JPS5861000A - 体液成分の酵素的定量におけるビリルピンの干渉除去方法 - Google Patents
体液成分の酵素的定量におけるビリルピンの干渉除去方法Info
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- JPS5861000A JPS5861000A JP16150181A JP16150181A JPS5861000A JP S5861000 A JPS5861000 A JP S5861000A JP 16150181 A JP16150181 A JP 16150181A JP 16150181 A JP16150181 A JP 16150181A JP S5861000 A JPS5861000 A JP S5861000A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はビリルビン以外の体液成分の酵素的定置におけ
るビリルビンの干渉除去方法に関する。
るビリルビンの干渉除去方法に関する。
体液成分、ことに血清成分の定ｌは種々の病気の診断に
きわめて重要であり、従来から、各種の酵素的定量法が
採用されている。かかる酵素的定量法としては、体液試
料、例えば、血清試料を適宜処理して該試料中の目的と
する成分の量に相応する過酸化水素が発生しうる系に導
いた後、これにペルオキシダーゼと発色剤を加えて生じ
る呈色を可視部で光学的に測定する方法が汎用されてい
る。
きわめて重要であり、従来から、各種の酵素的定量法が
採用されている。かかる酵素的定量法としては、体液試
料、例えば、血清試料を適宜処理して該試料中の目的と
する成分の量に相応する過酸化水素が発生しうる系に導
いた後、これにペルオキシダーゼと発色剤を加えて生じ
る呈色を可視部で光学的に測定する方法が汎用されてい
る。
しかし、この呈色反応は体液中に通常存在する黄色の成
分であるビリルビンによって干渉され、しばしば、目的
とする〜分の一定量が困難となることがよく知られてい
る〔例えば、臨床化学、第８′巻、第１号（１９７９）
、６３〜７２頁〕。
分であるビリルビンによって干渉され、しばしば、目的
とする〜分の一定量が困難となることがよく知られてい
る〔例えば、臨床化学、第８′巻、第１号（１９７９）
、６３〜７２頁〕。
ソコで、ビリルビンの干渉を回避するために、ビリルビ
ンの特異吸収波長である４ ６４ ｎｍよりも長波長、
望ましくは、５５ Ｑ ｎｍ以トの波しに特冗吸収を示
す呈色を生ずる発色剤の使用力ｊ提案されているが、叫
すルビンの干渉を充分に除去する乙とは困難である。ま
た、反応系にフェロシアン１ヒカリウムまたはフェリシ
アン化カリウムを嶽；辻削在させ、酸化還元電位差を利
用することにより、共存するビリルビンのような妨害物
質の干渉を排除して体液中のグルー−スを酵素的に定ｉ
する方法（特公昭５５−２５８４０号）、ビリルビン特
異性菌性酵素組成物によりビリルビンを分解除去し、そ
の干渉を除去して体液成分を分析ｒる方法（特開昭５４
−１５１１９３号）、酸ｆｔ剤を用いてビリルビンなど
の還元性妨害物質を除去して体液成分を走用する方法（
特開昭５６−１０７１６１号）などの物理的あるいは化
学的方法により体液成分の酵素的定量におけるビリルビ
ンの干渉を除去することも提案されているが、例えば、
黄 患者の血清などのビリルビン３砒の高い血清に対し
てはその効果が不充分であったり、繁雑な操作を必、要
とするなどの問題があり、未だ、充分満足するものは見
当らない。
ンの特異吸収波長である４ ６４ ｎｍよりも長波長、
望ましくは、５５ Ｑ ｎｍ以トの波しに特冗吸収を示
す呈色を生ずる発色剤の使用力ｊ提案されているが、叫
すルビンの干渉を充分に除去する乙とは困難である。ま
た、反応系にフェロシアン１ヒカリウムまたはフェリシ
アン化カリウムを嶽；辻削在させ、酸化還元電位差を利
用することにより、共存するビリルビンのような妨害物
質の干渉を排除して体液中のグルー−スを酵素的に定ｉ
する方法（特公昭５５−２５８４０号）、ビリルビン特
異性菌性酵素組成物によりビリルビンを分解除去し、そ
の干渉を除去して体液成分を分析ｒる方法（特開昭５４
−１５１１９３号）、酸ｆｔ剤を用いてビリルビンなど
の還元性妨害物質を除去して体液成分を走用する方法（
特開昭５６−１０７１６１号）などの物理的あるいは化
学的方法により体液成分の酵素的定量におけるビリルビ
ンの干渉を除去することも提案されているが、例えば、
