JPS5918000A - 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物 - Google Patents
生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物Info
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- JPS5918000A JPS5918000A JP12763382A JP12763382A JPS5918000A JP S5918000 A JPS5918000 A JP S5918000A JP 12763382 A JP12763382 A JP 12763382A JP 12763382 A JP12763382 A JP 12763382A JP S5918000 A JPS5918000 A JP S5918000A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生体成分の測定法に関し、よシ詳しくは、特に
反応により生成した過酸化水素をｉ９−オキシダーゼの
存在下比色定量する際に共存するビリルビンの反応干渉
を回避又は軽減することを特徴とする生体成分の測定法
及びそれに用いる試薬組成物に関する。
反応により生成した過酸化水素をｉ９−オキシダーゼの
存在下比色定量する際に共存するビリルビンの反応干渉
を回避又は軽減することを特徴とする生体成分の測定法
及びそれに用いる試薬組成物に関する。
近年、臨床化学分析における酵素的分析法の進歩はめざ
ましく、グルコースオキシダーゼ６、コレステロールオ
キシダーゼ、ウリカーゼ、アシルコエンザイムＡオキシ
ダーゼなどの酸化酵素が広範に用いられている。これら
酸化酵素の作用で生成した過酸化水素はツク−オキシダ
ーゼ−水素供与体系を用いる方法で比色定量されるのが
常である。
ましく、グルコースオキシダーゼ６、コレステロールオ
キシダーゼ、ウリカーゼ、アシルコエンザイムＡオキシ
ダーゼなどの酸化酵素が広範に用いられている。これら
酸化酵素の作用で生成した過酸化水素はツク−オキシダ
ーゼ−水素供与体系を用いる方法で比色定量されるのが
常である。
ツク−オキシダーゼを用いる反応系においては、生体試
料中に存在する種々の還元物質、投与薬剤。
料中に存在する種々の還元物質、投与薬剤。
生体色素などにより干渉を受は易い。これら干渉物質の
なかで、ビリルビンによる干渉については、例えば臨床
化学第８巻、６３〜７２に一ジ、１９７９年に記載され
ている。これによるとビリルビンによる干渉の機序とし
ては、 （１）ビリルビンの吸収による直接的影響（２）ビリル
ビンがパーオキシダーゼの水素供与体となる （３）生成された呈色色素に直接的に作用して分解する などが考えられている。
なかで、ビリルビンによる干渉については、例えば臨床
化学第８巻、６３〜７２に一ジ、１９７９年に記載され
ている。これによるとビリルビンによる干渉の機序とし
ては、 （１）ビリルビンの吸収による直接的影響（２）ビリル
ビンがパーオキシダーゼの水素供与体となる （３）生成された呈色色素に直接的に作用して分解する などが考えられている。
ビリルビンの血清中濃度は、正常人では１ｍｆ／ｄ６以
下であるが、病的には２０ｍｙ／ｄｌに達することもあ
り、臨床検査上その影響は重大な問題である。
下であるが、病的には２０ｍｙ／ｄｌに達することもあ
り、臨床検査上その影響は重大な問題である。
これらの問題に関する公知技術としては、例えばグルコ
ースオキシダーゼ−Ａ−オキシダーゼ系によりグルコー
スを定量する方法においてフェロシアン化物を用いる方
法（特公昭５５−２５８４０号公報及びクリニカルケミ
ストリー第２６巻、２２７〜２３１−！！−ジ、１９８
１年）、ウリカーゼ−〆ぐ一オキシダーゼ系により尿酸
を定量する方法においてフェロシアン化イオンを用いる
方法（特開昭５５−１３８６５６号公報）、ピクリン酸
との反応で尿酸を定量する方法においてアスコルビン酸
によりビリルビンの酸化を阻止する方法（特開昭５５−
２９７１８号公報）、多波長光度計を用いてビリルビン
による干渉を補正する方法（特開昭５６−’１０４２３
９号公報）、過酸化水素−パーオキシダーゼ系によシ血
清成分を測定する方法においてＥＤＴＡ−鉄錯体を添加
する方法（特開昭５７−７１３９８号公＠）など、及び
特開昭５４−１５１１９３号公報にはビリルビン特異性
菌性酵素組成物によりビリルビンを減成せしめる方法に
ついて記載されている。最後に述べたビリルビン特異性
菌性酵素組成物はビリルビンに反応し、５２５ｎｍの螢
光を発する物質及び過酸化水素を生成する。従って本酵
素組成物は本発明の目的とする過酸化水素−・や−オキ
シダーゼ系に対するビリルビンの干渉の回避又は軽減法
としては有利な方法ではない。
ースオキシダーゼ−Ａ−オキシダーゼ系によりグルコー
スを定量する方法においてフェロシアン化物を用いる方
法（特公昭５５−２５８４０号公報及びクリニカルケミ
ストリー第２６巻、２２７〜２３１−！！−ジ、１９８
１年）、ウリカーゼ−〆ぐ一オキシダーゼ系により尿酸
を定量する方法においてフェロシアン化イオンを用いる
方法（特開昭５５−１３８６５６号公報）、ピクリン酸
との反応で尿酸を定量する方法においてアスコルビン酸
によりビリルビンの酸化を阻止する方法（特開昭５５−
２９７１８号公報）、多波長光度計を用いてビリルビン
による干渉を補正する方法（特開昭５６−’１０４２３
９号公報）、過酸化水素−パーオキシダーゼ系によシ血
清成分を測定する方法においてＥＤＴＡ−鉄錯体を添加
する方法（特開昭５７−７１３９８号公＠）など、及び
特開昭５４−１５１１９３号公報にはビリルビン特異性
菌性酵素組成物によりビリルビンを減成せしめる方法に
ついて記載されている。最後に述べたビリルビン特異性
菌性酵素組成物はビリルビンに反応し、５２５ｎｍの螢
光を発する物質及び過酸化水素を生成する。従って本酵
素組成物は本発明の目的とする過酸化水素−・や−オキ
シダーゼ系に対するビリルビンの干渉の回避又は軽減法
としては有利な方法ではない。
本発明者らは生体成分測定に際し、共−存するビリルビ
ンによる干渉を回避又は軽減する方法について鋭意検討
した結果、数種の酵素にそのような作用のあることを見
い出した。これらの酵素とは、ビリルビンオキシダーゼ
、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アスコルビン酸オキシダ
ーゼである。これら酵素はすべて、反応により過酸化水
素を生成しない。又、ビリルビンオキシダーゼは本発明
者らが新しく見い出した酵素であシ、他は本発明以前に
公知の酵素であるがビリルビンを酸化する作用があるこ
とは知られていなかった。
ンによる干渉を回避又は軽減する方法について鋭意検討
した結果、数種の酵素にそのような作用のあることを見
い出した。これらの酵素とは、ビリルビンオキシダーゼ
、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アスコルビン酸オキシダ
ーゼである。これら酵素はすべて、反応により過酸化水
素を生成しない。又、ビリルビンオキシダーゼは本発明
者らが新しく見い出した酵素であシ、他は本発明以前に
公知の酵素であるがビリルビンを酸化する作用があるこ
とは知られていなかった。
本発明の方法について以下詳述する。
本発明の実施態様の一つであるビリルビンオキシダーゼ
は、二種類供給することができる。その一つは、ミロセ
シウム属菌の生産するビリルビンオキシダーゼＮ５−１
として特願昭５７−２５６１３号に開示されている。本
ビリルビンオキシダーゼＭＳ−１はビリルビンを分子状
酸素の存在下に酸化し、緑色物質を生成するも過酸化水
素は生成しない。
は、二種類供給することができる。その一つは、ミロセ
シウム属菌の生産するビリルビンオキシダーゼＮ５−１
として特願昭５７−２５６１３号に開示されている。本
ビリルビンオキシダーゼＭＳ−１はビリルビンを分子状
酸素の存在下に酸化し、緑色物質を生成するも過酸化水
素は生成しない。
本酵素は直接型（グルクロナイド型）ビリルビンには作
用するが、アルブミンと結合した間接型ビリルビンには
作用しない。ビリルビンによる干渉の回避又は軽減のた
めにはこれら総ビリルビンを除去することが必要とされ
る。この問題の解決のためには界面活性剤、芳香族カル
ボン酸、サルファ剤又はプロテアーゼの添加が効果のあ
ることを見い出した。これら物質（以下反応促進物質と
いつ）ハビリルビンオキシダーゼＭＳ−１と間接型ビリ
ルビンとの反応を促進する働きがある本のと思われる。
用するが、アルブミンと結合した間接型ビリルビンには
