JPH0640836B2 - 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 - Google Patents
血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤Info
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- JPH0640836B2 JPH0640836B2 JP62149317A JP14931787A JPH0640836B2 JP H0640836 B2 JPH0640836 B2 JP H0640836B2 JP 62149317 A JP62149317 A JP 62149317A JP 14931787 A JP14931787 A JP 14931787A JP H0640836 B2 JPH0640836 B2 JP H0640836B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、血液又は血液から誘導された試料中の血清フ
ルクトサミン含量を特異的に測定する際に妨害的な試料
成分をフルクトサミン含量の測定前に除去する方法に関
する。
ルクトサミン含量を特異的に測定する際に妨害的な試料
成分をフルクトサミン含量の測定前に除去する方法に関
する。
従来の技術 血清フルクトサミン含量とは、非酵素的にゴリコシル化
された血清蛋白質の全含量を表わす。これは、血清グル
コースがそのカルボニル基を介して遊離蛋白質アミノ基
と一緒にシツフ塩基を形成することにより生じる。引続
いて、これはアマドリ再配列により安定なケト−アミン
結合を有するフルクトサミンに移行する。この反応機構
については例えばＥ．シユライヒヤー（Schleicher）及
びＯ．Ｈ．ヴイーラント（Wieland）が詳しく研究した
〔“J.Clin.Chem.Clin.Biochem.”、１９巻、８１〜８
７頁（１９８１年）〕。
された血清蛋白質の全含量を表わす。これは、血清グル
コースがそのカルボニル基を介して遊離蛋白質アミノ基
と一緒にシツフ塩基を形成することにより生じる。引続
いて、これはアマドリ再配列により安定なケト−アミン
結合を有するフルクトサミンに移行する。この反応機構
については例えばＥ．シユライヒヤー（Schleicher）及
びＯ．Ｈ．ヴイーラント（Wieland）が詳しく研究した
〔“J.Clin.Chem.Clin.Biochem.”、１９巻、８１〜８
７頁（１９８１年）〕。
血清フルクトサミンの半減期は、ケト−アミン結合が安
定であるため、半減期が平均約２１日間である血清蛋白
質と実質的に同一である。相応する研究についてはＬ．
Ｙ．セン（Seng）及びＭ．Ｊ．ステイリー（Staley）共
著、“ジヤーナル・オブ・クリニカル・ケミストリー
（J.Clin.Chem.）”、３２巻、５６０頁（１９８６年）
に公開されている。
定であるため、半減期が平均約２１日間である血清蛋白
質と実質的に同一である。相応する研究についてはＬ．
Ｙ．セン（Seng）及びＭ．Ｊ．ステイリー（Staley）共
著、“ジヤーナル・オブ・クリニカル・ケミストリー
（J.Clin.Chem.）”、３２巻、５６０頁（１９８６年）
に公開されている。
フルクトサミン形成のスケールは血中グルコース濃度に
比例する。周知のように、この濃度は糖尿病患者、特に
不十分な食餌性及び薬物性の代謝調節では、顕著な病理
症状とも結びついて激しく変動し得る。
比例する。周知のように、この濃度は糖尿病患者、特に
不十分な食餌性及び薬物性の代謝調節では、顕著な病理
症状とも結びついて激しく変動し得る。
血中グルコースの測定は、採血時点での代謝状態につい
て情報を医者に与えるだけである。これに対し、それま
での１２０日間の代謝状態に関する長期間のコントロー
ルはグリコシル化ヘモグロビン（HbA1）により可能であ
る。血清フルクトサミンの測定はその半減期故に、養生
及び治療手段による糖尿病患者の代謝誘導を約３週間の
中期間について遡及して測定するのに好適である。それ
故、確立された臨床における診断パラメータの血中グル
コース並びにグリコシル化ヘモグロビン（HbA1）と共
に、信頼性のある、特異的で実際に使える血清フルクト
サミン測定法によつて、糖尿病患者を管理するための診
断領域を有用な中期パラメータに拡大することができ
る。
て情報を医者に与えるだけである。これに対し、それま
での１２０日間の代謝状態に関する長期間のコントロー
ルはグリコシル化ヘモグロビン（HbA1）により可能であ
る。血清フルクトサミンの測定はその半減期故に、養生
及び治療手段による糖尿病患者の代謝誘導を約３週間の
中期間について遡及して測定するのに好適である。それ
故、確立された臨床における診断パラメータの血中グル
コース並びにグリコシル化ヘモグロビン（HbA1）と共
に、信頼性のある、特異的で実際に使える血清フルクト
サミン測定法によつて、糖尿病患者を管理するための診
断領域を有用な中期パラメータに拡大することができ
る。
原則的に簡単に実施し得る血清フルクトサミン測定法