黄 患者の血清などのビリルビン３砒の高い血清に対し
てはその効果が不充分であったり、繁雑な操作を必、要
とするなどの問題があり、未だ、充分満足するものは見
当らない。
このような事情に鑑み、本発明者らは操作が簡単で、ビ
リルビン含量の高い試料に対しても有効な、体液成分の
酵素的定量におけるビリルビンの干渉を除去する方法に
ついて鋭意゛研究を重ねた結果、意外にも、ある種の微
生物および蛋白分解酵素がビリルビン脱色能を有するこ
とを見出し、これを用いることにより、簡単に、かつ、
効果的にビリルビンの干渉か除去できることを知り、本
発明を完成するにいたった。
リルビン含量の高い試料に対しても有効な、体液成分の
酵素的定量におけるビリルビンの干渉を除去する方法に
ついて鋭意゛研究を重ねた結果、意外にも、ある種の微
生物および蛋白分解酵素がビリルビン脱色能を有するこ
とを見出し、これを用いることにより、簡単に、かつ、
効果的にビリルビンの干渉か除去できることを知り、本
発明を完成するにいたった。
すなわち、本発明は、ビリルビン以外の体液成分を酵素
的に定量するに際し、ビリルビン脱臼能を有する微生物
または蛋白分解酵素で試料または試料含有反応系を処理
することを特徴とする体液成分の酵素的定量におけるビ
リルビンの干渉除去方法を提供するものである９本Ｓ明
の方法によれば、体液成分の酵素的定量に際し、測定前
あるいは測定操作の適当な過程で試料または試料含有反
応系を該微生物または蛋白分解酵素と所定時間接触させ
、要すれば、遠心分離、沖過などにより清澄化するだけ
で、簡単に、かつ、ビリルビン含量の１１うい試料でも
、ビリルビンの干渉を受けすＪこ体液成分の定Ｉを正確
に行なうことができる。
的に定量するに際し、ビリルビン脱臼能を有する微生物
または蛋白分解酵素で試料または試料含有反応系を処理
することを特徴とする体液成分の酵素的定量におけるビ
リルビンの干渉除去方法を提供するものである９本Ｓ明
の方法によれば、体液成分の酵素的定量に際し、測定前
あるいは測定操作の適当な過程で試料または試料含有反
応系を該微生物または蛋白分解酵素と所定時間接触させ
、要すれば、遠心分離、沖過などにより清澄化するだけ
で、簡単に、かつ、ビリルビン含量の１１うい試料でも
、ビリルビンの干渉を受けすＪこ体液成分の定Ｉを正確
に行なうことができる。
本発明の方法において用いられるビリルビン脱臼能を有
する微生物としては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属およびフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ）属に属する細菌、ことに、バチルス・
セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ）＋バチ
ルス”スフ−１：リクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５Ｐｈａ
ｅｒｉｃｕｓ ）およびフラボバクテリウム・ルテスセ
ンス（１’ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ １ｕＬｅｓｃ
ｅｎｓ ）が挙げられ、培養した微生物体を収集し、生
理食塩水等で洗浄後、その適当量を用いて試料または試
料含有反応系を処理する。また、蛋白分解酵素としては
、例えば、パパイン［Ｅ（４４，２２，２］、Ｆリプシ
ン［Ｅ Ｃ３，４，２１，。４］、サブチリシンＨＰＮ
［Ｅ（’；３．２．２１．１４ ）、α−キモトリプシ
ン（ＥＣ３，４゜２１．１３、サーモライシン（Ｅ Ｃ
３，４，２４，４）、パンクレアトベプチダーゼ〔Ｅ
Ｃ３，４，２１，１１）。
する微生物としては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属およびフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ）属に属する細菌、ことに、バチルス・
セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ）＋バチ
ルス”スフ−１：リクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５Ｐｈａ
ｅｒｉｃｕｓ ）およびフラボバクテリウム・ルテスセ
ンス（１’ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ １ｕＬｅｓｃ