作用しない。ビリルビンによる干渉の回避又は軽減のた
めにはこれら総ビリルビンを除去することが必要とされ
る。この問題の解決のためには界面活性剤、芳香族カル
ボン酸、サルファ剤又はプロテアーゼの添加が効果のあ
ることを見い出した。これら物質（以下反応促進物質と
いつ）ハビリルビンオキシダーゼＭＳ−１と間接型ビリ
ルビンとの反応を促進する働きがある本のと思われる。
界面活性剤としては陽イオイ、陰イオン。
非イオン、両性のいずれでも上記作用があればよく１例
えばショ糖脂肪酸エステル、胆汁酸塩、ドデシルＨ酸塩
、 ｐ−）ルエンスルホン酸、セチルビリノニウムクロ
ライド、ノニルフェノールエトキシレート系、ポリオキ
シエチレン−ポリオキシゾロピレン縮合物系などの界面
活性剤があげられる。芳香族カルボン酸の例としてはサ
リチル酸。
えばショ糖脂肪酸エステル、胆汁酸塩、ドデシルＨ酸塩
、 ｐ−）ルエンスルホン酸、セチルビリノニウムクロ
ライド、ノニルフェノールエトキシレート系、ポリオキ
シエチレン−ポリオキシゾロピレン縮合物系などの界面
活性剤があげられる。芳香族カルボン酸の例としてはサ
リチル酸。
スルホサリチル酸など、サルファ剤としてはスルファニ
ルアミド、アセトスルファミンナトリウムなど、プロテ
アーゼとしてはプロナーゼ（科研化学製）などがあげら
れる。
ルアミド、アセトスルファミンナトリウムなど、プロテ
アーゼとしてはプロナーゼ（科研化学製）などがあげら
れる。
ビリルビンオキシダーゼＮ５−１を用いるビリルビンの
干渉の回避又は軽減法は、具体的には生体成分の測定に
際し反応系にビリルビンオキシダーゼＮ５−１及び前記
反応促進物質を添加するだけでよい。
干渉の回避又は軽減法は、具体的には生体成分の測定に
際し反応系にビリルビンオキシダーゼＮ５−１及び前記
反応促進物質を添加するだけでよい。
これによシビリルビンは酸化されてビリルビン特有の黄
色が減少、消失するとともに、ビリベルジンに変化し、
パーオキシダーゼの水素供与体となったシ、色素に作用
することもない。なお酵素ビリルビンオキシダーゼＮ５
−１自身が発色系に作用する場合は、必要に応じ発色反
応阻害物質を添加すればよい。これら阻害物質はビリル
ビンオキシダーゼの発色系への作用は阻害するが、ビリ
ルビンへの作用は阻害してはならない。これを満足する
阻害剤としてはフッ化ナトリウム、フェナントロリンな
どがあげられる。
色が減少、消失するとともに、ビリベルジンに変化し、
パーオキシダーゼの水素供与体となったシ、色素に作用
することもない。なお酵素ビリルビンオキシダーゼＮ５
−１自身が発色系に作用する場合は、必要に応じ発色反
応阻害物質を添加すればよい。これら阻害物質はビリル
ビンオキシダーゼの発色系への作用は阻害するが、ビリ
ルビンへの作用は阻害してはならない。これを満足する
阻害剤としてはフッ化ナトリウム、フェナントロリンな
どがあげられる。
他の種類のビリルビンオキシダーゼは、本発明者らがス
クリーニングの結果コゾリナス属菌中に見い出したもの
である。本酵素はビリルビンオキシダーゼＮ５−１とは
異り、間接型ビリルビンにも作用する。しかしより速く
反応を進めるためには界面活性剤などの反応促進物質を
添加するのがよい。
クリーニングの結果コゾリナス属菌中に見い出したもの
である。本酵素はビリルビンオキシダーゼＮ５−１とは
異り、間接型ビリルビンにも作用する。しかしより速く
反応を進めるためには界面活性剤などの反応促進物質を
添加するのがよい。
本酵素を用いるビリルビンによる干渉の回避又は軽減法
は、前記ビリルビンオキシダーゼＮ５−１と同様に行う
ことができる。
は、前記ビリルビンオキシダーゼＮ５−１と同様に行う
ことができる。
本発明の他の態様はラッカーゼ、チロシナーゼ。
アスコルビン酸オキシダーゼを用いる方法である。
これら酵素がビリルビンに反応性があることは従来知ら
れていなかった。これら酵素山ビリルビンオキシダーゼ
ＭＳ−１と異なシ間接型ビリルビンにも作用する。適時
、前記反応促進物質を添加すればビリルビンへの作用は
よりすみやかに進行する。
れていなかった。これら酵素山ビリルビンオキシダーゼ
ＭＳ−１と異なシ間接型ビリルビンにも作用する。適時
、前記反応促進物質を添加すればビリルビンへの作用は
よりすみやかに進行する。
その他はビリルビンオキ・シダーゼＮ５−１と同様にし
て用いることができる。
て用いることができる。
本発明に用いるラッカーゼの例としては、例えばポリポ
ーラス・ベルシカラー（Ｐｏ１ｙｐｏｒｕｓｖｅｒｓｊ
ｃｏｌｏｒ）の生産するラッカーゼ、ウルシ中のラッカ
ーゼなどがあげられる。前者はアクタ・ケミ力・スカン
ジナビカ（Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ ５ｃａｎｄｉｎ
ａｖｉｃａ）第２１巻、２３６７ベーノ（１９６７年）
にその製法などについて記載されている。チロシナーゼ
としてはマツシュルーム起源の又、アスコルビン酸オキ
シダーゼとしてはきゆうシ起源のものがそれぞれ例示さ
れる。
ーラス・ベルシカラー（Ｐｏ１ｙｐｏｒｕｓｖｅｒｓｊ
ｃｏｌｏｒ）の生産するラッカーゼ、ウルシ中のラッカ
ーゼなどがあげられる。前者はアクタ・ケミ力・スカン
ジナビカ（Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ ５ｃａｎｄｉｎ
ａｖｉｃａ）第２１巻、２３６７ベーノ（１９６７年）
にその製法などについて記載されている。チロシナーゼ
としてはマツシュルーム起源の又、アスコルビン酸オキ
シダーゼとしてはきゆうシ起源のものがそれぞれ例示さ
れる。
以上述べた各種酵素はいずれも本発明の目的に使用でき
るが、ビリルビンあるいは発色系への作用の程度の差か
ら、よシ好ましいのはビリルビンオキシダーゼである。
るが、ビリルビンあるいは発色系への作用の程度の差か
ら、よシ好ましいのはビリルビンオキシダーゼである。
本発明の方法に使用する試薬組成物について説明する。
試薬組成物に含まれる酵素量はビリルビンオキシダーゼ
活性としてビリルビンオキシ”ダーゼ、チロシナーゼ、
アスコルビン酸オキシダーゼの場合は０，０１〜１．０
単位であり、ラッカーゼの場合は０．２〜２０ミリ単位
である。反応促進物質は、例えばドデシル硫酸す） Ｉ
Ｊウムの場合は反応液中で０．０２〜０．２％、好まし
くは０．０５〜０．１％、コール酸ナトリウムの場合は
同じ＜０１〜１０瓢好ましくは０５〜０７％である。反
応阻害物質は、フッ化ナトリウムの場合は反応液中で０
５〜１０醍、好ましくは１〜７ ｍＭ、、 フェナン
トロリンの場合もこれに同じである。その他緩衝液、酵
素の安定剤などは必要に応じて加えればよい。
活性としてビリルビンオキシ”ダーゼ、チロシナーゼ、
アスコルビン酸オキシダーゼの場合は０，０１〜１．０
単位であり、ラッカーゼの場合は０．２〜２０ミリ単位
である。反応促進物質は、例えばドデシル硫酸す） Ｉ
Ｊウムの場合は反応液中で０．０２〜０．２％、好まし
くは０．０５〜０．１％、コール酸ナトリウムの場合は
同じ＜０１〜１０瓢好ましくは０５〜０７％である。反
応阻害物質は、フッ化ナトリウムの場合は反応液中で０
５〜１０醍、好ましくは１〜７ ｍＭ、、 フェナン
トロリンの場合もこれに同じである。その他緩衝液、酵
素の安定剤などは必要に応じて加えればよい。
以下、本発明で使用する酵素の活性測定法及び、試験例
、実施例をもって本発明の詳細な説明する。
、実施例をもって本発明の詳細な説明する。
ビリルビンオキシダーゼ活性測定法
エチレン／アミン四酢酸１ｍＭを含む０．２Ｍ−トリス
塩酸緩衝液２５０ ｍｌｌに試薬ビリルビン（和光紬薬
製）５ｍ２を溶解し、この２ ｒｒ＋／？と酵素液０．
２ｍｌを３７℃で反応させ４４０ｎｍ の吸光度の減少
を測定する。１分間に１マイクロモルのビリルビンを酸
化する酵素量を１単位とする。
塩酸緩衝液２５０ ｍｌｌに試薬ビリルビン（和光紬薬
製）５ｍ２を溶解し、この２ ｒｒ＋／？と酵素液０．
２ｍｌを３７℃で反応させ４４０ｎｍ の吸光度の減少
を測定する。１分間に１マイクロモルのビリルビンを酸
化する酵素量を１単位とする。
試験例１ ビリルビンオキシダーゼＭＳ−１の調製ミ
ロセシウム・ベル力リア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖ
ｅｒｒｕｃａｒｉａ）ＭＴ−Ｉ ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ
、 ５９１８株をグルコース・ノヤガイモ培地に培養し
ビリルビンオキシダーゼＮ５−１を含む培養液を得た。
ロセシウム・ベル力リア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖ
ｅｒｒｕｃａｒｉａ）ＭＴ−Ｉ ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ
、 ５９１８株をグルコース・ノヤガイモ培地に培養し
ビリルビンオキシダーゼＮ５−１を含む培養液を得た。
該培養液を順次硫安塩析、透析、活性炭処理、ＱＡＥ−
セファデックスＡ−５０カラムクロマトグラフィー、限
外ｒ過及びセファデックスＧ−３００カラムクロマトグ
ラフイーを行い精製ビリルビンオキシダーゼＮ５−１を
得た。本標品はポリアクリルアミドゲルディスク電気泳
動的に単一であった。
セファデックスＡ−５０カラムクロマトグラフィー、限
外ｒ過及びセファデックスＧ−３００カラムクロマトグ
ラフイーを行い精製ビリルビンオキシダーゼＮ５−１を
得た。本標品はポリアクリルアミドゲルディスク電気泳
動的に単一であった。
試験例 ２ コプリナス属菌の産するビリルビンオキシ
ダーゼの調製 コプリナス０シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅ
ｒｅｕｓ）ＩＦ０８３７１株をポテト・グルコース培地
に培養し、ビリルビンオキシダーゼ活性を含む培養液を
得た。
ダーゼの調製 コプリナス０シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅ
ｒｅｕｓ）ＩＦ０８３７１株をポテト・グルコース培地
に培養し、ビリルビンオキシダーゼ活性を含む培養液を
得た。
該培養液を順次、硫安塩析、透析、 ＤＥＡＥ−セルロ
ースカラムクロマトグラフィー、 ＤＥＡＥ−セファロ
ースカラムクロマトグラフィー、限外ｒ過、セファデッ
クスＧ−１００カラムクロマトグラフィーを行い精製ビ
リルビンオキシダーゼを得た。
ースカラムクロマトグラフィー、 ＤＥＡＥ−セファロ
ースカラムクロマトグラフィー、限外ｒ過、セファデッ
クスＧ−１００カラムクロマトグラフィーを行い精製ビ
リルビンオキシダーゼを得た。
試験例 ３ ポリポラス属菌の産するラッカーゼの調製
ポリポラス・ベルシカラー（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｖｅ
ｒｓｉｃｏｌｏｒ ）ＩＦＯ９７９１株を／’ルコース
、Ｌ−アスｉ４ ラキン。
ｒｓｉｃｏｌｏｒ ）ＩＦＯ９７９１株を／’ルコース
、Ｌ−アスｉ４ ラキン。
ＤＬ−フェニルアラニン、アデニン、チアミン及び無機
塩を含有する培地に培養しラッカーゼ活性を含む培養液
を得た。該培養液を順次、硫安塩析。
塩を含有する培地に培養しラッカーゼ活性を含む培養液
を得た。該培養液を順次、硫安塩析。
透析、限外ｒ過、 ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０
カラムクロマト“グラフィー、限外ｒ過、及びセファデ
ックスＧ−１００カラムクロマトグラフイーを行い精製
標品を得だ。本標品はディスク電気泳動的に単一であっ
た。
カラムクロマト“グラフィー、限外ｒ過、及びセファデ
ックスＧ−１００カラムクロマトグラフイーを行い精製
標品を得だ。本標品はディスク電気泳動的に単一であっ
た。
試験例 ４ マツシュルーム起源のチロシナーゼの調製
シグマ社製チロシナーゼ（ブレイド■）を用い、これを
さらにＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０カラムクロマ
トグラフィー、ハイドロキシアトタイトカラムクロマト
グラフィー、 ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０カラ
ムクロマトグラフィーを行い精製標品を得た。本標品は
ディスク電気泳動的に約９０％の純度であった。
さらにＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０カラムクロマ
トグラフィー、ハイドロキシアトタイトカラムクロマト
グラフィー、 ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０カラ
ムクロマトグラフィーを行い精製標品を得た。本標品は
ディスク電気泳動的に約９０％の純度であった。
試験例 ５ ウルシラッカーゼの調製
ウルシの汁液を塩析、透析、限外ｒ過後セファデックス
Ｇ−２００カラムクロマトグラフィ゛−を行い部分精製
標品を得た。
Ｇ−２００カラムクロマトグラフィ゛−を行い部分精製
標品を得た。
試験例 ６ 各種酵素の基質特異性
本発明の方法に用いられる各種酵素の基質特異性を測定
した。酵素は試験例１〜４で調製したビリルビンオキシ
ダーゼＭＳ−１（Ａと略称、以下同様λコゾリナス属菌
の生産するビリルビンオキシダーゼ（Ｂ）、ポリポラス
属菌の生産するラッカーゼ（Ｃ’ｌ。
した。酵素は試験例１〜４で調製したビリルビンオキシ
ダーゼＭＳ−１（Ａと略称、以下同様λコゾリナス属菌
の生産するビリルビンオキシダーゼ（Ｂ）、ポリポラス
属菌の生産するラッカーゼ（Ｃ’ｌ。
マツシュルーム起源のチロシナーゼ（日ならびにウルシ
起源のラッカーゼ（Ｄ）及びきゅうり起源のアスコルビ
ン酸オキシダーゼ（東洋紡績製、グレイドＩＩＩ ）
（Ｆ）を用いた。第１表に示した７ｍＭ濃度の各種基質
と上記酵素の一定量とを３７℃て反応させ酵素活性を測
定した。結果を第１表に示す。同表には各基質に対する
最高の活性を示す酵素を１００とした相対活性で表示し
た。
起源のラッカーゼ（Ｄ）及びきゅうり起源のアスコルビ
ン酸オキシダーゼ（東洋紡績製、グレイドＩＩＩ ）
（Ｆ）を用いた。第１表に示した７ｍＭ濃度の各種基質
と上記酵素の一定量とを３７℃て反応させ酵素活性を測
定した。結果を第１表に示す。同表には各基質に対する
最高の活性を示す酵素を１００とした相対活性で表示し
た。
第１表に示すように、ビリルビンに対する作用はビリル
ビンオキシダーゼが最も強力であったが、他の酵素にも
弱いながら反応性が認められた。
ビンオキシダーゼが最も強力であったが、他の酵素にも
弱いながら反応性が認められた。
試験例 ７ 反応促進物質の効果
下記組成の反応液を３７℃で反応させ、４４０ｎｍの吸
収の減少を測定した。基質としてアルブミン結合ビリル
ビンであるビリルビンコントロール（ディト社製）を使
用した。
収の減少を測定した。基質としてアルブミン結合ビリル
ビンであるビリルビンコントロール（ディト社製）を使
用した。
０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ＰＨ８，４）
３ｍ１（以下余白） 第 ２ 表 第２表かられかるように、本発明に使用する酵素とビリ
ルビンとの反応を促進する物質として特に好ましいのは
コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、サリチ
ル酸であった。
３ｍ１（以下余白） 第 ２ 表 第２表かられかるように、本発明に使用する酵素とビリ
ルビンとの反応を促進する物質として特に好ましいのは
コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、サリチ
ル酸であった。
試験例 ８ 発色・反応阻害物質の効果０．４ｍＭ４−
アミノアンチピリン及び１．５ｍＭフェノールを含む０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）の３ｍ７とビリルビ
ンオキシダーゼＮ５−１ （１５ｕ／ｎ１１） ３０１
１１及び各種濃度のフッ化ナトリウム又はフ壬テントロ
リン２００μｌとを、３７℃、４０分間反応させ５０５
ｎｍの吸光度の増加を測定した。結果を第３表に示す
。
アミノアンチピリン及び１．５ｍＭフェノールを含む０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）の３ｍ７とビリルビ
ンオキシダーゼＮ５−１ （１５ｕ／ｎ１１） ３０１
１１及び各種濃度のフッ化ナトリウム又はフ壬テントロ
リン２００μｌとを、３７℃、４０分間反応させ５０５
ｎｍの吸光度の増加を測定した。結果を第３表に示す
。
第３表
第３表かう、ビリルビンオキシダーゼＮ５−１ の影
響による色素の発色がフッ化ナトリウム又はフェナント
ロリンの添加によシ阻害されたことが分る。
響による色素の発色がフッ化ナトリウム又はフェナント
ロリンの添加によシ阻害されたことが分る。
実施例 １ グルコースの測定
試薬組成物Ａ
下記を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７５）４−アミ
ノアンチピリン ０．４ ｍＭフ
ェノール １５ｍＭフッ化ナト
リウム １ｍＭグルコースオキシダ
ーゼ（大野製薬製） ５０単位／？−オキシダ