は、ヨーロツパ特許第００８５２６３号明細書（Baker
により）及びジヨンソン（Johnson）及びその他共著、
“クリニカ・キミカ・アクタ（Clin.Chim.Acta）”、１
２７巻、８７〜９５頁（１９８２年）に記載された。該
測定法は、ケトアミン型を水性アルカリ性媒体中で、例
えばニトロテトラゾリウムブルーのようなテトラゾリウ
ム塩に還元的に作用して、ホルマザン色素を供給するエ
ノール形に変換することに基いている。規定した時間３
７℃で光度測定した色素形成の程度は存在するフルクト
サミンの量に比例する。
は、ヨーロツパ特許第００８５２６３号明細書（Baker
により）及びジヨンソン（Johnson）及びその他共著、
“クリニカ・キミカ・アクタ（Clin.Chim.Acta）”、１
２７巻、８７〜９５頁（１９８２年）に記載された。該
測定法は、ケトアミン型を水性アルカリ性媒体中で、例
えばニトロテトラゾリウムブルーのようなテトラゾリウ
ム塩に還元的に作用して、ホルマザン色素を供給するエ
ノール形に変換することに基いている。規定した時間３
７℃で光度測定した色素形成の程度は存在するフルクト
サミンの量に比例する。
この試験法は試料として血清を使用する際に妨害用を受
ける。それというのもビリルビン及び尿酸のような天然
血清成分もテトラゾリウム塩に対して還元的に作用する
からである。例えばα−メチルドーパのような医薬、例
えばアセチルサリチル酸の代謝物であるゲンチジン酸の
ような医薬分解生成物並びにアスコルビン酸も血清中の
濃度に相応して測定結果の誤差をもたらす。
ける。それというのもビリルビン及び尿酸のような天然
血清成分もテトラゾリウム塩に対して還元的に作用する
からである。例えばα−メチルドーパのような医薬、例
えばアセチルサリチル酸の代謝物であるゲンチジン酸の
ような医薬分解生成物並びにアスコルビン酸も血清中の
濃度に相応して測定結果の誤差をもたらす。
更に従来は血清フルクトサミン測定は、試料毎に変動す
る全蛋白質含量に帰因する妨害を受けた。これは測定値
の変動をもたらし、従つて測定法の感度は小さい。これ
らの妨害作用は基質効果（Matrixeffekt）として知られ
ている。この効果は、例えば一般に標準溶液を製造する
際に該当するように、付加的な蛋白質の添加の際に特に
生じる。蛋白質量が増加するにつれてフルクトサミンと
呈色試薬との間の反応は緩慢になる〔Ｅ．Ｊ．ヒンドレ
（Hindle）及びその他共著、“Ann.Clin.Biochem.”、
２２巻、８４〜８９頁（１９８５年）〕。
る全蛋白質含量に帰因する妨害を受けた。これは測定値
の変動をもたらし、従つて測定法の感度は小さい。これ
らの妨害作用は基質効果（Matrixeffekt）として知られ
ている。この効果は、例えば一般に標準溶液を製造する
際に該当するように、付加的な蛋白質の添加の際に特に
生じる。蛋白質量が増加するにつれてフルクトサミンと
呈色試薬との間の反応は緩慢になる〔Ｅ．Ｊ．ヒンドレ
（Hindle）及びその他共著、“Ann.Clin.Biochem.”、
２２巻、８４〜８９頁（１９８５年）〕。
他の困難が通脂肪血症の血清でフルクトサミン測定を行
なう場合に生じる。一般に、試料中のフルクトサミン濃
度が低い場合でも十分に大きい測定シグナルを得るため
に、試料／試薬−容量比０．１が必要である。しかしト
リグリセリド濃度が著しく高いと、前記のように高い試
料割合では生じる試験バツチの混濁が光度測定でマイナ
スに作用する。フルクトサミン測定は著しく困難とな
り、それだころか妨害される。
なう場合に生じる。一般に、試料中のフルクトサミン濃
度が低い場合でも十分に大きい測定シグナルを得るため
に、試料／試薬−容量比０．１が必要である。しかしト
リグリセリド濃度が著しく高いと、前記のように高い試
料割合では生じる試験バツチの混濁が光度測定でマイナ
スに作用する。フルクトサミン測定は著しく困難とな
り、それだころか妨害される。
発明が解決しようとする問題点 前記の欠点を有していない、血中又は血液から誘導され
た試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する
ための方法が必要になつている。本発の課題は、そのよ
うな方法を開示することであつた。
た試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する
ための方法が必要になつている。本発の課題は、そのよ
うな方法を開示することであつた。
問題点を解決するための手段 この課題は特許請求の範囲に記載の発明により解決され
る。血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクト
サミン含量を、好適な呈色試薬と反応させかつその際に
生じた色の変化を測定することにより特異的に測定する
際に、蛋白質基質効果を回避するための本発明方法は、
呈色反応の前に、試料を酵素系酸化剤及び／又は非酵素
系酸化剤１種又は数種及び界面活性剤１種又は数種によ
りｐＨ値６〜９で処理し、引き続いてpH値をpH１０〜１