ｅｎｓ ）が挙げられ、培養した微生物体を収集し、生
理食塩水等で洗浄後、その適当量を用いて試料または試
料含有反応系を処理する。また、蛋白分解酵素としては
、例えば、パパイン［Ｅ（４４，２２，２］、Ｆリプシ
ン［Ｅ Ｃ３，４，２１，。４］、サブチリシンＨＰＮ
［Ｅ（’；３．２．２１．１４ ）、α−キモトリプシ
ン（ＥＣ３，４゜２１．１３、サーモライシン（Ｅ Ｃ
３，４，２４，４）、パンクレアトベプチダーゼ〔Ｅ
Ｃ３，４，２１，１１）。
その他各種微生物由来の蛋白分解酵素、例えば、ストレ
プトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｕｓ）の産生ずる蛋白分解酵素などが挙げら
れる。これらの酵素は精製抽出酵素の形でも、また、メ
ルク社製パパイン水溶性、シグマ社製トリプンンータイ
プＩ、プロテアーゼ・タイプ■、１０テアーゼ・タイプ
■、プロテアーゼ・タイプ■、α−キモトリプシン・タ
イプｌおよびエラスターゼ・タイプＩ、利器化学社製プ
ロナーゼＥ（ストレプ）マイセス・グリセウス産生酵素
）、牛丼化学社製サーモライシン３×結晶などのような
市販の酵素剤でもよい。
プトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｕｓ）の産生ずる蛋白分解酵素などが挙げら
れる。これらの酵素は精製抽出酵素の形でも、また、メ
ルク社製パパイン水溶性、シグマ社製トリプンンータイ
プＩ、プロテアーゼ・タイプ■、１０テアーゼ・タイプ
■、プロテアーゼ・タイプ■、α−キモトリプシン・タ
イプｌおよびエラスターゼ・タイプＩ、利器化学社製プ
ロナーゼＥ（ストレプ）マイセス・グリセウス産生酵素
）、牛丼化学社製サーモライシン３×結晶などのような
市販の酵素剤でもよい。
これらの微生物または蛋白分解酵素と試料または試料含
有反応系との接触は、実際に用いる微生物または酵素、
定量すべき体液成分、採用する定量法などに応じて適宜
の条件下で行遅うことがてきるが、通常、リン酸塩緩衝
液、トリス緩衝液などの緩衝液中、該微生物または酵素
の至Ｊ的Ｐ 、−！！丈に、ＰＨ６，０〜７．５におい
て、室温〜４５°０で３０分〜３時間行なうことが好ま
しい。また、用いる微生物、酵素の１も適宜選択できる
か、通常、微生物を用いる場合は２５〜５００ ｍｌ
（湿ｆｌｆｆｊｆｌＩ ｂｋ ） ／テスト、酵素を用
いる場合は砧清用酵素試賛に対する影響も考慮して１５
００〜６０００ＰＬＪＫ／テ゛スト程度が好ましい。
有反応系との接触は、実際に用いる微生物または酵素、
定量すべき体液成分、採用する定量法などに応じて適宜
の条件下で行遅うことがてきるが、通常、リン酸塩緩衝
液、トリス緩衝液などの緩衝液中、該微生物または酵素
の至Ｊ的Ｐ 、−！！丈に、ＰＨ６，０〜７．５におい
て、室温〜４５°０で３０分〜３時間行なうことが好ま
しい。また、用いる微生物、酵素の１も適宜選択できる
か、通常、微生物を用いる場合は２５〜５００ ｍｌ
（湿ｆｌｆｆｊｆｌＩ ｂｋ ） ／テスト、酵素を用
いる場合は砧清用酵素試賛に対する影響も考慮して１５
００〜６０００ＰＬＪＫ／テ゛スト程度が好ましい。
接触完了後、要すれば遠心分離、ρ過などにより１拭料
または反応系を清澄化し、以後の測定操作を行なう。
または反応系を清澄化し、以後の測定操作を行なう。
前記ＰＵＫはＩｎ分解酵素の活性単位であり、その定義
および測定方法はつぎのとおりである。
および測定方法はつぎのとおりである。
０、１９９ ｍＭ酢酸カルシウムを含むＭ／１５リン酸
緩衝液、（ＰＨ７，４）に適当な濃度で所定の酵素を溶
解した酵素液１． Ｏｔｔｔｌに、ＰＩ−１７，４に調
整したミルクカゼインのＭ／１５リン酸緩闇液中２％ｌ
容液１． Ｏｚｔを加え、正確に４０°Ｃで１０分間反
応させる。ついで、０．１ Ｍ ） ＩＪクロル酢酸溶
液（０２Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．２ Ｍ氷酢酸を含
む）２．０ｍｌを加え、４０°Ｃで２０分間放置後、遠
心分離し、その上澄を用い、Ｆｏｌ １ｎ−ｃｉｏｃａ
ｌｔｅｕ法に従って力価を測定した。盲検として、酵素
液１． Ｏｙｎｌにトリクロル酢酸溶液２． Ｏｔｒｔ
ｌを先に加えてからミルクカゼイン溶液を加えて同様に
測定を行なう〔Ｍ、Ｎｏｍｏｔｏ、 Ｙ、Ｎａｒａｈａ
ｓｈｉ Ｍ、Ｍｕｒａｋａｍｉ、 Ｊ。
緩衝液、（ＰＨ７，４）に適当な濃度で所定の酵素を溶