ーゼ（ペーリンガー製） １単位コール酸ナトリウ
ム ０．６％検液Ｂ 試薬組成物Ａ ３ ｍｌと検液Ｂ２０μｌ を混合し、
３７℃、２０分反応させた後、５０５ｎｍにおける吸光
度を測定した。対照として、ビリルビンオキシダーゼＮ
５−１及び／又はビリ・ルピンコントロールを除いた系
について同様に操作した。結果を第１図に示す。同図に
おいて（−０−）はビリルビンオキシダーゼＮ５−１を
添加した場合、（＋）は無添加の場合をそれぞれ表わす
。本発明の方法によシ、検液に共存するビリルビンの影
響がほとんど無視できることがわかった。
ノアンチピリン ０．４ ｍＭフ
ェノール １５ｍＭフッ化ナト
リウム １ｍＭグルコースオキシダ
ーゼ（大野製薬製） ５０単位／？−オキシダ
ーゼ（ペーリンガー製） １単位コール酸ナトリウ
ム ０．６％検液Ｂ 試薬組成物Ａ ３ ｍｌと検液Ｂ２０μｌ を混合し、
３７℃、２０分反応させた後、５０５ｎｍにおける吸光
度を測定した。対照として、ビリルビンオキシダーゼＮ
５−１及び／又はビリ・ルピンコントロールを除いた系
について同様に操作した。結果を第１図に示す。同図に
おいて（−０−）はビリルビンオキシダーゼＮ５−１を
添加した場合、（＋）は無添加の場合をそれぞれ表わす
。本発明の方法によシ、検液に共存するビリルビンの影
響がほとんど無視できることがわかった。
実施例 ２ グルコ−、スの測定
前記実施例１に記載の試薬組成物Ａのうちビリルビンオ
キシダーゼＮ５−１の濃度を０．２単位に変え、さらに
検液Ｂのグルコース溶液の濃度を各種変えて実施例１と
同様に操作した。なお検液Ｂに含まれるビリルビンコン
トロールの濃度は２０ ｍｙ／ｄｌｌである。結果を第
２図に示す。同図中（−０−）は本発明の方法による検
量線であり、他は対照として行ったビリルビン及びビリ
ルビンオキシダーゼＮ５−１を含まない場合（−△−）
、ビリルビンオキシダーゼＮ５−１を含まない場合（＋
）をそれぞれ表わす。
キシダーゼＮ５−１の濃度を０．２単位に変え、さらに
検液Ｂのグルコース溶液の濃度を各種変えて実施例１と
同様に操作した。なお検液Ｂに含まれるビリルビンコン
トロールの濃度は２０ ｍｙ／ｄｌｌである。結果を第
２図に示す。同図中（−０−）は本発明の方法による検
量線であり、他は対照として行ったビリルビン及びビリ
ルビンオキシダーゼＮ５−１を含まない場合（−△−）
、ビリルビンオキシダーゼＮ５−１を含まない場合（＋
）をそれぞれ表わす。
本発明の方法による測定値はビリルビンによる干渉がほ
とんど認められなかった。
とんど認められなかった。
実施例 ３つ グルコースの測定
実施例２のビリルビンオキシダーゼＮ５−１に代えて試
験例２で調製したコゾリナス属菌のビリルビンオキシダ
ーゼ（０，０１単位）、試験例３で調製したポリポラス
属菌のラッカーゼ（０４ミリ単位）、試験例５で調製し
たウルシ起源のラッカーゼ（３，６ミリ単位）を用い実
施例２と同様に操作した。その結果、検量線は実施例２
の結果と同一であった。
験例２で調製したコゾリナス属菌のビリルビンオキシダ
ーゼ（０，０１単位）、試験例３で調製したポリポラス
属菌のラッカーゼ（０４ミリ単位）、試験例５で調製し
たウルシ起源のラッカーゼ（３，６ミリ単位）を用い実
施例２と同様に操作した。その結果、検量線は実施例２
の結果と同一であった。
実施例 ４ コレステロールの測定
試薬組成物Ａ
総コレステロール測定用キットであるコレステロールＣ
−テスト「和光」（和光紬薬製）を７５ｍ１ｌの緩衝液
に溶解し、これにフッ化ナトリウムを１ｍＭ、コール酸
ナトリウムを０６％、試験例１で調製したビリルビンオ
キシダーゼＭＳ−１ヲ０．１ ｕ／ｍｌｌになるように
それぞれ溶解した。
−テスト「和光」（和光紬薬製）を７５ｍ１ｌの緩衝液
に溶解し、これにフッ化ナトリウムを１ｍＭ、コール酸
ナトリウムを０６％、試験例１で調製したビリルビンオ
キシダーゼＭＳ−１ヲ０．１ ｕ／ｍｌｌになるように
それぞれ溶解した。
検液Ｂ
コレステロールＣ−テスト「和光」に付属の標準血清を
使用し、これにビリルビンコントロールを各濃度添加し
た。
使用し、これにビリルビンコントロールを各濃度添加し
た。
試薬キットＡ ３ ｍｌと検液Ｂ２０μｌを３７℃、２
０分間反応させた後、５０５ｎｍの吸光度を測定し人。
０分間反応させた後、５０５ｎｍの吸光度を測定し人。
対照としてビリルビンオキシダーゼＮ５−１及び／又は
ビリルビンコントロールを除いた系について同様に操作
した。結果を第３図に示す。同図において（−Ｃ）−）
はビリルビンオキシダーゼＮ５−１を添加した場合、（
＋）は無添加の場合をそれぞれ表わす。本発明の方法に
ょシ、検液に共存するビリルビンの影響がほとんど無視
できることがわかった。
ビリルビンコントロールを除いた系について同様に操作
した。結果を第３図に示す。同図において（−Ｃ）−）
はビリルビンオキシダーゼＮ５−１を添加した場合、（
＋）は無添加の場合をそれぞれ表わす。本発明の方法に
ょシ、検液に共存するビリルビンの影響がほとんど無視
できることがわかった。
実施例 ５ 中性脂肪の測定
試薬組成物
中性脂肪測定用の市販キットであるＴＧキット−ＧＮ
（日本商事製）を用いてた。
（日本商事製）を用いてた。
Ａ溶液−キット中の酵素試薬１バイアルを呈色試薬１５
ｒｒ＋Ａ’で溶解した。
ｒｒ＋Ａ’で溶解した。
Ｂ溶液−呈色試薬にフッ化す） ＩＪウムを１ ｍＭ。
コール酸ナトリウムを０．６％及び試
験例１で調製したビリルビンオキシ
ダーゼＮ５−１を０．２ ｕ／ｎＪの濃度になるように
それぞれ溶解した。
それぞれ溶解した。
検液Ｃ
各種濃度のトリオレイン溶液を用意し、これにビリルビ
ンコントロールを１０ｍｙ／ｄｌの濃度になるように溶
解した。
ンコントロールを１０ｍｙ／ｄｌの濃度になるように溶
解した。
Ａ溶液１．５ ｍｌｌと検液Ｃ２０ｔｔｌを混合し、３
７℃、５分間予熱し、次いでＢ溶液１．５ｒｒ＋ｌを加
えて、３７℃、１５分反応後５０５ ｎｍの吸光度を測
定した。
７℃、５分間予熱し、次いでＢ溶液１．５ｒｒ＋ｌを加
えて、３７℃、１５分反応後５０５ ｎｍの吸光度を測
定した。
結果を第４図に示す。同図中（−０−）は本発明の方法
による検量線であり、他は、対照として行ったビリルビ
ン及びビリルビンオキシダーゼＮ５−１ を含まない
場合（−へ−）、ビリルビンオキシダーゼＮ５−１を含
まない場合（＋）をそれぞれ表わす。本発明の方法によ
る測定値はビリルビンによる干渉がほとんど認められな
かった。
による検量線であり、他は、対照として行ったビリルビ
ン及びビリルビンオキシダーゼＮ５−１ を含まない
場合（−へ−）、ビリルビンオキシダーゼＮ５−１を含
まない場合（＋）をそれぞれ表わす。本発明の方法によ
る測定値はビリルビンによる干渉がほとんど認められな
かった。
実施例 ６ コレステロールの測定
実施例５のＢ溶液からフッ化ナトリウム及びコール酸ナ
トリウムを除き、さらに、ビリルビンオキシダーゼＭＳ
−１に代えて試験例２で調製したビリルビンオキシダー
ゼ（０，２ｕ／ｒＪ） 、試験例３で調製したラッ゛カ
ー” （０，３ｍｕ／？ｍＡ’ ） 、、試験例５で調
製したウルシ起源ラッカーゼ（３ｍｕ／ｍｌ！ ）を用
い実施例４と同様に操作した。その結果検量線はすべて
実施例４の結果と同一になった。
トリウムを除き、さらに、ビリルビンオキシダーゼＭＳ
−１に代えて試験例２で調製したビリルビンオキシダー
ゼ（０，２ｕ／ｒＪ） 、試験例３で調製したラッ゛カ
ー” （０，３ｍｕ／？ｍＡ’ ） 、、試験例５で調
製したウルシ起源ラッカーゼ（３ｍｕ／ｍｌ！ ）を用
い実施例４と同様に操作した。その結果検量線はすべて
実施例４の結果と同一になった。
実施例 ７
実施例１の検液Ｂの代シに、ヒト血清にビリルビンコン
トロールを各種濃度添加した検液につき実施例１と同様
に操作した。なお用いた血清中のグルコース濃度は９６
ｍｙ／ｄｌｌであシ、ビリルビンの濃度は０．６ｍｙ
／ｄｌｌであった。結果を第５図に示す。同図において
（−０−）はビリルビンオキシダーゼＮ５−１を添加し
た場合、（＋）は無添加の場合をそれぞれ表わす。第５
図よシ本発明の効果が明らかである。
トロールを各種濃度添加した検液につき実施例１と同様
に操作した。なお用いた血清中のグルコース濃度は９６
ｍｙ／ｄｌｌであシ、ビリルビンの濃度は０．６ｍｙ
／ｄｌｌであった。結果を第５図に示す。同図において
（−０−）はビリルビンオキシダーゼＮ５−１を添加し
た場合、（＋）は無添加の場合をそれぞれ表わす。第５
図よシ本発明の効果が明らかである。
第１図は本発明の方法によりグルコースを定量した場合
の共存するビリルビンの干渉を表わす図である。同図に
おいて（−０，−）は本発明の方法による結果であｐ、