２に調節しかつ呈色試薬を添加することを包含する。
る。血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクト
サミン含量を、好適な呈色試薬と反応させかつその際に
生じた色の変化を測定することにより特異的に測定する
際に、蛋白質基質効果を回避するための本発明方法は、
呈色反応の前に、試料を酵素系酸化剤及び／又は非酵素
系酸化剤１種又は数種及び界面活性剤１種又は数種によ
りｐＨ値６〜９で処理し、引き続いてpH値をpH１０〜１
２に調節しかつ呈色試薬を添加することを包含する。
非特異的に還元作用をする試料成分を除去するに当つて
は、試料に酵素系及び／又は非酵素系酸化剤１種又は数
種を加える。酵素系酸化剤としてアスコルベートオキシ
ダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ及び／又はウリカーゼ
並びに非酵素系酸化剤として次亜塩素酸塩又は次亜塩素
酸塩供与化合物を使用すると有利である。次亜塩素酸塩
供与化合物としては特にＮ−クロル−ｐ−トルエン−ス
ルフアミド（クロラミンＴ）が好適である。この化合物
は水との接触で徐々に次亜塩素酸を脱離する。これはア
ルカリ性ではなく、酸性乃至中性において有用な酸化剤
である。付加的にペルオキシダーゼ及び／又はカタラー
ゼを添加すると特に有利であることが明らかになつた。
は、試料に酵素系及び／又は非酵素系酸化剤１種又は数
種を加える。酵素系酸化剤としてアスコルベートオキシ
ダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ及び／又はウリカーゼ
並びに非酵素系酸化剤として次亜塩素酸塩又は次亜塩素
酸塩供与化合物を使用すると有利である。次亜塩素酸塩
供与化合物としては特にＮ−クロル−ｐ−トルエン−ス
ルフアミド（クロラミンＴ）が好適である。この化合物
は水との接触で徐々に次亜塩素酸を脱離する。これはア
ルカリ性ではなく、酸性乃至中性において有用な酸化剤
である。付加的にペルオキシダーゼ及び／又はカタラー
ゼを添加すると特に有利であることが明らかになつた。
測定すべき試料に酵素系及び／又は非酵素系酸化剤１種
又は数種を添加することにより、妨害的な還元作用の全
成分による妨害が徐かれ、即ち前記の酸化剤はビリルビ
ン、尿酸又はアスコルビン酸を酸化するばかりでなく、
他の還元作用をする物質、例えば医薬並びにその分解生
成物による妨害作用も除去する。１種以上の酸化剤の存
在において、そのような物質は治療濃度範囲で消失する
かあるいはその濃度が分析的にもはや重要ではない程度
に低下する。場合により存在するペルオキシダーゼは、
場合により発生する過酸化水素と共に付加的な酸化分解
工程を惹起し、これは酸化剤１種以上の作用性を付加的
に高める。場合により添加するカタラーゼは、とりわけ
過剰量の過酸化水素の除去に有用である。好適な界面活
性剤、有利にカチオン系界面活性剤、例えばオキシエチ
ルアルキルアンモニウムホスフエート（例えばHenkel社
製のDehyquartRSP）の添加により、驚異的に酸化作用が
高められる。酵素系及び／又は非酵素系酸化剤の混合物
がクロラミンＴとカチオン系界面活性剤、例えばオキシ
エチルアルキルアンモニウムホスフエート（例えばDehy
quartRSP）とを同時に含有すると特に有用である。カチ
オン系界面活性剤の濃度は０．５〜４容量％である。優
れた濃度範囲としてはデハイクオートＲＳＰに関しては
１〜２容量％が明らかになつた。
又は数種を添加することにより、妨害的な還元作用の全
成分による妨害が徐かれ、即ち前記の酸化剤はビリルビ
ン、尿酸又はアスコルビン酸を酸化するばかりでなく、
他の還元作用をする物質、例えば医薬並びにその分解生
成物による妨害作用も除去する。１種以上の酸化剤の存
在において、そのような物質は治療濃度範囲で消失する
かあるいはその濃度が分析的にもはや重要ではない程度
に低下する。場合により存在するペルオキシダーゼは、
場合により発生する過酸化水素と共に付加的な酸化分解
工程を惹起し、これは酸化剤１種以上の作用性を付加的
に高める。場合により添加するカタラーゼは、とりわけ
過剰量の過酸化水素の除去に有用である。好適な界面活
性剤、有利にカチオン系界面活性剤、例えばオキシエチ
ルアルキルアンモニウムホスフエート（例えばHenkel社
製のDehyquartRSP）の添加により、驚異的に酸化作用が
高められる。酵素系及び／又は非酵素系酸化剤の混合物
がクロラミンＴとカチオン系界面活性剤、例えばオキシ
エチルアルキルアンモニウムホスフエート（例えばDehy
quartRSP）とを同時に含有すると特に有用である。カチ
オン系界面活性剤の濃度は０．５〜４容量％である。優
れた濃度範囲としてはデハイクオートＲＳＰに関しては
１〜２容量％が明らかになつた。
特に脂肪血症試料の試験にあたつては、１種以上の酸化
剤に、場合によりパーゼを場合により界面活性剤１種以
上及び／又は強酸の塩と一緒に添加すると有利であるこ
とが明らかになつた。このような混合物を使用すること
により、混濁を誘発する物質を除去して次の呈色測定を
