gekennzeichnet, daß die verwendete Menge von Bilirubin-Oxidase oder.Lakkase so groß ist, daß seine Konzentration gleich 0,003 bis 0,40 U/ml für Bilirubin-Oxidase oder 0,06 bis 7,0 mU/ ml für Lakkase ist.
    15. Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Additiv mindestens eine Verbindung aus der Gruppe von Natriumcholat, taurocholiachor GHure, Natriumdodecylsulfat, p-toluenesulfonischer Säure, Salicylsäure und SuIf©salicylsäure ist.
    16. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß Natriumdodecylsulfat in einer solchen Menge verwendet wird, daß sich eine Konzentration von 0,5 bis 10 mM in der Reaktionsmischen ergibt.
    17. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch ge kennzeichnet, daß Natriumcholat in einer solchen Menge verwendet wird, daß sich eine Konzentration von 2 bis 30 mM in der Reaktionsmischung ergibt.
    18. Verfahren nach Anspruch 10,dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung aus der Gruppe von Natriumfluorid, Phenanthrolin und Hydroxylamin in einer solchen Menge benutzt wird, daß sich eine Konzentration von 0,5 bis 10 mM in der Reaktionsmischung ergibt .
DE19823239236 1982-02-18 1982-10-20 Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen Granted DE3239236A1 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP57025613A JPS6012032B2 (ja) 1982-02-18 1982-02-18 ビリルビンオキシダーゼｎｓ―１
JP12763282A JPS5917999A (ja) 1982-07-23 1982-07-23 ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物
JP12763382A JPS5918000A (ja) 1982-07-23 1982-07-23 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3239236A1 true DE3239236A1 (de) 1983-09-01
DE3239236C2 DE3239236C2 (de) 1990-09-27

Family

ID=27285077

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19823239236 Granted DE3239236A1 (de) 1982-02-18 1982-10-20 Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen
DE3249743A Expired - Fee Related DE3249743C2 (de) 1982-02-18 1982-10-20

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3249743A Expired - Fee Related DE3249743C2 (de) 1982-02-18 1982-10-20

Country Status (5)

Country Link
US (2) US4554249A (de)
CA (1) CA1185883A (de)
DE (2) DE3239236A1 (de)
FR (1) FR2521589B1 (de)
GB (2) GB2115926B (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR890100007A (el) * 1988-01-11 1994-03-31 Massachusetts Inst Technology Θεραπεία χολερυ?ρίνης απο του στόματος.
US5624811A (en) * 1993-03-24 1997-04-29 Boehringer Mannheim Gmbh Bilirubin oxidase from alfalfa and use of the enzyme
US7504243B2 (en) 2004-03-19 2009-03-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for the production of biliverdin