（−ｅ−）はそれからビリルビンオキシダーゼＮ５−１
を除いた結果を表わす。 第２図は本発明の方法によるグルコースの検量線を表わ
す図である。同図において（−０−）は本発明の方法に
よる結果であシ、（１−）はそれからビリルビンオキシ
ダーゼＮ５−１を除いた場合、（−△−）はビリルビン
オキシダーゼＮ５−１及びビリルビンを除いた結果を表
わす。 第３図は本発明の方法によシコレステロールを定量した
場合の共存するビリルビンの干渉を表わす図である。同
図において（（））は本発明の方法による結果であり、
（−ｅ−）はそれからビリルビンオキシダーゼＮ５−１
を除いた結果を表わす。 第４図は本発明の方法による中性脂肪の検量線を表わす
図である。同図において（−０−）は本発明の方法によ
る゛結果であシ、（＋）はそれからビリルビンオキシダ
ーゼＭＳ−１を除いた場合、（−八−）はビリルビンオ
キシダーゼＮ５−１及びビリルピンヲ除いた結果を表わ
す。 第５図は本発明の方法によシ血清中のグルコースを定量
した場合の共存するビリルビンの干渉を表わす図である
。同図において（−０−）は本発明の方法による結果で
あシ、←Ｆ）はそれからビリルビンオキシダーゼを除い
た結果を表わす。 特許出願人 天野製薬株式会社 代理人久高将信 外−名 ｇ １ 図 第２１ｇ１ グルコース濃度（′ｌｌ！ＰＡＩり 第３図 Ｑ １０ ２０ ３０ピッルピン１度
（”Ｖｄｌ ） トリオレイソ濃炭（’ＨＰ／ｄｉ ） 第５図 ビリルビン濃度（”９７ｄｉ ） 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ 】、事件の表示 特 願 昭５７−１２７，６３３号 ２発明の名称 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物３補正を
する者 事件との関係 特許出願人 天野製薬株式会社 ４、代理人 東京都港区虎ノ門１−１−１２．虎ノ門ビル５０５号（
６２１７）久 高 将 信（外−名）５、補正命
令の日付 昭和５７年１０ ＝ −−、Ｊ６、補正の対
象 明細書の発明の１１細、“よ説明の欄７、補正の内
容 明細書の矛１７頁及び矛１８頁を別紙添付のものと
差換えます。 第２表 第２表かられかるように、本発明に使用する酵素とビリ
ルビンとの反応を促進する物質として特に好ましいのは
コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、サリチ
ル酸であった。 試験例 ８ 発色反応阻害物質の効果 ０．４ｍＭ４−アミノアンチピリン及び１５ｍＭフェノ
ールを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）の３ｍ
ｌとビリルビンオキシダーゼＮ５−１ （１５ｕ／ｎｌ
） ３０１１ｇ及び各種濃度のフ、化ナトリウム又はフ
ェナントロリン２００μｌとを、３７℃、４０分間反応
させ５０５ ｎｍの吸光度の増加を測定した。結果を第
３表に示す。 第 ３ 表 手 続 補 正 書 昭和５８年１ｏ月２７日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 特 願 昭５７−１２７，６３３号 ２発明の名称 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物３、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 天野製薬株式会社 ４、代理人 特願昭５７−１２７，６３３号９手続補正書（１）明細
書の特許請求の範囲を別紙のように補正します。 （２）明細書中の次の字句を夫々補正します。 （３） ８ｉ細書の次の個所に夫々字句を挿入します
。 （４） 明細書第２ｏ頁第１ｏ〜１２行の、「試薬組
成物Ａのうち一一一−−−−−−−−−−−−に変え、
さらにＪの字句を抹消します。 （５）明ａｌｌ書第２４頁第１５行と第１Ｇ行との間？
ζ次の実施例８〜１２を追加補充します。 （以下余白） ［実施例 ８ 血清中のグルコースの測定実施例１の試
薬組成物からフッ化ナトリウムを除き、血清サンプルを
検液として用い実施例１と同様に操作した。あらかじめ
グルコース標準液を使用して作成した検量線からグルコ
ース濃度を求めたところ９６．１ ｍｌ／ｄｉであった
。対照としてコール酸ナトリウム及びビリルビンオキシ
ダーゼを除いて操作したところ９０．２ ｒＩｖＪ／ｄ
ｅ、てあった。又、上記の試薬にさらにフッ化ナトリウ
ムｌ ｍＭを追加して操作したところ、サンプル中のグ
ルコース濃度は変わらなかったが、ブランク反応液の吸
光度が低くて操作が便宜であった。なお、用いたサンプ
ル中の総ビリルビン濃度は１２．５ ｍｌ／ｄｉであっ
た。 実施例 ９ 血清中の総コレステロールの測定実施例４
の試薬組成物中のコール酸ナトリウムに代えてドデシル
硫酸ナトリウム（０，０７％）を用い、血清サンプルを
検液として実施例４と同様に操作した。あらかじめコレ
ステロール標準液を使用して作成した検量線から総コレ
ステロール磁度を求めたところ１６３ ｒｎｖｄｅてあ
った。対照としてフッ化ナトリウム、ドデシル硫酸ナト
リウム及びビリルビンオキシダーゼを除いて操作したと
ころ、 １４５ ｒＩＬ！／ｄｅであった。なお、用
いたサンプル中の総ビリルビン濃度は１５．２ ｒｎｌ
／ｄｌであった。 実施例 １０ 血清中の中性脂肪の測定実施例５の試薬
組成物中フッ化ナトリウムに代えてフェナントロリン（
２，５ｍＭ ）及びビリルビンオキシダーゼＮＳ −１
に代えてコプリナス属菌産生のＶ゛リルピンオキシダー
ゼ（ｏ、 ０５ ｕ／ｍｌ ）を用い。 血清サンプルを検液として実施例５と同様に操作した。 あらかじめトリオレイン標準液を使用して作成した検量
線からサンプル中の中性脂肪濃度を求あたところ、トリ
オレインとして７ ａ ｏ ｎｖ！／ｄｅであった。対
照としてフェナントロリンｔｊ −ｆｉｖｅナトリウム
及びビリルビンオキシダーゼを除いて操作したところ、
６ ａ ６ ｍＶ／ｄｌであった。なお、用いたサ
ンプル中の総ビリルビン濃度は１４．２ ｍｌ／ｄｌで
あった。 実施例 １１ 血清中の遊離脂肪酸の測定試薬組成物 下記を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨｅ、 ７５ ）
アシルコエンザイムＡシンセターゼ ０．４ ｕ
／ｍｅ（天野製薬製） アシルコエンザイ、ムＡオキシダーゼ ５ ｕ ／
ｍ／！（天野製薬製） パーオキシダーゼ（ペーリンガ Ｂ） ５ｕ／ｍｅ
アデノシン三リン酸 ４μＭ発色
剤ＭＭＸ（協和メデックス製） ５０μＭトリトン
Ｘ−１００Ｑ、１％ ビリルビンオキシダーゼＮ Ｓ −１０，１ｕ／ｍｌコ
ール酸ナトリウム ０．６係フツ
化ナトリウム ２・５ｍＭ上記
試薬組成物３ ｍｌと血清サンプル２０μｌを混合し、
３７Ｃ，２０分反応させた後ｔ６６０ｎｍにおける吸光
度を測定し、あらかじめオレイン酸標準液を使用して作
成した検量線からサンプル中の遊離脂肪酸濃度を求めた
ところ、２１０μＢｑ／１であった。対照きして、ビリ
ルビンオキシダーゼ、コール酸ナトリウム及びフッ化ナ
トリウムを除いて操作したところ、１８２μＥｑ／ｌで
あった。なお、用いたサンプル中の総ビリルビン濃度は
１０，８ｒｒｇ／ｃｔ７！であった。 実施例 １２ 血清中リン脂質の測定 リン脂質測定用の市販キットであるデタミナーＰＬ （
協和メデイクス社製、４−アミ、ノアンチピリン、フェ
ノール、ホスホリパーゼＤ、′コリンオキシダーゼ、パ
ーオキシダーゼを含む）を用い、該キットの溶液にドデ
シル硫酸ナトリウムを０８０７％、フェナントロリンを
２，５ ｍＭ及び試験例２で調製したコプリナス属菌産
生のビリルビンオキシダーゼを０．０５ ｕ／ｍｌにな
るようにそれぞれ溶解した。 該試薬溶液３ ｍｌと血清サンプル２０μｌを混合し。 ３７ｔｌｌ’、２０分間反応させた後、 ５００ ｎ
ｍノ吸光度を測定し、あらかじめ塩化コリン標準液を使
用して作成した検量線からサンプル中のリン脂質濃度を
求めたところ、塩化コリンとして２７７ ｍ１ｌｄｌで
あった。対照さしてドデシル硫酸ナトリウム。 フェナントロリン及びビリルビンオキシダーゼを除いて
操作したところ、 ２６２ｒｒｖｉ／ｄｉてあった。 なお、用いたサンプル中の総ビリルビン濃度は１４．１
ｍｇ１ｄｌであった。 」 −以 上 − 特許請求の範囲 １、 生体成分を測定する方法において、ビリルビンを
酸化するが過酸化水素を生成しない性質を有する酵素を
添カリすることにより検体に共存するビリルビンの干渉
を回避又は軽減することを特徴とする生体成分の測定法
。 ２、 酵素カビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ。 チロシナーゼ又はアスコルビン酸オキシダーゼである特