妨害しないようにすることができる。
剤に、場合によりパーゼを場合により界面活性剤１種以
上及び／又は強酸の塩と一緒に添加すると有利であるこ
とが明らかになつた。このような混合物を使用すること
により、混濁を誘発する物質を除去して次の呈色測定を
妨害しないようにすることができる。
妨害成分を除去するための前記物質を用いると、試料中
の変動する全蛋白質量による、基質効果として公知の測
定値変動もほとんど抑制されるかあるいは完全に除去さ
れることは驚異的である。
の変動する全蛋白質量による、基質効果として公知の測
定値変動もほとんど抑制されるかあるいは完全に除去さ
れることは驚異的である。
非特異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘
発する試料成分を除去するに当り、１種以上の酵素系及
び／又は非酵素系酸化剤並びに場合により１種以上の界
面活性剤及び／又は強酸の塩を好適な非還元性緩衝剤中
に含有する溶液と一緒に試料を恒温保持すると有利であ
ることが明らかになつた。この溶液の製造に当つては、
還元作用をせずかつその緩衝作用がほぼ中性のpH値であ
る緩衝物質すべてが好適である。pH６〜９、殊に７〜
８．５、特に７．５〜８．０のpH範囲が特に有利である
ことが明らかになつた。緩衝剤濃度は殊に１０〜１００
ミリモル／、特に２０〜７０ミリモル／である。特
に有利なものとしては水性カリウムリン酸塩緩衝液が特
に有利であることが明らかになつた。
発する試料成分を除去するに当り、１種以上の酵素系及
び／又は非酵素系酸化剤並びに場合により１種以上の界
面活性剤及び／又は強酸の塩を好適な非還元性緩衝剤中
に含有する溶液と一緒に試料を恒温保持すると有利であ
ることが明らかになつた。この溶液の製造に当つては、
還元作用をせずかつその緩衝作用がほぼ中性のpH値であ
る緩衝物質すべてが好適である。pH６〜９、殊に７〜
８．５、特に７．５〜８．０のpH範囲が特に有利である
ことが明らかになつた。緩衝剤濃度は殊に１０〜１００
ミリモル／、特に２０〜７０ミリモル／である。特
に有利なものとしては水性カリウムリン酸塩緩衝液が特
に有利であることが明らかになつた。
添加すべき酵素の濃度は除去すべき妨害作用をする化合
物の濃度に応じて決まる。一般に酵素濃度は０．０１〜
１００００Ｕ／mlである。例えば優れた濃度範囲は次の
通りである： ウリカーゼ １〜１５Ｕ／mlビリルビンオキシダ -ゼ ０．０５〜５Ｕ／mlアスコルベ -トオキシダ-ゼ ２〜２０Ｕ／mlリパ -ゼ ０．５〜５Ｕ／mlペルオキシダ -ゼ ０．５〜５Ｕ／mlカタラ -ゼ １００〜１００００Ｕ／ml これらの酵素の特に優れた濃度範囲は次の通りである：ウリカ -ゼ ２〜１０Ｕ／mlビリルビンオキシダ -ゼ ０．１〜１Ｕ／mlアスコルベ -トオキシダ-ゼ ５〜１５Ｕ／mlリパ -ゼ １〜３Ｕ／mlペルオキシダ -ゼ １〜３Ｕ／mlカタラ -ゼ ５００〜２０００Ｕ／ml。
物の濃度に応じて決まる。一般に酵素濃度は０．０１〜
１００００Ｕ／mlである。例えば優れた濃度範囲は次の
通りである： ウリカーゼ １〜１５Ｕ／mlビリルビンオキシダ -ゼ ０．０５〜５Ｕ／mlアスコルベ -トオキシダ-ゼ ２〜２０Ｕ／mlリパ -ゼ ０．５〜５Ｕ／mlペルオキシダ -ゼ ０．５〜５Ｕ／mlカタラ -ゼ １００〜１００００Ｕ／ml これらの酵素の特に優れた濃度範囲は次の通りである：ウリカ -ゼ ２〜１０Ｕ／mlビリルビンオキシダ -ゼ ０．１〜１Ｕ／mlアスコルベ -トオキシダ-ゼ ５〜１５Ｕ／mlリパ -ゼ １〜３Ｕ／mlペルオキシダ -ゼ １〜３Ｕ／mlカタラ -ゼ ５００〜２０００Ｕ／ml。
添加する次亜塩素酸塩もしくは次亜塩素酸塩供与化合物
の濃度も除去すべき妨害作用をする化合物の濃度により
決定する。一般に、次亜塩素酸塩及び次亜塩素酸塩供与
化合物は濃度５０〜６００μモル／、殊に１５０〜３
００μモル／で使用する。
の濃度も除去すべき妨害作用をする化合物の濃度により
決定する。一般に、次亜塩素酸塩及び次亜塩素酸塩供与
化合物は濃度５０〜６００μモル／、殊に１５０〜３
００μモル／で使用する。
界面活性剤はカチオン系以外にアニオン系又は非イオン
系の界面活性剤であつてもよい。アニオン系界面活性剤
としては、胆汁酸及びその複合体のアルカリ塩、アルカ
リ土類塩が優れている。アニオン系界面活性剤の有利な
濃度は２〜１０ミリモル／である。濃度４〜６ミリモ
ル／の胆汁酸ナトリウムが特に有利であることが明ら
かになつた。
系の界面活性剤であつてもよい。アニオン系界面活性剤
としては、胆汁酸及びその複合体のアルカリ塩、アルカ
リ土類塩が優れている。アニオン系界面活性剤の有利な
濃度は２〜１０ミリモル／である。濃度４〜６ミリモ
ル／の胆汁酸ナトリウムが特に有利であることが明ら
かになつた。
非イオン系界面活性剤としては、広範な種類の界面活性
剤から選択することができる。殊に、１分子当りアルコ
ール部分にＣ原子８〜２０個及びグリコール単位４〜１
５個を有する直鎖状又は分枝鎖状のアルキル−又はアル
キルアリール−アルコール−ポリグリコールエーテルが