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59125899A (ja) * 1982-12-29 1984-07-20 Nippon Shoji Kk 酵素法による直接ビリルビン測定用試薬および測定法
JPS59135886A (ja) * 1983-01-25 1984-08-04 Takara Shuzo Co Ltd ビリルビン・オキシダ−ゼの製造法
JPS59198971A (ja) * 1983-04-28 1984-11-10 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ビリルビンオキシダ−ゼの製造法
US4701411A (en) * 1983-09-01 1987-10-20 Eastman Kodak Company Bilirubin-specific enzyme preparation, assay compositions, analytical elements and methods using same
US4600689A (en) * 1983-11-21 1986-07-15 Takara Shuzo Co., Ltd. Novel bilirubin oxidase, its production and use
JPS60162957A (ja) * 1984-02-03 1985-08-24 Kyowa Medetsukusu Kk セルロプラスミン活性の測定法
EP0355864A3 (de) * 1984-03-15 1991-09-18 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Verfahren zur quantativen Bemessung von oxydativen Agenzien durch Verwendung von Triphenylmethanleucoverbindungen als Farbstoffe
WO1986000933A1 (en) * 1984-07-28 1986-02-13 Beckman Instruments, Inc. Novel reagent and method employing same
DE3608453A1 (de) * 1986-03-14 1987-09-17 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur enzymatischen bestimmung von bilirubin im serum
US4876207A (en) * 1988-02-16 1989-10-24 Eastman Kodak Company Compositions for the detection of high levels of hydrogen peroxide
JP2856757B2 (ja) * 1989-03-13 1999-02-10 ユニチカ株式会社 総ビリルビンの測定方法および測定用試薬
JPH0771515B2 (ja) * 1989-12-18 1995-08-02 日本商事株式会社 ビリルビンの光学的測定法および測定用試薬
US5296377A (en) * 1992-12-15 1994-03-22 Boehringer Mannheim Corporation Control reagent containing a hydroxylamine or an antioxidant
US5385844A (en) * 1993-04-22 1995-01-31 Boehringer Mannheim Corporation Polymer containing control reagents and polymers useful in control reagents
US5667531A (en) * 1995-05-15 1997-09-16 Novo Nordisk A/S Dye compositions containing purified polyporus laccases and nucleic acids encoding same
KR970022316A (ko) * 1995-10-27 1997-05-28 후루야 아끼라 빌리루빈의 정량 방법
US5783407A (en) * 1996-04-05 1998-07-21 Beckman Instruments, Inc. Method of measuring bilirubin
GB9611011D0 (en) * 1996-05-25 1996-07-31 Cme Telemetrix Inc Measurement of bile pigments in serum or plasma
CA2535526C (en) 2003-08-11 2015-09-29 Diversa Corporation Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN101622359B (zh) * 2007-04-27 2012-10-31 爱科来株式会社 胆红素测定方法以及用于胆红素测定的分析用具
EP2549264A1 (de) * 2011-07-18 2013-01-23 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Verfahren und System zum Bestimmen der Konzentration von Substanzen in Körperflüssigkeiten
EP2843054B1 (de) * 2012-04-27 2021-04-07 Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co., Ltd. Verfahren zur überprüfung einer zu überprüfenden komponente in einem prüfobjekt
US20150260631A1 (en) * 2014-03-17 2015-09-17 Health Diagnostic Laboratory, Inc. System and method for assessing quanitites or sizes of lipoprotein particles from lipoprotein particle compositions

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US978003A (en) * 1910-01-21 1910-12-06 Ferdinand Burchartz Apparatus for making hollow building-blocks.
DE2625834B2 (de) * 1976-06-09 1978-10-12 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten
EP0005637A2 (de) * 1978-05-19 1979-11-28 EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) Bilirubin-spezifische pilzartige Enzymezusammensetzungen, Anwendung derselben bei trockenen Testelementen und bei Versuchsverfahren und Verfahren zum Extrahieren derselben

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4186251A (en) * 1973-03-01 1980-01-29 Miles Laboratories, Inc. Composition and method for determination of cholesterol
DE2361169C3 (de) * 1973-12-07 1978-09-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur Aktivierung von von Detengensspuren befreiter Cholesterinoxydase
DK146287C (da) * 1976-10-18 1984-01-30 Radiometer As Fremgangsmaade til deoxygenering af et blodproevemateriale og kapillarroer til anvendelse ved fremgangsmaaden
US4291121A (en) * 1979-04-13 1981-09-22 Miles Laboratories, Inc. Bilirubin-resistant determination of uric acid and cholesterol
JPS59125899A (ja) * 1982-12-29 1984-07-20 Nippon Shoji Kk 酵素法による直接ビリルビン測定用試薬および測定法
US4701411A (en) * 1983-09-01 1987-10-20 Eastman Kodak Company Bilirubin-specific enzyme preparation, assay compositions, analytical elements and methods using same
US4600689A (en) * 1983-11-21 1986-07-15 Takara Shuzo Co., Ltd. Novel bilirubin oxidase, its production and use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US978003A (en) * 1910-01-21 1910-12-06 Ferdinand Burchartz Apparatus for making hollow building-blocks.
DE2625834B2 (de) * 1976-06-09 1978-10-12 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten
EP0005637A2 (de) * 1978-05-19 1979-11-28 EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) Bilirubin-spezifische pilzartige Enzymezusammensetzungen, Anwendung derselben bei trockenen Testelementen und bei Versuchsverfahren und Verfahren zum Extrahieren derselben