解した酵素液１． Ｏｔｔｔｌに、ＰＩ−１７，４に調
整したミルクカゼインのＭ／１５リン酸緩闇液中２％ｌ
容液１． Ｏｚｔを加え、正確に４０°Ｃで１０分間反
応させる。ついで、０．１ Ｍ ） ＩＪクロル酢酸溶
液（０２Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．２ Ｍ氷酢酸を含
む）２．０ｍｌを加え、４０°Ｃで２０分間放置後、遠
心分離し、その上澄を用い、Ｆｏｌ １ｎ−ｃｉｏｃａ
ｌｔｅｕ法に従って力価を測定した。盲検として、酵素
液１． Ｏｙｎｌにトリクロル酢酸溶液２． Ｏｔｒｔ
ｌを先に加えてからミルクカゼイン溶液を加えて同様に
測定を行なう〔Ｍ、Ｎｏｍｏｔｏ、 Ｙ、Ｎａｒａｈａ
ｓｈｉ Ｍ、Ｍｕｒａｋａｍｉ、 Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＴｏＫｙｏ、４８ ＋ ５９３ （１
９６０）参照〕。
９６０）参照〕。
別途、ウシ血清アルブミンを標準液として、酵素液の蛋
白量を測定する［ Ｌｏｗｒｙ、Ｒｏｓｅ ｂｒｏｕｇ
ｈ。
白量を測定する［ Ｌｏｗｒｙ、Ｒｏｓｅ ｂｒｏｕｇ
ｈ。
Ｆａｒ４ Ｒａｎｄａｌｌ、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ 、Ｃｈ
ｅｍ、ｌ ９３ 。
ｅｍ、ｌ ９３ 。
２６５（１９５１）参照〕。
得られた力価測定値（０，０，）、盲検値（０，Ｄ、）
および蛋白量（暫）から次式に従って酵素の比活性（Ｐ
ＵＫ／＃）を算出する。
および蛋白量（暫）から次式に従って酵素の比活性（Ｐ
ＵＫ／＃）を算出する。
本発明の方法は各種の体液試料、ことにビリルビンの干
渉の大きい血清拭外中９成分の酵素曲走ｉ＋ｉ：に好適
に用いられ、定喰法目体は通常採用さｔしるいずれの方
法でもよく、例えば、コレステロールオキシダーゼ法に
よる総コレステロール、遊離コレステロール、高比重リ
ポ蛋白（ＨＤＬ）コレステロール、β−リポ蛋白、レシ
チンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡ
Ｔ）−の定は、コリンオキシダーゼ法によるコリンニス
テラ−ゼ（ＣｈＥ）、リン脂質の定量、グリセロリン酸
オキシダーゼ法によるトリグリセライドの定は。
渉の大きい血清拭外中９成分の酵素曲走ｉ＋ｉ：に好適
に用いられ、定喰法目体は通常採用さｔしるいずれの方
法でもよく、例えば、コレステロールオキシダーゼ法に
よる総コレステロール、遊離コレステロール、高比重リ
ポ蛋白（ＨＤＬ）コレステロール、β−リポ蛋白、レシ
チンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡ
Ｔ）−の定は、コリンオキシダーゼ法によるコリンニス
テラ−ゼ（ＣｈＥ）、リン脂質の定量、グリセロリン酸
オキシダーゼ法によるトリグリセライドの定は。
アシルコエンザイムＡ（アシルＣｏＡ）オキシダーゼ法
による遊離脂肪酸の定量、ピルビン酸オキシターセ法に
よるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ
） 、アラニンアミ／トランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、
ピルビン酸、乳酸脱水素酵素の定量、ウリカーゼ法によ
る尿酸の定置、クルコースオキシダーゼ法によるグルコ
ースの定ｉＬガラクトースオギシダ〒ゼ法によるガラク
トース−（Ｄ定置、ザルコシンオキシダーゼ法によるク
レアチン、クレアチニンの定置、ラクテートオキシダ−
セ法による乳酸の定員土など、オキシダーゼ−ペルオキ
シダーゼ系を利用するビリルビン以外の成分の定量に用
いると、ビリルビンの干渉を充分に除去でき、目的とす
る成分の定量を正確に行なうことができる。
による遊離脂肪酸の定量、ピルビン酸オキシターセ法に
よるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ
） 、アラニンアミ／トランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、
ピルビン酸、乳酸脱水素酵素の定量、ウリカーゼ法によ
る尿酸の定置、クルコースオキシダーゼ法によるグルコ
ースの定ｉＬガラクトースオギシダ〒ゼ法によるガラク
トース−（Ｄ定置、ザルコシンオキシダーゼ法によるク
レアチン、クレアチニンの定置、ラクテートオキシダ−