好適であることが明らかになつた。特に有利な活性化作
用は、１分子当りアルコール部分にＣ原子８〜１２個及
びグリコール単位４〜８個を有する直鎖状及び分枝鎖状
のアルキル−アルコール−ポリグリコールエーテルが及
ぼす。
剤から選択することができる。殊に、１分子当りアルコ
ール部分にＣ原子８〜２０個及びグリコール単位４〜１
５個を有する直鎖状又は分枝鎖状のアルキル−又はアル
キルアリール−アルコール−ポリグリコールエーテルが
好適であることが明らかになつた。特に有利な活性化作
用は、１分子当りアルコール部分にＣ原子８〜１２個及
びグリコール単位４〜８個を有する直鎖状及び分枝鎖状
のアルキル−アルコール−ポリグリコールエーテルが及
ぼす。
本発明による血清フルクトサミン含量の特異的測定法に
は、アルコール部分の構造が単一であるか又はアルコー
ル部分の構造が数種の異なつているポリグリコールエー
テルからの混合物であつてよい非イオン系界面活性剤が
好適である。１分子当り平均して４個のグリコール単位
を有するイソデカノールポリグリコールエーテル〔オキ
セタール（Oxetal）ＲＩＤ１０４、Zschimmer & Schwar
z社製、Lahnstein在〕及び１分子当り平均して６個のグ
リコール単位を有するｎ−デカノールポリグリコールエ
ーテル（プロドウクト（Produkt）ＲＴ２４０Ｒ、同社
製）からの混合物が特に優れている。本発明により、非
特異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘発
する試料成分の除去に使用する非イオン系界面活性在の
濃度は０．０５〜１５重量％である。特に優れた濃度範
囲としては、オキセタールＲＩＤ１０４に関しては０．
１〜１％、特に有利には０．２〜０．５％が明らかにな
つた。プロドウクトＲＴ２４０Ｒは濃度１〜１０％、特
に有利には２〜５％で使用することができる。
は、アルコール部分の構造が単一であるか又はアルコー
ル部分の構造が数種の異なつているポリグリコールエー
テルからの混合物であつてよい非イオン系界面活性剤が
好適である。１分子当り平均して４個のグリコール単位
を有するイソデカノールポリグリコールエーテル〔オキ
セタール（Oxetal）ＲＩＤ１０４、Zschimmer & Schwar
z社製、Lahnstein在〕及び１分子当り平均して６個のグ
リコール単位を有するｎ−デカノールポリグリコールエ
ーテル（プロドウクト（Produkt）ＲＴ２４０Ｒ、同社
製）からの混合物が特に優れている。本発明により、非
特異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘発
する試料成分の除去に使用する非イオン系界面活性在の
濃度は０．０５〜１５重量％である。特に優れた濃度範
囲としては、オキセタールＲＩＤ１０４に関しては０．
１〜１％、特に有利には０．２〜０．５％が明らかにな
つた。プロドウクトＲＴ２４０Ｒは濃度１〜１０％、特
に有利には２〜５％で使用することができる。
混濁を除去する作用は、反応溶液中のイオン濃度が高い
と高められる。このために、アルカリ性pH範囲でも溶解
している強酸の塩の添加が有利であると明らかになつ
た。塩酸又は硫酸のアルカリ塩又はアルカリ土類塩が優
れている。塩化カリウム又は塩化ナトリウムを使用する
と特に優れている。添加する強酸の塩の濃度は２０〜１
００ミリモル／である。塩を濃度４０〜６０ミリモル
／で添加すると特に優れている。
と高められる。このために、アルカリ性pH範囲でも溶解
している強酸の塩の添加が有利であると明らかになつ
た。塩酸又は硫酸のアルカリ塩又はアルカリ土類塩が優
れている。塩化カリウム又は塩化ナトリウムを使用する
と特に優れている。添加する強酸の塩の濃度は２０〜１
００ミリモル／である。塩を濃度４０〜６０ミリモル
／で添加すると特に優れている。
非特異的に還元作用をする試料成分及び／又は濁濁を誘
発する試料成分の除去は、温度２５〜４０℃、殊に３７
℃で、１〜１５分間、殊に２〜６分間で行なう。恒温保
持時間な、非特異的に還元作用をする試料成分及び混濁
を誘発する試料成分の量並びにそれらの除去に使用する
酵素系及び／又は非酵素系酸化剤の量に相応する。
発する試料成分の除去は、温度２５〜４０℃、殊に３７
℃で、１〜１５分間、殊に２〜６分間で行なう。恒温保
持時間な、非特異的に還元作用をする試料成分及び混濁
を誘発する試料成分の量並びにそれらの除去に使用する
酵素系及び／又は非酵素系酸化剤の量に相応する。
非特異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘
発する試料成分を除去するための恒温保持は、使用する
酵素の至適pH故にほぼ中性のpHで実施するが、呈色試薬
とフルクトサミンとの間の呈色反応はpH１０〜１２で進
行するので、恒温保持の後に緩衝域変換をする必要があ
る。pH値の上昇は、調節すべきpH値を若干上廻るpH値を
有する緩衝剤により行なう。pH１０．５〜１２．５、特
にpH１０．７〜１２．２を有する緩衝剤が特に有利であ
る。そのために炭酸塩緩衝剤を使用すると有利であり、