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Agric. Biol. Chem. 45, (10), 1981, 2383-2384
Agric. Biol. Chem. 45, 2383-2384, 1981 *
Chemical Abstracts 71, 119962w, 1969 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR890100007A (el) * 1988-01-11 1994-03-31 Massachusetts Inst Technology Θεραπεία χολερυ?ρίνης απο του στόματος.
US5624811A (en) * 1993-03-24 1997-04-29 Boehringer Mannheim Gmbh Bilirubin oxidase from alfalfa and use of the enzyme
US7504243B2 (en) 2004-03-19 2009-03-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for the production of biliverdin
US8344019B2 (en) 2004-03-19 2013-01-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for the production of biliverdin

Also Published As

Publication number Publication date
GB2115926A (en) 1983-09-14
US4839279A (en) 1989-06-13
DE3249743A1 (de) 1985-07-04
GB8431875D0 (en) 1985-01-30
DE3239236C2 (de) 1990-09-27
FR2521589A1 (fr) 1983-08-19
GB2152215A (en) 1985-07-31
DE3249743C2 (de) 1990-10-04
GB2115926B (en) 1986-03-05
US4554249A (en) 1985-11-19
CA1185883A (en) 1985-04-23
FR2521589B1 (fr) 1986-05-30
GB2152215B (en) 1986-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3239236A1 (de) Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen
EP0186134B1 (de) Mittel zur Verbesserung des Nachweises Wasserstoffperoxid liefernder Oxidase-Reaktionen und seine Verwendung
DE2265122C2 (de) Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin
DE69021389T2 (de) Verfahren und reagenz zur bestimmung eines analyten auf enzymatischem wege mittels eines eisen-iii-zyan /eisen -iii-verbindungssystems.
DE2847202A1 (de) Verfahren zur bestimmung von triglyceriden
DE3436005C2 (de) Neue Bilirubinoxidase, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Reagenszubereitung
DE2653537C3 (de) Verfahren und Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden
DE69830556T2 (de) Verfahren zur Bestimmung von glykosylierten Proteinen
DE2512266A1 (de) Verfahren zur bestimmung von triglyceriden und glycerin
DE69026611T2 (de) Verfahren zur Bestimmung von Fruktosaminen
DE69433003T2 (de) Assayverfahren für biologische Komponenten
DE4321807C2 (de) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol und Testpack
EP0105443B1 (de) Verfahren zur selektiven Herstellung reduzierter Sauerstoffspezies und hierfür geeignete Reagentien
DE2224132B1 (de) Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin
DE1498901A1 (de) Diagnostisches Mittel und Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Harnsaeure im Blut
DE2737288C2 (de) Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten sowie Bestimmungsreagenz für die Durchführung des Verfahrens und Bestimmungsreagenz für die Bestimmung von Adenosintriphosphat
DE3781008T2 (de) Verfahren zur messung von wasserstoffperoxid oder zur messung eines peroxidfreimachenden enzyms oder biochemischen substrats.
DE3138602C2 (de)
CH651318A5 (de) Verfahren und reagenz zur bestimmung der peroxidase.
DE2558536B2 (de) Verfahren zur kinetischen Substratbestimmung und Reagens zu seiner Durchführung
DE2944498C2 (de) Methode zur quantitativen Bestimmung von Acyl-Coenzym A und Reagens hierfür
DE2612725B2 (de) Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin
DE2804356C2 (de) Verfahren zur Hydrolyse von proteingebundenen Cholesterinestern
DE4306278A1 (en) Rapid determn. of 1,5-anhydro:glucitol for diabetes diagnosis - by reaction with pyranose oxidase and measuring amt. of hydrogen peroxide formed
DE2737290A1 (de) Analytisches verfahren zur bestimmung einer substanz in einer fluessigkeit

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8172 Supplementary division/partition in:

Ref country code: DE

Ref document number: 3249743

Format of ref document f/p: P

Q171 Divided out to:

Ref country code: DE

Ref document number: 3249743

AH Division in

Ref country code: DE

Ref document number: 3249743

Format of ref document f/p: P

D2 Grant after examination
AH Division in

Ref country code: DE

Ref document number: 3249743

Format of ref document f/p: P

8364 No opposition during term of opposition