セ法による乳酸の定員土など、オキシダーゼ−ペルオキ
シダーゼ系を利用するビリルビン以外の成分の定量に用
いると、ビリルビンの干渉を充分に除去でき、目的とす
る成分の定量を正確に行なうことができる。
つぎに実験例および実施例を挙げて本発明の方法をさら
に詳しく説明する。
に詳しく説明する。
実験例１
各種細菌のビリルビン脱色能テスト
（１）ビリルビン溶液の調製
結晶ビリルビン１０〜を２Ｎ水酸化ナトリウムおよび０
．２ Ｍエチレンジアミン四酢酸ナトリウム０、２５
ｙｔｔに溶解し、蒸留水で全量を１００肩ｔとしてビリ
ルビン溶液を調製した。
．２ Ｍエチレンジアミン四酢酸ナトリウム０、２５
ｙｔｔに溶解し、蒸留水で全量を１００肩ｔとしてビリ
ルビン溶液を調製した。
（２）ビリルビン脱色能測定
ビリルビン溶ｅ ０．１ ｍｌ、０．２Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ６，０または７．５）１．０肩ｌ、１０
％ウシ血清アルブミンＯ，’ ４ ｔｔｔｔおよび各菌
体１００ｑ（培養、収集し、食塩水で洗浄後の湿潤重量
）を混合し、蒸留水で全量を２． Ｏｖｔｌとした。こ
の混合液を２５°Ｃに保存し、保存亨後幇よび２時間後
に速１Ｕ分離した上清のビリルビンの特異吸収波にであ
る４ ５４ ｎｍにおける光学的密度（０，Ｄ、）を測
定し、次式よりビリルビン脱色率を算出した。なお、盲
検として、ビリルビン溶液の代りに同１はの蒸留水を添
加した混合液を用いた。
ム緩衝液（ｐＨ６，０または７．５）１．０肩ｌ、１０
％ウシ血清アルブミンＯ，’ ４ ｔｔｔｔおよび各菌
体１００ｑ（培養、収集し、食塩水で洗浄後の湿潤重量
）を混合し、蒸留水で全量を２． Ｏｖｔｌとした。こ
の混合液を２５°Ｃに保存し、保存亨後幇よび２時間後
に速１Ｕ分離した上清のビリルビンの特異吸収波にであ
る４ ５４ ｎｍにおける光学的密度（０，Ｄ、）を測
定し、次式よりビリルビン脱色率を算出した。なお、盲
検として、ビリルビン溶液の代りに同１はの蒸留水を添
加した混合液を用いた。
結果を第１表に示す。
第１表に示ずごとく、バチルス属およびフラボバクテリ
ウム属に属する細菌、ことに、バチルス・セレウス、バ
チルス・スフエリクスおよびフラボバクテリウム・ルテ
スセンスがすぐれたビリルビン脱色能を有する。
ウム属に属する細菌、ことに、バチルス・セレウス、バ
チルス・スフエリクスおよびフラボバクテリウム・ルテ
スセンスがすぐれたビリルビン脱色能を有する。
実験例２
バチルス・セレウスによるビリルビン脱色の経時変化
実験例１と同様にしてビリルビン溶液を調製した。この
ビリルビン溶液０．１ ｔｇｌ、０．２ Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液（ＰＨ６，５’） １．０肩ｌ、１０％ウシ
血清アルブミン０．４ ｍｌおよびバチルス・セレウス
■ＦＯ３００１菌体１００〜（°湿潤重量）を混合し、
蒸留水で全量を２．０ ｍｌとした。この混合液を２５
°Ｃに保存し、所定経過時間ごとに、遠心分離した上清
の４６４ ｎｍにおける光学的密度を測定した。
ビリルビン溶液０．１ ｔｇｌ、０．２ Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液（ＰＨ６，５’） １．０肩ｌ、１０％ウシ
血清アルブミン０．４ ｍｌおよびバチルス・セレウス
■ＦＯ３００１菌体１００〜（°湿潤重量）を混合し、
蒸留水で全量を２．０ ｍｌとした。この混合液を２５
°Ｃに保存し、所定経過時間ごとに、遠心分離した上清
の４６４ ｎｍにおける光学的密度を測定した。
結果を第２表に・示す。
第２表
第２表から明らかなごとく、菌体との接触時間が長くな
るほどビリルビンの脱内が進み、２時間１′一度の接触
で充分にビリルビンの干渉が除去できる。
るほどビリルビンの脱内が進み、２時間１′一度の接触
で充分にビリルビンの干渉が除去できる。
実験例３
各種蛋白分解酵素のビリルビン脱色能テスト実験例１と
同様にして、ビリルビン溶液を調ＪＱし、各菌体の代り
に各種の蛋白分解酵素６０００１） Ｕ Ｋを用いてビ
リルビンの脱色率を算出した。
同様にして、ビリルビン溶液を調ＪＱし、各菌体の代り
に各種の蛋白分解酵素６０００１） Ｕ Ｋを用いてビ
リルビンの脱色率を算出した。
結果を第３表に示す。
第３表
第３表に示すごとく、各種の蛋白分解酵素がビリルビン
脱色層を有し、ことに、パパイン、サブチリシンＢＰＮ
およびストレプトマイセス・グリセウス産生酵素である