その濃度は１５０〜３００ミリモル／、特に１８０〜
２２０ミリモル／である。
発する試料成分を除去するための恒温保持は、使用する
酵素の至適pH故にほぼ中性のpHで実施するが、呈色試薬
とフルクトサミンとの間の呈色反応はpH１０〜１２で進
行するので、恒温保持の後に緩衝域変換をする必要があ
る。pH値の上昇は、調節すべきpH値を若干上廻るpH値を
有する緩衝剤により行なう。pH１０．５〜１２．５、特
にpH１０．７〜１２．２を有する緩衝剤が特に有利であ
る。そのために炭酸塩緩衝剤を使用すると有利であり、
その濃度は１５０〜３００ミリモル／、特に１８０〜
２２０ミリモル／である。
公知のように、アルカリ性範囲で呈色試薬を添加するこ
とによりフルクトサミンの還元作用を可視化することが
できる。有利にはこのためにテトラゾリウム塩を使用
し、そのホルマザン色素形成は視覚的に又は測光法によ
り追跡することができる。テトラゾリウム塩としては、
“メソツズ・オブ・エンチマチツク・アナライシス（Me
thods of Enzymatic Analysis）”〔Ｈ．Ｕ．ベルクマ
イヤ（Bergmeyer）著、第３版、第Ｉ巻、２００頁、フ
エアラーク・ヒエミー・ヴアインハイム（Verlag Chemi
e Weinheim）出版（１９８３年）〕に記載されているも
のが優れている。ニトロテトラゾリウムブルー（NBT）
又は３−（４′，５′−ジメチルチアゾリル−２）−
２，４−ジフエニル−テトラゾリウムブロミド（MTT）
が特に好適である。呈色試薬は、緩衝域変換の後でも、
緩衝剤と同時にでも試験バツチに添加することができ
る。この際に、呈色試薬を緩衝域変換に必要な緩衝剤中
に溶解すると有利であることが明らかになつた。テトラ
ゾリウム塩の場合、濃度０．２〜２ミリモル、特に０．
４〜１．５ミリモルが有利であることが明らかになつ
た。
とによりフルクトサミンの還元作用を可視化することが
できる。有利にはこのためにテトラゾリウム塩を使用
し、そのホルマザン色素形成は視覚的に又は測光法によ
り追跡することができる。テトラゾリウム塩としては、
“メソツズ・オブ・エンチマチツク・アナライシス（Me
thods of Enzymatic Analysis）”〔Ｈ．Ｕ．ベルクマ
イヤ（Bergmeyer）著、第３版、第Ｉ巻、２００頁、フ
エアラーク・ヒエミー・ヴアインハイム（Verlag Chemi
e Weinheim）出版（１９８３年）〕に記載されているも
のが優れている。ニトロテトラゾリウムブルー（NBT）
又は３−（４′，５′−ジメチルチアゾリル−２）−
２，４−ジフエニル−テトラゾリウムブロミド（MTT）
が特に好適である。呈色試薬は、緩衝域変換の後でも、
緩衝剤と同時にでも試験バツチに添加することができ
る。この際に、呈色試薬を緩衝域変換に必要な緩衝剤中
に溶解すると有利であることが明らかになつた。テトラ
ゾリウム塩の場合、濃度０．２〜２ミリモル、特に０．
４〜１．５ミリモルが有利であることが明らかになつ
た。
非特異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘
発する試料成分の除去後に緩衝域変換するに当つては、
試験バツチのpH値が呈色試薬の存在で１０〜１２、殊に
１０．３〜１０．６であるような量の緩衝剤を添加す
る。
発する試料成分の除去後に緩衝域変換するに当つては、
試験バツチのpH値が呈色試薬の存在で１０〜１２、殊に
１０．３〜１０．６であるような量の緩衝剤を添加す
る。
緩衝域変換した溶液は温度２５〜４０℃、殊に３７℃で
恒温保持する。呈色試薬の還元をベースとする色の変化
は緩衝域変換後に一定の時間で、殊に１〜１５分で測光
法により追跡する。第１回の測定は緩衝液変換後１〜１
０分間で、最後の測定は緩衝液変換後２〜１５分間で行
なう。必要に応じて２回以上の測定を実施することがで
きる。２回の測定の間の時間は変動し得る。それは設備
に応じて選択することができ、数秒間でも数分間でもよ
い。
恒温保持する。呈色試薬の還元をベースとする色の変化
は緩衝域変換後に一定の時間で、殊に１〜１５分で測光
法により追跡する。第１回の測定は緩衝液変換後１〜１
０分間で、最後の測定は緩衝液変換後２〜１５分間で行
なう。必要に応じて２回以上の測定を実施することがで
きる。２回の測定の間の時間は変動し得る。それは設備
に応じて選択することができ、数秒間でも数分間でもよ
い。
たいていの場合、得られた測定値を標準溶液と比較する
と有利である。好適な標準溶液は公知である。例えばジ
ヨンソン及びその他共著、“クリニカ・キミカ・アク
タ”、１２７巻、８７〜９５頁（１９８２年）に記載さ
れている標準を使うことができ、これは規定量の合成フ
ルクトサミンを添加したヒトアルブミンからの基質をベ
ースとする。合成フルクトサミンとしては１−デソキシ
−１−モルホリノ−フルクトース（DMF）を使用する。
こと標準を使用する際に、測定する試料中の血清フルク
トサミン濃度はDMF単位で記載する。
と有利である。好適な標準溶液は公知である。例えばジ
ヨンソン及びその他共著、“クリニカ・キミカ・アク
タ”、１２７巻、８７〜９５頁（１９８２年）に記載さ
