JPS6315168A - 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、妨害的な試料成分をフルクトサミン含量の測
定前に除去して、血液又は血液から誘導された試料中の
血清フルクトサミン含量ｅ特異的に測定する方法に関す
る。

従来の技術 血清フルクトサミン含蓄とは、非酵素的にゴリコシル化
された血清蛋白質の全含ｉｋ表わす。

これは、血清グルコースがそのカルボニル基を介して遊
離蛋白質アミン基と一緒にシック塩基を形成することに
より生じる。引続いて、これはアマＶり再配列により安
定なケト−アミン結合を有するフルクトサミンに移行す
る。この反（ｗｌｅｌａｎａ　）が睦しく研究した［　
’　Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

○ｈｅｍ、　０１ｉｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　’、１
９巻、８１〜８７頁（１９８１年）〕。

血清フルクトサミンの半減期は、ケト−アミン結合が安
定であるため、半減期が平均約２１日間である血清蛋白
質と実質的に同一である。

相応する研究九ついて＃ｉＬ、Ｙ、セン（Ｓａｎｇ　）
及びＭ、　、Ｔ、スティリー（５ｔａ１ｅｙ　）共著、
１ジヤーナル・オブ・クリニカル拳ケミストリー（、Ｔ
、　０１ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、　）　　’、６２巻、５６
０頁（１９８６年）に公開されてｂる。

フルクトサミン形成のスケールは血中グルコース濃度に
比例する。周知のように、この濃度は糖尿病懲者、特に
不十分な食餌性及び薬物性の代謝調節では、顕著な病理
症状とも結びついて激しく変動し得る。

血中グルコースの測定は、採血時点での代謝状態につい
て情報を医者に与えるだけである。

これに対し、それまでの１２０日間の代謝状態に関する
長期間のコントロールはグリコジル化ヘモグロビン（Ｈ
ｂＡｌ　）により可能である。血清フルクトサミンの測
定はその半減期故に、養生及び治療手段による糖尿病患
者の代縮銹２４を約３週間の中期間について遡及して測
定するのに好適である。それ故、確立された臨床におけ
る診断パラメータの血中グルコース並びにグリコジル化
ヘモグロビン（１のＡ〕）と共に、信頼性のある、特異
的で実際に使える血清フルクトサミン測定法によって、
糖尿病患者全管理するための診断領域を有用な中期パラ
メータに拡大することができる。

原則的（τ筒車に実施し得る血清フルクトサミン測定法
は、ヨーロッパ特許第００８５２６３号Ｅ！Ｊ４細書（
Ｂａｋｅｒにより）及びジョンソン（、Ｔｏｈｎｓｏｎ
　）及びその他共著、ゝりＮ　二カ・キミカ拳アクタ（
０１ｉｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ　）　’、１２７巻
、８７〜９５頁（１９８２年）に記載された。

該測定法は、ケトアミン型を水性アルカリ性媒体中で、
例えばニトロテトラゾリウムブルーのようなテトラゾリ
ウム塩に還元的に作用して、ホルマデン色素を供給する
エノール形に変換することに基いている。規定した時間
３７℃で光度測定した色素形成の程度は存在するフルク
トサミンの蓋に比例する。

この試鋏法は試料として血清を使用する際に妨害作用を
受ける。それというのもビリルビン及び尿酸のような天
然血清成分もテトラゾリウム塩に対して還元的に作用す
るからである。例えばα−メチルドーパのような医薬、
例えばアヒチルサリチル酸の代謝物であるデンチジン酸
のような医薬分解生成物並びにアスコルビン酸も血清中
の濃度に相応して測定結果の誤差をもたらす。

更に従来は血清フルクトサミン測定は、試料毎に変動す
る全蛋白質含量に帰因する妨害を受けた。これは測定値
の変動をもたらし、従って６（（１定法の感度は小さい
。これらの妨害作用は基質効果（Ｍａｔｒｉｘｅｆｆθ
ｋｔ　）として知られている。

この効果は、例えば一般にｍ準溶液を製造する際に該当
するように、付加的な蛋白質の添加の際に特に生じる。

蛋白質量が増加するにつれてフルクトサミンと呈色試薬
との間の反応は緩慢になる（　Ｅ、　Ｊ、ヒンドレ（Ｈ
ｌｎｄｌｅ　）及びその他共著、’　Ａｎｎ、　Ｃ！ｌ
ｉｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　’、２２巻、８４〜８９
頁（１９８５年）〕。

他の困難が過脂肪血症の血清でフルクトサミン測定を行
なう場合に生じる。一般に、試料中のフルクトサミン濃
度が低い場合でも十分に大きい測定シグナルを得るため
に、試料／拭薬−容量比０．１が必要である。しかしト
リグリセリド８度が著しく高いと、前記のように高論試
料割合で１−ｉルじる試験バッチの混濁が光度測定でマ
イナスに作用する。フルクトサミン測定は著しく困難と
なり、それどころか妨害づれる。