許請求の範囲第１項記載の生体成分の測定法。 ３、 ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属に属す
る菌株又はコプリナス属に属する菌株の生産する酵素で
ある特許請求の範囲第２項記載の生体成分の測定法。 生 生体成分を測定する方法が過酸化水素−パーオキシ
ダーゼ−発色性水素供与体系を含む特許請求の範囲第１
項記載の生体成分の測定法。 ５． ビリルビンを酸化するが過酸化水素を生成しない
性質を有する酵素に加えて、必要に応じ、該酵素の反応
促進物質及び／又は発色反応阻害物質をも添加すること
により該酵素とビリルビンとの反応を促進及び／又は該
酵素による発色系への作用を阻害する特許請求の範囲第
１項又は第４項記載の生体成分の測定法。 ６、 反応促進物質が界面活性剤、芳香族カルボン酸、
サルファ剤又はグロテアーゼからなる群より選ばれる特
許請求の範囲第５項記載の生体成分の測定法。 ７ 発色反応阻害物質が酵素のビリルビンへの作用は阻
害しないが酵素の発色系への作用を阻害する性質を有す
る特許請求の範囲第５項記載の生体成分の測定法。 ＆ 発色反応阻害物質がフッ化ナトリウム、ヒドロキシ
ルアミン又はフェナントロリンである特許請求の範囲第
５項又はオフ項記載の生体成分の測定法。 ９、 ビリルビンを酸化するが過酸化水素を生成しない
性質を有する酵素を少なくとも含み、生体成分の測定に
おけるビリルビンの干渉を回避又は軽減する性質を有す
る試薬組成物。 １０、酵素がビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ。 チロシナーゼ又はアスコルビン酸オキシダーゼである特
許請求の範囲第９項記載の試薬組成物。 １１、ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属に′）
属する菌株又はコプリナス属に属する菌株の生産する酵
素である特許請求の範囲第１０項記載の試薬組成物。 １２、生体成分の測定が過酸化水素−パーオキシダーゼ
−発色性水素供与体系を含む特許請求の範囲第９項記載
の試薬組成物。 １３、酵素に加えて、必要に応じ、該酵素の反応促進物
質及び／又は発色反応阻害物質をも含み、該酵素とビリ
ルビンとの反応を促進及び／又は該酵素による発色系へ
の作用を阻害する性質を有することを特徴とする特許請
求の範囲第９項記載の試薬組成物。 １４、反応促進物質が界面活性剤、芳香族カルボン酸、
サルファ剤又はグロテアーゼである特許請求の範囲第１
３項記載の試薬組成物、。 １５、反応阻害物質が酵素とビリルビンとの反応は阻害
しないが酵素の発色系への作用を阻害する性質を有する
特許請求の範囲第１３項記載の試薬組成物。 １６、反応阻害物質がフッ化ナトリウム、ヒドロキシル
アミン又はフェナントロリンである特許請求の範囲第１
３項又は１５項記載の試薬組成物。
の共存するビリルビンの干渉を表わす図である。同図に
おいて（−０，−）は本発明の方法による結果であｐ、
（−ｅ−）はそれからビリルビンオキシダーゼＮ５−１
を除いた結果を表わす。 第２図は本発明の方法によるグルコースの検量線を表わ
す図である。同図において（−０−）は本発明の方法に
よる結果であシ、（１−）はそれからビリルビンオキシ
ダーゼＮ５−１を除いた場合、（−△−）はビリルビン
オキシダーゼＮ５−１及びビリルビンを除いた結果を表
わす。 第３図は本発明の方法によシコレステロールを定量した
場合の共存するビリルビンの干渉を表わす図である。同
図において（（））は本発明の方法による結果であり、
（−ｅ−）はそれからビリルビンオキシダーゼＮ５−１
を除いた結果を表わす。 第４図は本発明の方法による中性脂肪の検量線を表わす
図である。同図において（−０−）は本発明の方法によ
る゛結果であシ、（＋）はそれからビリルビンオキシダ
ーゼＭＳ−１を除いた場合、（−八−）はビリルビンオ
キシダーゼＮ５−１及びビリルピンヲ除いた結果を表わ
す。 第５図は本発明の方法によシ血清中のグルコースを定量
した場合の共存するビリルビンの干渉を表わす図である
。同図において（−０−）は本発明の方法による結果で
あシ、←Ｆ）はそれからビリルビンオキシダーゼを除い
た結果を表わす。 特許出願人 天野製薬株式会社 代理人久高将信 外−名 ｇ １ 図 第２１ｇ１ グルコース濃度（′ｌｌ！ＰＡＩり 第３図 Ｑ １０ ２０ ３０ピッルピン１度
（”Ｖｄｌ ） トリオレイソ濃炭（’ＨＰ／ｄｉ ） 第５図 ビリルビン濃度（”９７ｄｉ ） 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ 】、事件の表示 特 願 昭５７−１２７，６３３号 ２発明の名称 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物３補正を
する者 事件との関係 特許出願人 天野製薬株式会社 ４、代理人 東京都港区虎ノ門１−１−１２．虎ノ門ビル５０５号（
６２１７）久 高 将 信（外−名）５、補正命
令の日付 昭和５７年１０ ＝ −−、Ｊ６、補正の対
象 明細書の発明の１１細、“よ説明の欄７、補正の内
容 明細書の矛１７頁及び矛１８頁を別紙添付のものと
差換えます。 第２表 第２表かられかるように、本発明に使用する酵素とビリ
ルビンとの反応を促進する物質として特に好ましいのは
コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、サリチ
ル酸であった。 試験例 ８ 発色反応阻害物質の効果 ０．４ｍＭ４−アミノアンチピリン及び１５ｍＭフェノ
ールを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）の３ｍ
ｌとビリルビンオキシダーゼＮ５−１ （１５ｕ／ｎｌ
） ３０１１ｇ及び各種濃度のフ、化ナトリウム又はフ
ェナントロリン２００μｌとを、３７℃、４０分間反応
させ５０５ ｎｍの吸光度の増加を測定した。結果を第
３表に示す。 第 ３ 表 手 続 補 正 書 昭和５８年１ｏ月２７日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 特 願 昭５７−１２７，６３３号 ２発明の名称 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物３、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 天野製薬株式会社 ４、代理人 特願昭５７−１２７，６３３号９手続補正書（１）明細
書の特許請求の範囲を別紙のように補正します。 （２）明細書中の次の字句を夫々補正します。 （３） ８ｉ細書の次の個所に夫々字句を挿入します
。 （４） 明細書第２ｏ頁第１ｏ〜１２行の、「試薬組
成物Ａのうち一一一−−−−−−−−−−−−に変え、
さらにＪの字句を抹消します。 （５）明ａｌｌ書第２４頁第１５行と第１Ｇ行との間？
ζ次の実施例８〜１２を追加補充します。 （以下余白） ［実施例 ８ 血清中のグルコースの測定実施例１の試
薬組成物からフッ化ナトリウムを除き、血清サンプルを
検液として用い実施例１と同様に操作した。あらかじめ
グルコース標準液を使用して作成した検量線からグルコ
ース濃度を求めたところ９６．１ ｍｌ／ｄｉであった
。対照としてコール酸ナトリウム及びビリルビンオキシ
ダーゼを除いて操作したところ９０．２ ｒＩｖＪ／ｄ
ｅ、てあった。又、上記の試薬にさらにフッ化ナトリウ
ムｌ ｍＭを追加して操作したところ、サンプル中のグ
ルコース濃度は変わらなかったが、ブランク反応液の吸
光度が低くて操作が便宜であった。なお、用いたサンプ
ル中の総ビリルビン濃度は１２．５ ｍｌ／ｄｉであっ
た。 実施例 ９ 血清中の総コレステロールの測定実施例４
の試薬組成物中のコール酸ナトリウムに代えてドデシル
硫酸ナトリウム（０，０７％）を用い、血清サンプルを
検液として実施例４と同様に操作した。あらかじめコレ
ステロール標準液を使用して作成した検量線から総コレ
ステロール磁度を求めたところ１６３ ｒｎｖｄｅてあ
った。対照としてフッ化ナトリウム、ドデシル硫酸ナト
リウム及びビリルビンオキシダーゼを除いて操作したと
ころ、 １４５ ｒＩＬ！／ｄｅであった。なお、用
いたサンプル中の総ビリルビン濃度は１５．２ ｒｎｌ
／ｄｌであった。 実施例 １０ 血清中の中性脂肪の測定実施例５の試薬
組成物中フッ化ナトリウムに代えてフェナントロリン（
２，５ｍＭ ）及びビリルビンオキシダーゼＮＳ −１
に代えてコプリナス属菌産生のＶ゛リルピンオキシダー