れている標準を使うことができ、これは規定量の合成フ
ルクトサミンを添加したヒトアルブミンからの基質をベ
ースとする。合成フルクトサミンとしては１−デソキシ
−１−モルホリノ−フルクトース（DMF）を使用する。
こと標準を使用する際に、測定する試料中の血清フルク
トサミン濃度はDMF単位で記載する。
本発明方法が、ジヨンソン及びその他による方法で一般
的である試料／試薬容量比０．１を著しく低下させ、し
かも同じ測定間隔及び同一温度での恒温保持の際に規定
量の試料として使用したフルクトサミン類縁体による測
定シグナルがジヨンソン及びその他による方法と比較し
て著しく小さくはならないことは驚異的である。例えば
フルクトサミン類縁体としてDMFを使用する場合、測定
関度が低下することなく試料／試薬−容量比を０．０２
に低下させることができる。
的である試料／試薬容量比０．１を著しく低下させ、し
かも同じ測定間隔及び同一温度での恒温保持の際に規定
量の試料として使用したフルクトサミン類縁体による測
定シグナルがジヨンソン及びその他による方法と比較し
て著しく小さくはならないことは驚異的である。例えば
フルクトサミン類縁体としてDMFを使用する場合、測定
関度が低下することなく試料／試薬−容量比を０．０２
に低下させることができる。
非特異的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘
発する試料成分を酵素系及び／又は非酵素系の酸化剤１
種以上並びに場合により界面活性剤及び／又は塩１種以
上により除去して、血液又は血液から誘導された試料中
のフルクトサミンを測定する本発明方法は溶液中だけで
実施し得るものではない。乾式化学の試験用担体を用い
る測定法に転用することができる。この場合、１種以上
の酵素系及び／又は非酵素系の酸化剤並びに場合により
１種以上の界面活性剤及び／又は塩を場合により他の助
剤と共に公知方法で固体の担体上に施す。好適な固体の
担体並びにそのような担体上に物質もしくは物質混合物
を施す方法は当業者に公知である。例えば、担持材料と
しては、紙、フリース等のような可能な吸収性材料すべ
てが好適である。施すべき物質は含浸溶液１種以上に取
ることができる。この溶液で担体を含浸するか又は噴霧
する。引続いて乾燥させる。
発する試料成分を酵素系及び／又は非酵素系の酸化剤１
種以上並びに場合により界面活性剤及び／又は塩１種以
上により除去して、血液又は血液から誘導された試料中
のフルクトサミンを測定する本発明方法は溶液中だけで
実施し得るものではない。乾式化学の試験用担体を用い
る測定法に転用することができる。この場合、１種以上
の酵素系及び／又は非酵素系の酸化剤並びに場合により
１種以上の界面活性剤及び／又は塩を場合により他の助
剤と共に公知方法で固体の担体上に施す。好適な固体の
担体並びにそのような担体上に物質もしくは物質混合物
を施す方法は当業者に公知である。例えば、担持材料と
しては、紙、フリース等のような可能な吸収性材料すべ
てが好適である。施すべき物質は含浸溶液１種以上に取
ることができる。この溶液で担体を含浸するか又は噴霧
する。引続いて乾燥させる。
他の可能性は１種以上の酸化剤並びに場合により界面活
性剤及び／又は塩並びに場合により他の助剤を試薬フイ
ルム中にもたらすことである。この際に物質もしくは物
質混合物を例えば西ドイツ国特許第１５９８１５３号明
細書又は西ドイツ国特許公開第２９１０１３４号明細書
により試薬フイルムに加工する。
性剤及び／又は塩並びに場合により他の助剤を試薬フイ
ルム中にもたらすことである。この際に物質もしくは物
質混合物を例えば西ドイツ国特許第１５９８１５３号明
細書又は西ドイツ国特許公開第２９１０１３４号明細書
により試薬フイルムに加工する。
妨害作用をする非特異的に還元作用をする試料成分及び
／又は混濁を誘発する試料成分を除去するに当り、初め
に測定すべき試料を、１種以上の酸化剤並びに場合によ
り１種以上の界面活性剤及び／又は塩を含有する担体と
接触させる。十分な接触後、前処理した試料を、呈色反
応に必要な他の反応成分を含有する層に移す。その際に
生じる色の変化を公知のように測光法により、例えばレ
フレクトメータにより測定する。前反応と呈色反応との
間の時間的間隔については前記の説明が該当する。
／又は混濁を誘発する試料成分を除去するに当り、初め
に測定すべき試料を、１種以上の酸化剤並びに場合によ
り１種以上の界面活性剤及び／又は塩を含有する担体と
接触させる。十分な接触後、前処理した試料を、呈色反
応に必要な他の反応成分を含有する層に移す。その際に
生じる色の変化を公知のように測光法により、例えばレ
フレクトメータにより測定する。前反応と呈色反応との
間の時間的間隔については前記の説明が該当する。
本発明の他の目的は血液又は血液から誘導された試料中
の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白
質基質効果を回避するための製剤であり、これは非特異
的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘発する