発明が解決しようとする問題点 前記の欠点を有していない、塵中又は血液から誘導され
た試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する
ための方法が必要になっている。本発明の課題は、その
ような方法を開示することであった。

問題点を解決するための手段 この課題は特許請求の範囲に記載の発明により解決され
る。血液又は血液がら竹２４場れた試料中の血清フルク
トサミン含蓄ヲ、好適な呈色試薬と反応させかつその際
に生じた色の変化を測定することにより測定する本発明
方法は呈色反応の前に、非特異的に還元作用をする試料
成分及び／スは混濁を誘発する試料成分をほぼ中性の絹
値で除去し、引続いて絹値を…１０〜１２に調節しかつ
呈色試薬を添加することを包含する。

非特異的に還元作用をする試料成分を除去するに当って
は、試料に酵素系及び／又は非酵素系酸化剤１種又は数
種を加える。酵素系酸化剤としてアスコルベートオキシ
ダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ及び／又はウリカーゼ
並びに非酵素系酸化剤として次亜塩素酸塩又は次亜塩素
酸塩供与化合物を使用すると有利である。次亜塩素酸塩
供与化合物としては特にＮ−クロル−ｐ−トルエン−ス
ルファミド（クロラミンＴ）が好適である。この化合物
は水との接触で徐々に次亜塩素酸を脱離する。これはア
ルカリ性ではなく、酸性乃至中性において有用な酸化剤
である。付加的にペルオキシダーゼ及び／又はカタラー
ゼを添加すると特に有利であることが明らかになった。

測定すべき試料に酵素系及び／又は非酵素糸酸化剤１種
又は数種を添加することとより、妨害的な還元作用の全
成分による妨害が除かれ、即ち前記の酸化剤はビリルビ
ン、尿酸又はアスコルビン酸を酸化するばかりでなく、
他の還元作用全すス物質、例えば医薬並びにその分解生
成物による妨害作用も除去する。１種以上の酸化剤の存
在において、そのような物質は治療濃度範囲で消失する
かあるいはその濃度が分析的にもはや重要ではない程度
忙低下する。場合により存在するペルオキシダーゼは、
場合により発生する過酸化水素と共に付加的な酸化分解
工程を惹起し、これは酸化剤１種以上の作用性を付加的
に高める。場合により添加するカタラーゼけ、とりわけ
過剰量の過酸化水素の除去に有用である。好適な界面活
性剤、有利にカチオン系界面活性剤、例えばオキシエチ
ルアルキルアンモニウムホスフェート（例えばＨｅｎｋ
ａｌ　社ｇのＤｅｈｙｑｕａｒｔ　ＳＰ　）の添加によ
り、驚異的に膜化作用が高められる。酵素糸及び／又り
非酵素系酸化剤の混合物がクロラミンＴとカチオン系界
面活性剤、例えばオキシエチルアルキルアンモニウムホ
スフェート（例えばＤｅｈｙｑ　ｕａｒｔＲ８Ｆ　）と
を同時に含有すると特に有用である。カチオン系界面活
性剤の濃度は０．５〜４容量％である。

優れた濃度範囲と１、てはデノ・イクオートＲ８Ｐに関
しては１〜２容ｆ％が明らかになった。

特に脂必血ｆｆ、試料の試験廻あたっては、１種以上の
酸化剤に、場合によりリパーゼを場合により界面活性剤
１？ｊｉ以上及び／又はｈａの塩と一緒に添加すると有
利であることが明らかになった。このような混合物を使
用することにより、混濁を誘発する物質を除去して次の
呈色測定を妨害しないようにすることができる。

妨害成分を除去するための前記物質を用いると、試料中
の変動する全蛋白ｉｆによる、基質効果として公知の測
定値変動もほとんど抑制されるかあるいは完全に除去さ
れることは驚異的である。

非特異的に還元作用をする試料成分及び／又Ｆｉ混濁を
誘発する試料成分を除去するに当り、１種以上の酵素系
及び／又は非酵素系酸化剤並びに場合により１種以上の
界面活性剤及び／又は強酸の塩を好適な非還元性緩衝剤
中に含有する溶液と一緒に試料を恒温保持すると有利で
あることがＣ′！らかになった。この溶液の製造に当っ
ては、還元作用をせすかつその緩衝作用がほぼ中性の組
直である緩衝物質すべてが好適である。…６〜９、殊に
７〜８．５、特に７．５〜８．０の絹範囲が特に有利で
あることが明らかになった。緩衝剤濃度は殊に１０〜１
００ミリモル／ｊ、特に２０〜７０ミリモル／ｌである
。特に七利なものとしては水性カリウムリン酸塩緩衝ｇ
が特に有利であることが明らかになった。