プロナーゼＥがスフしている。
脱色層を有し、ことに、パパイン、サブチリシンＢＰＮ
およびストレプトマイセス・グリセウス産生酵素である
プロナーゼＥがスフしている。
実施例１
ヒト血清試料におけるビリルビンの脱色ヒト血清０．１
肩／、１％トリトンＸ−１０００１肩ｌ、０．０２Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液（Ｐ１１６．５）０．５ｇ？および
プロナーゼＥ５０００ＰＵＫを混合し、全量を蒸留水で
１． Ｏｖｔｔとした。この混合液を２５°Ｃに保存し
、所定経過時間ごとに４６４ｎｍにおける光学的密度（
検体０，０．）を測定した。盲検として、ヒト血清の代
りに蒸留水を添ケ１ツ した混合液を用いた。また、対照として、プロナーゼＥ
の代りに蒸留水を添加したヒト血清混合液を同様に２５
°Ｃに保存してその４６４ ｎｎｔにおける光学的密度
（対照０．Ｄ、）を測定し、次式から脱色率（％）を算
出した。
肩／、１％トリトンＸ−１０００１肩ｌ、０．０２Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液（Ｐ１１６．５）０．５ｇ？および
プロナーゼＥ５０００ＰＵＫを混合し、全量を蒸留水で
１． Ｏｖｔｔとした。この混合液を２５°Ｃに保存し
、所定経過時間ごとに４６４ｎｍにおける光学的密度（
検体０，０．）を測定した。盲検として、ヒト血清の代
りに蒸留水を添ケ１ツ した混合液を用いた。また、対照として、プロナーゼＥ
の代りに蒸留水を添加したヒト血清混合液を同様に２５
°Ｃに保存してその４６４ ｎｎｔにおける光学的密度
（対照０．Ｄ、）を測定し、次式から脱色率（％）を算
出した。
結果を第４表に示す。
第４表
第４表に示すごとく、プロナーゼＥとの３０分の接触で
ビリルビン脱色効果が発現しはじめ、２時間の接触で充
分ビリルビンの干渉を除去できる。
ビリルビン脱色効果が発現しはじめ、２時間の接触で充
分ビリルビンの干渉を除去できる。
得られたビリルビン脱色検体はそのま＼通常の各種酵素
的定量法の操作に付すことができる。
的定量法の操作に付すことができる。
実施例２
モテル系における総コレステロールの測定（１）試薬の
調製 （１）ビリルビン溶液 シグマ社製ビリルビン１０〜をＩＮ水酸化ナトリウム（
０，１Ｍエチレンジアミン四酢（’ｔ／Ｕ ｑ ） Ｏ
。
調製 （１）ビリルビン溶液 シグマ社製ビリルビン１０〜をＩＮ水酸化ナトリウム（
０，１Ｍエチレンジアミン四酢（’ｔ／Ｕ ｑ ） Ｏ
。
１
５肩ｔおよび１／７５Ｍリン酸カリウム緩衝液（、、Ｉ
Ｉ６．５、ウシ血清アルブミン１０％含有） ５． Ｏ
ｗｅに溶解し、蒸留水にて全量を１’ Ｏ＃Ｉ／とじた
。得られた溶液を１７７５Ｍリン酸カリウム緩衝液（１
・ＩＩ６．５、ウシ血清アルブミン５％含有）で稀釈し
、各々、ビリルビン濃度が４．８．１８．（１，２，７
，０および３６．５＃／ｄＡ！のビリルビン溶液を調製
した。
Ｉ６．５、ウシ血清アルブミン１０％含有） ５． Ｏ
ｗｅに溶解し、蒸留水にて全量を１’ Ｏ＃Ｉ／とじた
。得られた溶液を１７７５Ｍリン酸カリウム緩衝液（１
・ＩＩ６．５、ウシ血清アルブミン５％含有）で稀釈し
、各々、ビリルビン濃度が４．８．１８．（１，２，７
，０および３６．５＃／ｄＡ！のビリルビン溶液を調製
した。
（１１）プロナーゼＥ溶液
プロナーゼＥを蒸留水に溶解し、濃度２５Ｆｌｙ／４ｔ
の溶液を調製した。
の溶液を調製した。
（２）７１１１１定操作
ＴＣ−キットＫ［′Ｆ３本商事（抑制、コレステロール
エステラーゼ−コレステロールオキシタ”−ゼーヘ／ｌ
ｚオキシダーゼ系の総コレステロール測定用キット〕を
用いてつぎのように測定を行なった。
エステラーゼ−コレステロールオキシタ”−ゼーヘ／ｌ
ｚオキシダーゼ系の総コレステロール測定用キット〕を
用いてつぎのように測定を行なった。
（Ｌｄ：料ノプロナーゼＥによる処理
Ｔ’Ｃ−キットにのコレステロール［準ｄ（３００ｙｒ
ｙ ／ ｄ ｌ ） および各濃度のビリルビン溶液
の容は比１：１混合液を試料とし−た。試料０，２肩ｔ
、プロナーゼＥ″溶液０．２ｍ／、１／７５Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（ＰＨ６，５） ０．５肩ｔおよび蒸留水
０．１ ｍｌを混合し、２５°Ｃで１２０分間放置し、
ビリルビン脱色処理試料液を得た。対照として、試料０