ゼ（ｏ、 ０５ ｕ／ｍｌ ）を用い。 血清サンプルを検液として実施例５と同様に操作した。 あらかじめトリオレイン標準液を使用して作成した検量
線からサンプル中の中性脂肪濃度を求あたところ、トリ
オレインとして７ ａ ｏ ｎｖ！／ｄｅであった。対
照としてフェナントロリンｔｊ −ｆｉｖｅナトリウム
及びビリルビンオキシダーゼを除いて操作したところ、
６ ａ ６ ｍＶ／ｄｌであった。なお、用いたサ
ンプル中の総ビリルビン濃度は１４．２ ｍｌ／ｄｌで
あった。 実施例 １１ 血清中の遊離脂肪酸の測定試薬組成物 下記を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨｅ、 ７５ ）
アシルコエンザイムＡシンセターゼ ０．４ ｕ
／ｍｅ（天野製薬製） アシルコエンザイ、ムＡオキシダーゼ ５ ｕ ／
ｍ／！（天野製薬製） パーオキシダーゼ（ペーリンガ Ｂ） ５ｕ／ｍｅ
アデノシン三リン酸 ４μＭ発色
剤ＭＭＸ（協和メデックス製） ５０μＭトリトン
Ｘ−１００Ｑ、１％ ビリルビンオキシダーゼＮ Ｓ −１０，１ｕ／ｍｌコ
ール酸ナトリウム ０．６係フツ
化ナトリウム ２・５ｍＭ上記
試薬組成物３ ｍｌと血清サンプル２０μｌを混合し、
３７Ｃ，２０分反応させた後ｔ６６０ｎｍにおける吸光
度を測定し、あらかじめオレイン酸標準液を使用して作
成した検量線からサンプル中の遊離脂肪酸濃度を求めた
ところ、２１０μＢｑ／１であった。対照きして、ビリ
ルビンオキシダーゼ、コール酸ナトリウム及びフッ化ナ
トリウムを除いて操作したところ、１８２μＥｑ／ｌで
あった。なお、用いたサンプル中の総ビリルビン濃度は
１０，８ｒｒｇ／ｃｔ７！であった。 実施例 １２ 血清中リン脂質の測定 リン脂質測定用の市販キットであるデタミナーＰＬ （
協和メデイクス社製、４−アミ、ノアンチピリン、フェ
ノール、ホスホリパーゼＤ、′コリンオキシダーゼ、パ
ーオキシダーゼを含む）を用い、該キットの溶液にドデ
シル硫酸ナトリウムを０８０７％、フェナントロリンを
２，５ ｍＭ及び試験例２で調製したコプリナス属菌産
生のビリルビンオキシダーゼを０．０５ ｕ／ｍｌにな
るようにそれぞれ溶解した。 該試薬溶液３ ｍｌと血清サンプル２０μｌを混合し。 ３７ｔｌｌ’、２０分間反応させた後、 ５００ ｎ
ｍノ吸光度を測定し、あらかじめ塩化コリン標準液を使
用して作成した検量線からサンプル中のリン脂質濃度を
求めたところ、塩化コリンとして２７７ ｍ１ｌｄｌで
あった。対照さしてドデシル硫酸ナトリウム。 フェナントロリン及びビリルビンオキシダーゼを除いて
操作したところ、 ２６２ｒｒｖｉ／ｄｉてあった。 なお、用いたサンプル中の総ビリルビン濃度は１４．１
ｍｇ１ｄｌであった。 」 −以 上 − 特許請求の範囲 １、 生体成分を測定する方法において、ビリルビンを
酸化するが過酸化水素を生成しない性質を有する酵素を
添カリすることにより検体に共存するビリルビンの干渉
を回避又は軽減することを特徴とする生体成分の測定法
。 ２、 酵素カビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ。 チロシナーゼ又はアスコルビン酸オキシダーゼである特
許請求の範囲第１項記載の生体成分の測定法。 ３、 ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属に属す
る菌株又はコプリナス属に属する菌株の生産する酵素で
ある特許請求の範囲第２項記載の生体成分の測定法。 生 生体成分を測定する方法が過酸化水素−パーオキシ
ダーゼ−発色性水素供与体系を含む特許請求の範囲第１
項記載の生体成分の測定法。 ５． ビリルビンを酸化するが過酸化水素を生成しない
性質を有する酵素に加えて、必要に応じ、該酵素の反応
促進物質及び／又は発色反応阻害物質をも添加すること
により該酵素とビリルビンとの反応を促進及び／又は該
酵素による発色系への作用を阻害する特許請求の範囲第
１項又は第４項記載の生体成分の測定法。 ６、 反応促進物質が界面活性剤、芳香族カルボン酸、
サルファ剤又はグロテアーゼからなる群より選ばれる特
許請求の範囲第５項記載の生体成分の測定法。 ７ 発色反応阻害物質が酵素のビリルビンへの作用は阻
害しないが酵素の発色系への作用を阻害する性質を有す
る特許請求の範囲第５項記載の生体成分の測定法。 ＆ 発色反応阻害物質がフッ化ナトリウム、ヒドロキシ
ルアミン又はフェナントロリンである特許請求の範囲第
５項又はオフ項記載の生体成分の測定法。 ９、 ビリルビンを酸化するが過酸化水素を生成しない
性質を有する酵素を少なくとも含み、生体成分の測定に
おけるビリルビンの干渉を回避又は軽減する性質を有す
る試薬組成物。 １０、酵素がビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ。 チロシナーゼ又はアスコルビン酸オキシダーゼである特
許請求の範囲第９項記載の試薬組成物。 １１、ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属に′）
属する菌株又はコプリナス属に属する菌株の生産する酵
素である特許請求の範囲第１０項記載の試薬組成物。 １２、生体成分の測定が過酸化水素−パーオキシダーゼ
−発色性水素供与体系を含む特許請求の範囲第９項記載
の試薬組成物。 １３、酵素に加えて、必要に応じ、該酵素の反応促進物
質及び／又は発色反応阻害物質をも含み、該酵素とビリ
ルビンとの反応を促進及び／又は該酵素による発色系へ
の作用を阻害する性質を有することを特徴とする特許請
求の範囲第９項記載の試薬組成物。 １４、反応促進物質が界面活性剤、芳香族カルボン酸、
サルファ剤又はグロテアーゼである特許請求の範囲第１
３項記載の試薬組成物、。 １５、反応阻害物質が酵素とビリルビンとの反応は阻害
しないが酵素の発色系への作用を阻害する性質を有する
特許請求の範囲第１３項記載の試薬組成物。 １６、反応阻害物質がフッ化ナトリウム、ヒドロキシル
アミン又はフェナントロリンである特許請求の範囲第１
３項又は１５項記載の試薬組成物。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 生体成分を測定する方法において、ビリルビンを
酸化するが過酸化水素を生成しない性質を有する酵素を
添加することにより検体に共存するビリルビンの干渉を
回避又は軽減することを特徴とする生体成分の測定法。 ２、 酵素がビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ。 チロシナーゼ又ハアスコルビン酸オキシダーゼである特
許請求の範囲第１項記載の生体成分の測定法。 ３、 ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属に属す
る菌株又はコプリナス属に属する菌株の生産する酵素で
ある特許請求の範囲第２項記載の生体成分の測定法。 ４、生体成分を測定する方法が過酸化水素−ノヤーオキ
シダーゼー発色性水素供与体系を含む特許請求の範囲第
１項記載の生体成分の測定法。 ５、 ビリルビンを酸化するが過酸化水素を生成しない
性質を有する酵素に加えて、必要に応じ、該酵素の反応
促進物質及び／又は発色反応阻害物質をも添加すること
によシ該酵素とビリルビンとの反応を促進及び／又は該
酵素による発色系への作用を阻害する特許請求の範囲第
１項又は第４項記載の生体成分の測定法。 ６ 反応促進物質が界面活性剤、芳香族カルボン酸、サ
ルファ剤又はプロテアーゼからなる群よシ選ばれる゛特
許請求の範囲第５項記載の生体成分の測定法。 ７ 発色反応阻害物質が酵素のビリルビンへの作用は阻
害しないが酵素の発色系への作用を阻害する性質を有す
４る特許請求の範囲第５項記載の生体成分の測定法。 ８、発色反応阻害物質がフッ化ナトリウム又はフェナン
トロリンである特許請求の範囲第５項又は第７項記載の
生体成分の測定法。 ９、 ビリルビンを酸化するが過酸化水素を生成しない
性質を有する酵素を少なくとも含み、生体成分の測定に
おけるビリルビンの干渉を回避又は軽減する性質を有す
る試薬組成物。 ｉｏ、 酵素がビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ。 チロシナーゼ又ハアスコルビン酸オキシダーゼである特
許請求の範囲第９項記載の試薬組成物。 １１、ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属に属す
る菌株又はコプリナス属に属する菌株の生産する酵素で
ある特許請求の範囲第１０項記載の試薬組成物。 １２、生体成分の測定が過酸化水素−・ぐ−オキシダー
ゼー発色性水素供与体系を含む特許請求の範囲第９項記