添加すべき酵素の濃度は除去すべき妨害作用をする化合
物の濃度に応じて決まる。一般に酵素濃度は０．０１〜
１００００Ｕ／−である。例えば優れた濃度範囲は次の
通りである：ウリカーゼ　　　　　　１〜１５Ｕ／ＷＬ
ｌビリルビンオキシダーゼ　　　　　　０．０５〜５Ｕ
／１アスコルベートオキシダーゼ　　　　　２〜２０Ｕ
／ｌｄリパーゼ　　　　　　　　　　　　　　０，５〜
５Ｕ／ＩＩＬｔペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　
０．５〜５Ｕ／ＩＬｌカタラーゼ　　　　　　　　１０
０〜１００００Ｕ／ｄこれらの酵素の特に優れた濃度範
囲は次の通りである： ウリカーゼ　　　　　　　　　　　　　　　２〜１　Ｑ
　Ｕ　／ｍｔｔビリルビンオキシダーゼ　　　　　　　
０．１〜１Ｕ／ｍアスコルベートオキシダーゼ　　　　
　５〜１５Ｕ／ｍＪリパーゼ　　　　　　　　　　　　
　　　１〜３Ｕ／づペルオキシダーゼ　　　　　　　　
　　　１〜３Ｕ／ｍ／カタラーゼ　　　　　　　　　５
００〜２０口ｌ　Ｕ　／ｍｌ：、。

添加する次亜塩素酸塩もしくは次亜塩素酸塩供与化合物
の］度も除去すべき妨害作用をする化合物の濃度により
決定する。一般に、次亜塩素酸塩及び次亜塩素酸塩供与
化合物は濃度５０〜６ＤＯμモに／１．　ｒＡＫ１５０
〜３００μ％ル／ＩＩで使用する。

界面活性剤はカチオン系以外にア＝オフ系又は非イオン
系の界面活性剤であってもよい。アニオン系界面活性剤
としては、胆汁酸及びその複合体のアルカリ塩、アルカ
リ土類塩が優れている。アニオン系界面活性剤の有利な
濃度は２〜１０ミリモル／ｌである。濃度４〜６ミリモ
ル／７の胆汁酸ア）　Ｎクムが特に有利であることが明
らか１でなった。

非イオン系界面活性剤としては、広範な柚類の界面活！
、−ｂ　Ｎｌから辿択することかできる。殊に、１分子
当りアルコール部分にＣ原子８〜２０個及びグリコール
単位４〜１５個を有する直鎖状又は分枝飴状のアルキル
〜又はアルキルアリール−アルコール−ポリグリコール
エーテルが好適であることが明らかになった。特に有利
な活性化作用は、１分子当りアルコール部分にＣ原子８
〜１２個及びグリコール単位４〜８個を有する＠鋤状及
び分枝鎖状のアルキル−アルコール−ポリグリコールエ
ーテルが及ぼす。

本発明によるＪｆ１ｍフルクトサミン含倉の特異的測定
法には、アルコール部分の構造が単一であるか又はアル
コール部分の構造が数棟の異なっているポリグリコール
エーテルからの混合物であってよい非イオン系界面活性
剤か好適である。１分子当り平均して４個のグリコール
単位を有するインデカノールポリグリコールエーテル〔
オキセタール（ｏｘｅｔａｌ　）ＲＩ　Ｄ　１０　Ａ、
Ｚｓｃｈｉｍｍｓｒ　＆　Ｓｃｈｗａｒｚ　？ｆ：ｉ、
Ｌａｈｎａｔｅｉｎ在〕及び１分子当り平均して６個の
グリコール単位を有するｎ−デカノールポリグリコール
エーテル（プロドククト（Ｐｒ０ｄｕｋｔ　）　ＲＴ２
４　（１、同社表）からの混合物が特に優れて因る。本
発明により、非特異的に還元作用をする試料成分及び／
ヌは混濁を誘発する試料成分の除去に使用する非イオン
系界面活性剤の濃度／ｆｉ０．０５〜１５Ｎｍ％である
。特に優れた濃度範囲としては、オキセタール　よりＩ
Ｏ，！！に：関してｈ　＋１．１〜１％、特に有利には
０．２〜０．５％が明らかになった。プロドウク）Ｒ７
２４０は濃度１〜１０％、特に有利には２〜５％で使用
することができる。

混濁を除去する作用は、反応溶徹中のイオン謬度か高い
と高められる。このために、アルカリ性−範囲でも溶解
している強酸の塩の添加が有利であると明らかになった
。塩酸又は硫酸のアルカリ塩又はアルカリ土類塩が優れ
ている。