．２ ａｔ、１／７５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ６
゜５）０．５ｒｔｔｌおよび蒸留水０．３ ｙｔｔｌを
混合し、２５°Ｃで１２０分間放置し、未処理試料液を
得た。
ｙ ／ ｄ ｌ ） および各濃度のビリルビン溶液
の容は比１：１混合液を試料とし−た。試料０，２肩ｔ
、プロナーゼＥ″溶液０．２ｍ／、１／７５Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（ＰＨ６，５） ０．５肩ｔおよび蒸留水
０．１ ｍｌを混合し、２５°Ｃで１２０分間放置し、
ビリルビン脱色処理試料液を得た。対照として、試料０
．２ ａｔ、１／７５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ６
゜５）０．５ｒｔｔｌおよび蒸留水０．３ ｙｔｔｌを
混合し、２５°Ｃで１２０分間放置し、未処理試料液を
得た。
（１１）呈色反応
上記で得られた処理試料液または未処理試料液０、１
ｍｌをＴＣ−キ７ ） Ｋの呈色試液１．４ ｍｌと混
合し、３７°Ｃで１５分間反応させた後、５００ ｎｍ
で光学的密度を測定した。盲検としては、試料液０．１
ｔＩＩｌおよびＴＣ−キットにの緩衝液１．４ ｔｅｌ
の混合液を用いた。
ｍｌをＴＣ−キ７ ） Ｋの呈色試液１．４ ｍｌと混
合し、３７°Ｃで１５分間反応させた後、５００ ｎｍ
で光学的密度を測定した。盲検としては、試料液０．１
ｔＩＩｌおよびＴＣ−キットにの緩衝液１．４ ｔｅｌ
の混合液を用いた。
結果を第５表に示す。なお、第５表中に示す％はビリル
ビン溶液濃度０〜／ｄｌ のときの光学的密度を１００
とした場合の当該濃度における光学的密度の割合を意味
する。
ビン溶液濃度０〜／ｄｌ のときの光学的密度を１００
とした場合の当該濃度における光学的密度の割合を意味
する。
第５表から明らかなごとく、未処理のものはヒリルビン
濃度８〜／ ｄ ｉ 、ですでにビリルビンの１ゝ渉を
受けているのに対し、蛋白分解酵素プロナー 、−−
Ｌ”Ｅで処理したものはピリル１フａ度２０１ｎ９／ｃ
Ｆ１程度の高濃度までも干渉を受けない。
濃度８〜／ ｄ ｉ 、ですでにビリルビンの１ゝ渉を
受けているのに対し、蛋白分解酵素プロナー 、−−
Ｌ”Ｅで処理したものはピリル１フａ度２０１ｎ９／ｃ
Ｆ１程度の高濃度までも干渉を受けない。
特許出願人 日本商事株式会社
Claims (5)
- （１）ビリルビン以外の体液成分を酵素的に定はするに
際し、ビリルビン脱色能を有する微生物オたは蛋白分解
酵素で試料または試料含有反応系を処理することを特徴
とする体液成分の酵素的定置におけるビリルビンの干渉
除去方法。 - （２） Ｌｌ 微生物がバチルス（Ｂａｃｉ目ｕｓ）
属およびフラボバクテリウム（Ｆｌ ａｖｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属からなる群から選ばれるビリルビン脱色能
を有する細菌である前記第（１）項の方法。 - （３）該細菌がバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｅｒｅｕｓ ）、バチ）１／ス−ス７Ｔ：リクス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｒｈａｅｒｉｃｕｓ）またはフラボバ
クテリウム・ルテスセンス （Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 、／ｕｔｅｓｃｅｎ
ｓ）である前記第（２）項の方法・ - （４）該蛋白分解酵素がパパイン、サブチリシンＢＰＮ
またはストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｌ
ｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ）産生の蛋白分解酵素
である前記第（１）項の方法。 - （５）該体液が血清である前記第（１）項〜第（４）項
いずれか１つの方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16150181A JPS5861000A (ja) | 1981-10-08 | 1981-10-08 | 体液成分の酵素的定量におけるビリルピンの干渉除去方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16150181A JPS5861000A (ja) | 1981-10-08 | 1981-10-08 | 体液成分の酵素的定量におけるビリルピンの干渉除去方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5861000A true JPS5861000A (ja) | 1983-04-11 |