載の試薬組成物。 １３ 酵素に加えて、必要に応じ、該酵素の反応促進
物質及び／又は発色反応阻害物質をも含み、該酵素とビ
リルビンとの反応を促進及び／又は該酵素による発色系
への作用を阻害する性質を有することを特徴とする特許
請求の範囲第９項記載の試薬組成物。 １４、反応促進物質が界面活性剤、芳香族カルボン酸、
サルファ剤又はプロテアーゼである特許請求の範囲第１
３項記載の試薬組成物。 １５ 反応阻害物質が酵素とビリルビンとの反応は阻
害しないが酵素の発色系への作用を阻害する性質を有す
る特許請求の範囲第１３項記載の試薬組成物。 １６ 反応阻害物質がフッ化ナトリウム又はフェナン
トロリンである特許請求の範囲第１３項又は１５項記載
の試薬組成物。
Priority Applications (14)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12763382A JPS5918000A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物 |
| DE19823239236 DE3239236A1 (de) | 1982-02-18 | 1982-10-20 | Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen |
| DE3249743A DE3249743C2 (ja) | 1982-02-18 | 1982-10-20 | |
| FR8217632A FR2521589B1 (fr) | 1982-02-18 | 1982-10-21 | Procede pour la determination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques |
| GB08230397A GB2115926B (en) | 1982-02-18 | 1982-10-25 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| US06/436,385 US4554249A (en) | 1982-02-18 | 1982-10-25 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| CA000414104A CA1185883A (en) | 1982-02-18 | 1982-10-25 | Method for the quantitative determination of bilirubin in biological fluids |
| IT48544/83A IT1203658B (it) | 1982-07-23 | 1983-06-21 | Metodo per la determinazione quantitativa di componenti fisiologici in fluidi biologici |
| ES524270A ES8501444A1 (es) | 1982-07-23 | 1983-07-19 | Un metodo para la determinacion cuantitativa de bilirrubina conjugada en fluidos biologicos. |
| ES534138A ES8601482A1 (es) | 1982-07-23 | 1984-07-09 | Un metodo para la determinacion cuantitativa de componentes fisiologicos en fluidos biologicos. |
| CA000464110A CA1218586A (en) | 1982-02-18 | 1984-09-26 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| FR8419005A FR2556010B1 (fr) | 1982-02-18 | 1984-12-12 | Procede pour la determination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques |
| GB08431875A GB2152215B (en) | 1982-02-18 | 1984-12-18 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| US06/749,425 US4839279A (en) | 1982-02-18 | 1985-06-27 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12763382A JPS5918000A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5918000A true JPS5918000A (ja) | 1984-01-30 |
| JPH0329400B2 JPH0329400B2 (ja) | 1991-04-24 |
Family
ID=14964916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12763382A Granted JPS5918000A (ja) | 1982-02-18 | 1982-07-23 | 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5918000A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984004930A1 (en) * | 1983-06-13 | 1984-12-20 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Process for decomposing ascorbic acid |
| JPS6315168A (ja) * | 1986-06-21 | 1988-01-22 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5639198A (en) * | 1979-09-06 | 1981-04-14 | Kazue Tanaka | Inverse pressure unit in piston filtering unit |
| JPS5861000A (ja) * | 1981-10-08 | 1983-04-11 | Nippon Shoji Kk | 体液成分の酵素的定量におけるビリルピンの干渉除去方法 |
| JPS5876100A (ja) * | 1981-10-30 | 1983-05-09 | Ono Pharmaceut Co Ltd | ラツカ−ゼの使用法 |
-
1982
- 1982-07-23 JP JP12763382A patent/JPS5918000A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5639198A (en) * | 1979-09-06 | 1981-04-14 | Kazue Tanaka | Inverse pressure unit in piston filtering unit |
| JPS5861000A (ja) * | 1981-10-08 | 1983-04-11 | Nippon Shoji Kk | 体液成分の酵素的定量におけるビリルピンの干渉除去方法 |
| JPS5876100A (ja) * | 1981-10-30 | 1983-05-09 | Ono Pharmaceut Co Ltd | ラツカ−ゼの使用法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984004930A1 (en) * | 1983-06-13 | 1984-12-20 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Process for decomposing ascorbic acid |
| JPS6315168A (ja) * | 1986-06-21 | 1988-01-22 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0329400B2 (ja) | 1991-04-24 |
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