塩化カリウム又は塩化ナトリウムを使用すると特に侵れ
で層る、添加する強酸の塩の濃度は２０〜１００ミリモ
ル／ｌである。塩を濃度４０〜６０ミリモル／ｌで添加
すると特に優れている。

非特異的に還元作用をする試料成分及び／又￥ｉ濁濁を
誘発する試料成分の除去は、温度２５〜４０℃、殊に６
７℃で、１〜１５分間、殊に２〜６分間で行なう。恒温
保持時間は、非特異的に還元作用をする試料成分及び混
濁を誘発する試料成分のｔ並びにそれらの除去に使用す
るＵ素糸及び／又は非酵素系酸化剤のｉＫ相応する。

非特異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘
発する試＃成分を除去するための恒温保持は、使用する
酵素の至適閉放にほぼ中性の…で実施するが、呈色試薬
とフルクトサミンとの間の呈色反応は−１１０〜１２で
進行するので、恒温保持の後に緩衝域変換をする必要が
ある。β値の上昇は、調節すべき鎧値を若干上廻る鎧値
を有する緩衝剤により行なう。ｐＨ１０，５〜１２．５
、鋳にｐＨ１０，７〜１２．２を有する緩衝剤が特に有
机である。そのために炭酸塩緩衝剤を使用すると有利で
あり、その濃度は１５０〜３０口ミリモル／ｌ、特に１
８０〜２２０ミリモル／ｌである。

公知のように、アルカリ性範囲で呈色試薬を添加するこ
とによりフルクトサミンの還元作用を可視化することが
できる。有利にはこのためにテトラゾリウム塩を使用し
、そのホルマずン色素形成は視覚的に又は測光法により
追跡することができる。テトラゾリウム塩としては、ゝ
メソツズ・オグ・エンテマチツク・アナライシス（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ　）　　’（Ｈ，Ｕ、ベルクマイヤ（Ｂｅｒｇｍｅ
７８ｒ　）著、第６版、第１巻、２００負、フエアラー
ク・ヒエミー・ヴアインハイム（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅ
ｍｉｅ　Ｗｅｉｎｈｅｉ！ＩＩ＋）出版（１９８３年）
〕は記載されているものが優れている。ニトロテトラゾ
リウムブルー（ＮＥＴ　）又は３−（！’、５’−ジメ
チルチアゾリルー２）−２，４−ジフェニルーテトラゾ
リウムブロミＰ（ＭＴＴ’　）が特に好適である。呈色
試薬は、Ｌ動域変換の後でも、緩衝剤と同時にでも試験
パッチに添加することかできる。この際に、呈色試薬を
緩衝域変換に必要な緩衝剤甲に溶解すると有利であるこ
とが明らかになった。

テトラゾリウム塩の場合、濃度０．２〜２ミリモル、特
に０．４〜１．５ミリモルが有利であることが明らかに
なった。

非特異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を続
発する試料成分の除去後に緩衝域変換する洗車っては、
ｆＫ、族バッチのＰＪ（値が呈色静、薬の存在で１０〜
１２、殊に１０．３〜１０．６であるような藍の緩衝剤
を添加する。

緩衝域変換した溶液は温度２５〜４０℃、殊に３７℃で
恒温保持する。呈色試薬の還元をベースとする色の変化
は緩衝域変換後に一定の時間で、殊に１〜１５分で測光
法により追跡する。

第１回の測定は緩衝液変換後１〜１０分間で、最後の測
定は緩衝液変換後２〜１５分間で行なう。必要に応じて
２回以上の測定を実施することができる。２回の測定の
間の時間は変動し得る。それは設備に応じて選択するこ
とができ、数秒間でも航分間でもよい。

たいていの場合、得られた測定値を標準溶液と比較する
と有利である。好適な標準溶液は公知である。例えばジ
ョンソン及びその他共著、１クリ二カ・キミカ・アクタ
’、１２７巻、８７〜９５頁（１９８２年）に記載され
ている標準を使うことができ、これは規定量の合成フル
クトサミンを添加したヒトアルブミンからの基質をベー
スとする。合成フルクトサミンとしては１−デツキシー
１−モルホリノ−フルクトース（ＤＭＦ　）を使用する
。この標準ヲ使用する際に、測定する試料中の血清フル
クトサミン濃度はＤＭＦＪｉ位で記載する。

本発明方法が、ジョンソン及びその他による方法で一般
的である試料／試薬答童比肌１を著しく低下させ、しか
も同じ測定間隔及び同一温度での恒温保持の際に規定量
の試料として使用したフルクトサミン類縁体くよる測定
シグナルがジョンソン及びその他による方法と比較して
著しく小さくはならないことは驚異的である。