Family
ID=15736263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16150181A Pending JPS5861000A (ja) | 1981-10-08 | 1981-10-08 | 体液成分の酵素的定量におけるビリルピンの干渉除去方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5861000A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58216699A (ja) * | 1982-06-09 | 1983-12-16 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 血清の清澄化法 |
| JPS5918000A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物 |
| JPS59206000A (ja) * | 1983-05-11 | 1984-11-21 | Kikkoman Corp | グアニジノ化合物の定量用試薬及びその定量方法 |
| JPS6087800A (ja) * | 1983-10-18 | 1985-05-17 | Kikkoman Corp | グアニジノ化合物の定量方法及びその定量用試薬 |
| FR2576909A1 (fr) * | 1985-02-05 | 1986-08-08 | Toyo Jozo Kk | Bilirubine oxydase thermostable et son procede d'obtention |
| JPS6315168A (ja) * | 1986-06-21 | 1988-01-22 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 |
-
1981
- 1981-10-08 JP JP16150181A patent/JPS5861000A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58216699A (ja) * | 1982-06-09 | 1983-12-16 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 血清の清澄化法 |
| JPS5918000A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物 |
| JPH0329400B2 (ja) * | 1982-07-23 | 1991-04-24 | ||
| JPS59206000A (ja) * | 1983-05-11 | 1984-11-21 | Kikkoman Corp | グアニジノ化合物の定量用試薬及びその定量方法 |
| JPS6087800A (ja) * | 1983-10-18 | 1985-05-17 | Kikkoman Corp | グアニジノ化合物の定量方法及びその定量用試薬 |
| FR2576909A1 (fr) * | 1985-02-05 | 1986-08-08 | Toyo Jozo Kk | Bilirubine oxydase thermostable et son procede d'obtention |
| US4770997A (en) * | 1985-02-05 | 1988-09-13 | Toyo Jozo Co., Ltd. | Thermostable bilirubin oxidase and production process thereof |
| JPS6315168A (ja) * | 1986-06-21 | 1988-01-22 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 |
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