例えばフルクトサミン類縁体としてＤＭＦ　’ｉ使用す
る場合、測定感度が低下することなく試料／試薬−容量
比を０．０２に低下させることができる。

非特異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘
発する試料成分を酵素系及び／又は非酵素系の酸化剤１
種以上並びに場合により界面活性剤及び／又は塩１種以
上により除去して、血液又は血液から誘導された試料中
のフルクトサミンを測定する本発明方法は溶液中だけで
実施し得るものではない。乾式化学の試飄用担体を用い
る測定法に転用することができる。この場合、１種以上
の酵素系及び／又は非酵素系の酸化剤差びに場合により
１釉以上の界面活性剤及び／又は塩全場合により他の助
剤と共に公知方法で固体の担体上に施す。好適な固体の
担体並びにそのような担体上に物質もしくは物質混合物
を施す方法＃ｉｓ業者に公知である。例えば、担持材料
としてけ、紙、フリース等のような可能な吸収性材料す
べてが好適である。施すべき物質は含反溶液１６以上に
取ることができる。

この溶液で担体を含浸するか又は噴霧する。引続いて乾
燥させる。

他の可卵性ば１種以上の酸化剤並びに場合により界面活
性剤及び／又？″ｉ塩並びに場合により他の助剤を試薬
フィルム中にもたらすことである。この際に物質もしく
ｈ物質混合物を例えば西ドイツ国特許第１５９８１５３
号明細書又は西ドイツ国特許公開第２９１０１３４号明
細書により試薬フィルムに加工する。

妨害作用をする非特異的に還元作用をする試料成分及び
／又は混濁を誘発する試料成分を除去するに当り、初め
に測定すべき試料を、１種以上の酸化剤並びに場合によ
り１種以上の界面活性剤及び／又は塩を含有する担体と
接触させる。十分な接触後、前処理した試料を、呈色反
応に必要な他の反応成分を含有する層に移す。

その際に生じる色の変化を公知のように測光法により、
ケ１えばレフレフトメータにより測定する。Ｍｕ反応と
呈色反応との間の時間的間隔については前記の説明が該
当する。

本発明の他の目的は加液又は血液から誘導された試料中
の血清フルクトサミン金貸を特異的に測定するための試
薬混合物であり、これは非特異的に還元作用をする試料
成分及び／又は混濁を誘発する試料成分を除去するため
の試薬、範囲１０．５〜１２．５のｐＨ値を有する緩衝
剤を含有する緩衝域変換試薬及びフルクトサミンを検出
するための呈色試薬より成ることを％徴とする。この＃
：桑混合ｖｌＪは、本発明方法の英雄に必要であるすべ
ての成分を含有する。

血液又は血液から誘導された試料中の非特異的に還元作
用をする試料成分及び／又は混濁を誘発する試料成分を
除去する試薬は、はぼ中性の…値を有する緩衝剤中に酵
素糸−及び／又は非酵素系酸化剤１種又は数種並びに場
合によりペルオキシダーゼ及び／又はカメラーゼ、及び
／又はリパーゼ並びに場合により界面活性剤及び／又は
り賃酸の墳１〜又は数種並びに場合により常用の添加物
より成る。

特に、酵素系酸化剤にはアスコルベートオキシダーゼ、
ビリルビンオキシダーゼ及びウリカーゼ並びに非酵素糸
酸化剤だけ特に次亜塩素酸塩及び次亜塩素酸塩供与化合
物が挙げられる。

血液及び／又は血液から誘導される試料中の非特異的に
還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘発する試料
成分を除去するための本発明による試薬中ＶＣ場合によ
り含有されている界面活性剤はアニオン糸又は非イオン
系であってよ−。とりわけアニオン系界面活性剤として
は胆汁酸及びその複合体のアルカリ塩又はアルカリ土類
塩が優れているが、非イオン糸界面活性剤に関しても広
範な種類の界面活性剤から選択することができる。特に
、１分子当りアルコール部分中にＯ原子８〜２０個を有
しかつグリコール単位４〜１５個を有する直鎖状又は分
枝鎖状のフルキル−又はアルキルアリール−アルコール
−ポリグリコールエーテルが好適であることが明らかに
なった。しかし添加する界面活性剤は付加的にカチオン
系界面活性剤、例えばオキシエチルアルキルアンモニク
ムホス７エート（例えばＤｅｈｙｑｕａｒｔＲ８Ｐ　、
　Ｈｅｎｋｅ１社視）であってもよい。

クロラミンＴと同時にカチオン系界面活性剤、例えばデ
ハイクオートＲ８Ｐとを含有する場合に、特に酵素系及
び／又は非酵素糸酸化剤の混合物が有用である。

本発明による試薬に関しては１Ｍ酸の塩として、塩酸又
は５ＪｆＬ酸のアルカリ塩又はアルカリ土類塩が好適で
あることが明らかになった。特に塩化カリウム又は塩化
ナトリウムが優れて因る。

本発明による試薬のほぼ中性の閉鎖を達成するのに必要
な緩衝剤は範囲６〜９、殊に７〜８．５、特に７．５〜
８．０を有する。殊に、緩衝剤の濃度は１０〜１００ミ
リモル／１．特に２０〜７０ミリモル／ｌである。水性
リン酸カリウム緩衝液が特に有利であることが明らかに
なった。

実画例 次に本発明による方法及び試薬混合物について実施伊ｉ
につき詳説する。

例　　１ Ａ）試薬の組成 ａ）試薬■（第１恒温保付工程） ｂ）試薬■（第２恒温保持工程） Ｂ）試験の実施 波長　　５４６　ｎｍ 温度　　６７°Ｃ 層厚　　１０Ｂ（牛マイクロキュベツト）キュベツト中
に次のものをピペット装入し：５分間恒温保持し、次い
で試薬■を混合し、改めて恒温保持し、かつ試薬Ｈの添
加後、一定時間△ｔ（１〜５分１８ｊｌ　’）の色素形
成の動力学（ΔＥＰないしはΔＥＲＬ）′ｆｔ測定する
。

△Ｅ篇（△ＥＰセ町、）７６℃ 試料に関して記載したように、既知室シのＤＭＰを含む
襟率溶液（Ｓ）を測定する。測定値からａｍ＊に次のよ
うに計算する： △ｘ　　−（△Ｅ８−△ＥＲＬ）／Δを標準 試料中の３度は′１−デンキシモルホリノーフルクトー
ス単位’　（ＤＭＦ　１ｍ位）で表わす。計算のために
ロツシュ（Ｒｏｃｈｅ　）社（スイス国、バーゼル在）
のフルクトサミン試験からの補正標準（製品屑０７−１
１２１−７）を使用した。

第１図に、本発明方法による試験パッチの吸光度（曲線
１）とジョＶ゛ンン及びその他共著、１クリ二カ・キミ
カ・アクタ′、１２７巻、８７〜９５頁（１９８２年）
による方法の吸光度（曲線２）とが比較して図示されて
おり、この際に試料として前記のロッシュ社のフルクト
サミン試験からの補正Ｗｅを使用した。

例　　２ ＠線性 不発明方法による吸光度変化の直線性を試験するために
、ヒト血清を１−デオキシ−１−モルホリノフルクトー
ス（ＤＭＦ　）により段階的ｔｃ増加させかつ試験を例
１に相応して実施した。

第２図から明らかなように、少なくとも１０ミ’）モル
／ｌまでの吸光度変化７分は試料中のＤＭＦ疫度に直線
的に比例する。

例　　３ 不発明によるフルクトサミンの測定法における測定シグ
ナルに対するビリルビンの作用を試験するためＫ、ヒト
血清中のビリルビンを１２′Ｉｎ９／ｄＡ’の濃度まで
段階的に高めかつ試験を例１に記載したように実施した
。

第６図から明らかなように、ジョンソン及びその他［’
　Ｃ１１ｎ、　ａｈｉｍ、　Ａｃｔａ　’、１２７巻、
８７〜９５頁（１９８２年）〕の方法によるフルクトサ
ミン測定（曲［１）ではビリルビン濃度２■／ｄｌで測
定シグナルは約４０％上昇し、一方不発明方法（曲線２
）ではビリルビン少なくとも１２■／ｄＡ！　ｆでは全
く影響を受けない。

例　　４ 尿酸の測定シグナルに対する作用を測定するために、異
なる量の尿酸を含むヒト血清を使い、かつ一方ではジョ
ンソン及びその他（’　０１ｉｎ。

Ｏｈｌｍ、　ＡＣｔａ　“、前記文献）の方法により、
他方では本発明方法により例１と同様にしてＥ／を一級
図をプロットした。

ジョンソン及びその他によるｔＡ、ｈでは既に尿ｂｅ度
１３．７＃／ｄｌで出発値〜（尿２６．９ｍ９／ｄ１　
）よりも１６％高いシグナルが認められ、一方不発明方
法では濃度的３０　ｍ９／ｄ１までの尿酸で実質的に作
用を受けなかった。

例　　５ 測定シグナルに対するアスコルビン酸の作用を測定する
に当り、ヒト血清を異なる量のアスコルビン酸で増ｔＬ
、かつ一方ではジョンソン及びその他（’　０１ｉｎ、
　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ　’前記文献）の方法により、
他方で本発明方法により例１と同様にしてＥ／ｌ−ｉ図
をプロットした。

ジョンソン及びその他による試験ではアスコルビン酸き
度の上昇と共に△ｍＥ、分のパーセントは上昇し、本発
明方法による試験では約５０■／ｌの製置までは実質的
に作用されない。

例　　６ 例１に卯応する試験バッチにおいて、試料として弧度に
過脂肪血症の血清（トリグリセリド２００Ｌｌ■／ｄｌ
）を使用した。

第４図から明らかなように、第１恒温保持工程で既に５
分後には完全で継続的な混濁の除去が達成される。

例　　７ 測定シグナルに対する医薬の作用を測定するために異な
るシの種々の医業又は医薬分解生成物を含むヒト血清を
使用しかつジョンソン及びその他（′クリニカφキミカ
・アクタ″、前記文献）による方法及び本発明方法によ
り例１と同様にしてＥ／ｌ−ｉ図を作成した。

例　　８ する溶液を、一方では盲検値測定のために１−デオキシ
モルホリノフルクトースｌ：＋Ｍｙ）ｋｍ加せすに、他
方は一定滑のＤＭＦ　（２，５ミ’）モル／！りを添加
して製造した。この試験は、ジョンソン及びその化！（
′クリ二カ暑キミカ・アクタ′、前記文献）の方法によ
りかつまた本発明方法により例１に相応して実施した。

表から明らかなように、試料中のＤＭＦにより発生した
測定シグナルは、ジョンソン及びその他による試験では
蛋白質濃度の上昇と共に非常に強く低下し、本発明方法
による試験では少なくともｎ５Ａ１００．９／ｌまでは
実質的に蛋白質量の作用を受けない。

例　　９ Ａ）試薬の組成 ａ）試薬Ｉ（第１恒温保持工程） ｂ）試薬■（第２恒温保持工程） Ｂ）試験の実施 試Ｕは日立７０４自動分析機を使って実施した。

波長　５４６　ｎｍ 温度　６７６Ｃ 層厚　　１０ｍ麓（半マイクロキュベツト）キュベツト
中に次のものをピペット装入し、５分間恒温保持し、引
続いて次のものを添加混合し、 再度恒温保持し、かつ試薬■の添加後一定時間Δｔ　　
（８〜１０分間）の色素形成の動力学（△Ｈｐもしくは
△ＥＲＬ）を測定した。

フルクトサミンの濃度は例１と同様にＤＭＦ単位として
測定し、第５ａ図の縦軸にプロットした（ミリモル／ｌ
）。これらの結果は、ＨＰＬＯ−参考法（’　Ｊ、　Ｃ
ｈｉｎ、　Ｏｈｅｍ、　０１ｉｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　’、１９Ｓ、８１〜８７頁（１９８１年）〕によりフ
フロンを測宇することにより得られた測定値に対してプ
ロットした。ＨＰＬＯ測定値としては、その都に拍動的
なピーク面積単位を使用した。

第５ｂｒ３！ＵＫは、伯加的にヘンケル社製のデハイク
オ−）　Ｒ８Ｐ　（ＤｅｈｙｑｕａｒｔＲ８Ｐ　）　１
．２％が試薬Ｉ中に含まれている場合の同様のフルクト
サミン測定の結果が図示されている。

第５Ｃ図は、付加的にクロラミンＴ２５０μモルが試薬
Ｉ中に含まれている場合の同様のフルクトサミン測定の
結果を示す。

第５ｄ図は、付加的に試薬！中にデハイクオートＲ８Ｆ
１．２％もクロラミンＴ　２５０μモルも含まれている
場合の同様のフルクトサミン測定の結果を示す。

これらの第５ａ図〜第５ｄ図より、特にクロラミンＴと
デハイクオート　ＳＦとを組合せると明らかに＠との交
点が低下している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、試験バッチの吸光度を本発明方法（曲線１）
とジョンソン及びその他による方法（曲線２）により測
定した結果を示す線図、第２図一本発明方法による、Ｄ
ＭＦ　ｇ度に対する吸光度変化の＠急性を示す線図、第
６図はフルクトサミン金員測定法におけるビリルビンの
測定シグナルに対する作用を示す線図、第４図は本発明
による過脂肪血症血清の澄明化を示す線図、第５ａ図Ｄ
ＭＦ濃度をフロシンに対してプロットして示す線図、第
５ｂ図は付加的にデ／％イクオ−）Ｒ８Ｆを添加した場
合のＤＭＦ　１ｌｉ１度とフロシンとの相関関係を示す
線図、第５Ｃ図は付加的にクロラミンＴを添加した場合
のＤＭＦ　濃度とフロシンとの相関関係を示す？ＩｉＡ
図、第５ｄ図は付加的にデハイクオートＲ８Ｐとクロラ
ミンＴとを添加した場合のＤＭＦ　濃度と７０シンとの
相関関係を示す線図である。 第４区 フロシシＨＰＬＣ ×工学血清　　　　・糖ヌ病血清 フロシンＨＰＬＣ Ｘ正常血清　　　　　・糖尿病血清 第５０図 フロシン　ＨＰＬＣ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクト
   サミン含量を、好適な呈色試薬と反応させかつその際に
   生じた色の変化を測定することにより測定する方法にお
   いて、呈色反応の前に、非特異的に還元作用をする試料
   成分及び／又は混濁を誘発する試料成分をほぼ中性のｐ
   Ｈ値で除去し、引続いてｐＨ値をｐＨ１０〜１２に調節
   しかつ呈色試薬を添加することを特徴とする、血液又は
   血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を
   測定するための方法。 ２、非特異的に還元作用をする試料成分を除去するため
   には試料を、場合によりペルオキシダーゼ及び／又はカ
   タラーゼと一緒に酵素系−及び／又は非酵素系酸化剤１
   種又は数種で処理する特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３、酵素系酸化剤としてアスコルベートオキシダーゼ、
   ビリルビンオキシダーゼ及び／又はウリカーゼ並びに非
   酵素系酸化剤として次亜塩素酸塩又は次亜塩素酸塩供与
   化合物を使用する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、付加的に界面活性剤１種又は数種を添加する特許請
   求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の方
   法。 ５、非酵素系酸化剤としてＮ−クロル−ｐ−トルエンス
   ルフアミド及び界面活性剤としてオキシエチルアルキル
   アンモニウムホスフェートを添加する特許請求の範囲第
   ４項記載の方法。 ６、混濁を誘発する試料成分を除去するためには試料を
   、場合により界面活性剤及び／又は強酸の塩１種又は数
   種と一緒にリパーゼで処理する特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ７、界面活性剤としてはカチオン系、アニオン系及び／
   又は非イオン系界面活性剤及び強酸の塩としては塩酸又
   は硫酸のアルカリ塩又はアルカリ土類塩を使用する特許
   請求の範囲第６項記載の方法。 ８、非特異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁
   を誘発する試料成分の除去を範囲ｐＨ６〜９のｐＨ値で
   行なう特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれか
   １項記載の方法。 ９、測定すべきフルクトサミンを含有する試料に、非特
   異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘発す
   る試料成分を除去するために予め恒温保持した後で範囲
   １０〜１２のｐＨ値に緩衝域変換するため範囲１０．５
   〜１２．５のｐＨ値を有する緩衝剤を加える特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 １０、範囲１０．５〜１２．５にｐＨ値を有する緩衝剤
   を加えるのと同時に呈色試薬を添加する特許請求の範囲
   第９項記載の方法。 １１、血液又は血液から誘導された試料中の血清フルク
   トサミン含量を特異的に測定するための試薬混合物にお
   いて、該混合物が、非特異的に還元作用をする試料成分
   及び／又は混濁を誘発する試料成分を除去するための試
   薬、範囲１０．５〜１２．５のｐＨ値を有する緩衝剤を
   含有する緩衝域変換試薬及びフルクトサミンを検出する
   ための呈色試薬より成ることを特徴とする、血液又は血
   液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を測
   定するための試薬混合物。 １２、血液又は血液から誘導された試料中の非特異的に
   還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘発する試料
   成分を除去する試薬において、該試薬がほぼ中性のｐＨ
   値を有する緩衝剤中に酵素系−及び／又は非酵素系酸化
   剤１種又は数種並びに場合によりペルオキシダーゼ及び
   ／又はカタラーゼ、及び／又はリパーゼ並びに場合によ
   り界面活性剤及び／又は強酸の塩１種又は数種並びに場
   合により常用の添加物を含有することを特徴とする試料
   成分除去用試薬。 １３、酵素系酸化剤としてアスコルベートオキシダーゼ
   、ビリルビンオキシダーゼ及び／又はウリカーゼ並びに
   非酵素系酸化剤として次亜塩素酸塩又は次亜塩素酸塩供
   与化合物を含有する特許請求の範囲第１２項記載の試薬
   。 １４、界面活性剤としてカチオン系、アニオン系及び／
   又は非イオン系界面活性剤及び強酸の塩としては塩酸又
   は硫酸のアルカリ塩又はアルカリ土類塩を含有する特許
   請求の範囲 第１２項又は第１３項記載の試薬。 １５、非酵素系酸化剤としてＮ−クロル−ｐ−トルエン
   スルファミド及びカチオン系界面活性剤としてオキシエ
   チルアルキルアンモニウムホスフエートを含有する特許
   請求の範囲 第１２項から第１４項までのいずれか１項記載の試薬。 １６、緩衝剤が範囲６〜９のｐＨ値を有する特許請求の
   範囲第１２項から第１５項までのいずれか１項記載の試
   薬。