試料成分を除去するための酵素系酸化剤及び／又は非酵
素系酸化剤及び界面活性剤を含有するpH値６〜９の試
薬、範囲１０．５〜１２．５のpH値を有する緩衝剤を含
有する緩衝域変換試薬及びフルクトサミンを検出するた
めの呈色試薬より成ることを特徴とする。この試薬混合
物は、本発明方法の実施に必要であるすべての成分を含
有する。
の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白
質基質効果を回避するための製剤であり、これは非特異
的に還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘発する
試料成分を除去するための酵素系酸化剤及び／又は非酵
素系酸化剤及び界面活性剤を含有するpH値６〜９の試
薬、範囲１０．５〜１２．５のpH値を有する緩衝剤を含
有する緩衝域変換試薬及びフルクトサミンを検出するた
めの呈色試薬より成ることを特徴とする。この試薬混合
物は、本発明方法の実施に必要であるすべての成分を含
有する。
血清又は血液から誘導された試料中の非特異的に還元作
用をする試料成分及び／又は混濁を誘発する試料成分を
除去する試薬は、ほぼ中性のpH値を有する緩衝剤中に酵
素系−及び／又は非酵素系酸化剤１種又は数種並びに場
合によりペルオキシダーゼ及び／又はカタラーゼ、及び
／又はリパーゼ並びに場合により界面活性剤及び／又は
強酸の塩１種又は数種並びに場合により常用の添加物よ
り成る。
用をする試料成分及び／又は混濁を誘発する試料成分を
除去する試薬は、ほぼ中性のpH値を有する緩衝剤中に酵
素系−及び／又は非酵素系酸化剤１種又は数種並びに場
合によりペルオキシダーゼ及び／又はカタラーゼ、及び
／又はリパーゼ並びに場合により界面活性剤及び／又は
強酸の塩１種又は数種並びに場合により常用の添加物よ
り成る。
特に、酵素系酸化剤にはアスコルベートオキシダーゼ、
ビリルビンオキシダーゼ及びウリカーゼ並びに非酵素系
酸化剤には特に次亜塩素酸塩及び次亜塩素酸塩供与化合
物が挙げられる。
ビリルビンオキシダーゼ及びウリカーゼ並びに非酵素系
酸化剤には特に次亜塩素酸塩及び次亜塩素酸塩供与化合
物が挙げられる。
血液及び／又は血液から誘導される試料中の非特異的に
還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘発する試料
成分を除去するための本発明による試薬中に場合により
含有されている界面活性剤はアニオン系又は非イオン系
であつてよい。とりわけアニオン系界面活性剤としては
胆汁酸及びその複合体のアルカリ塩又はアルカリ土類塩
が優れているが、非イオン系界面活性剤に関しても広範
な種類の界面活性剤から選択することができる。特に、
１分子当りアルコール部分中にＣ原子８〜２０個を有し
かつグリコール単位４〜１５個を有する直鎖状又は分枝
鎖状のアルキル−又はアルキルアリール−アルコール−
ポリグリコールエーテルが好適であることが明らかにな
つた。しかし添加する界面活性剤は付加的にカチオン系
界面活性剤、例えばオキシエチルアルキルアンモニウム
ホスフエート（例えばDehyquartRSP、Henkel社製）であ
つてもよい。
還元作用をする試料成分及び／又は混濁を誘発する試料
成分を除去するための本発明による試薬中に場合により
含有されている界面活性剤はアニオン系又は非イオン系
であつてよい。とりわけアニオン系界面活性剤としては
胆汁酸及びその複合体のアルカリ塩又はアルカリ土類塩
が優れているが、非イオン系界面活性剤に関しても広範
な種類の界面活性剤から選択することができる。特に、
１分子当りアルコール部分中にＣ原子８〜２０個を有し
かつグリコール単位４〜１５個を有する直鎖状又は分枝
鎖状のアルキル−又はアルキルアリール−アルコール−
ポリグリコールエーテルが好適であることが明らかにな
つた。しかし添加する界面活性剤は付加的にカチオン系
界面活性剤、例えばオキシエチルアルキルアンモニウム
ホスフエート（例えばDehyquartRSP、Henkel社製）であ
つてもよい。
クロラミンＴと同時にカチオン系界面活性剤、例えばデ
ハイクオートＲＳＰとを含有する場合に、特に酵素系及
び／又は非酵素系酸化剤の混合物が有用である。
ハイクオートＲＳＰとを含有する場合に、特に酵素系及
び／又は非酵素系酸化剤の混合物が有用である。
本発明による試薬に関しては強酸の塩として、塩酸又は
硫酸のアルカリ塩又はアルカリ土類塩が好適であること
が明らかになつた。特に塩化カリウム又は塩化ナトリウ
ムが優れている。
硫酸のアルカリ塩又はアルカリ土類塩が好適であること
が明らかになつた。特に塩化カリウム又は塩化ナトリウ
ムが優れている。
本発明による試薬のほぼ中性のpH値を達成するのに必要
な緩衝剤は範囲６〜９、殊に７〜８．５、特に７．５〜
８．０を有する。殊に、緩衝剤の濃度は１０〜１００ミ
リモル／、特に２０〜７０ミリモル／である。水性
リン酸カリウム緩衝液が特に有利であることが明らかに
なつた。
な緩衝剤は範囲６〜９、殊に７〜８．５、特に７．５〜
８．０を有する。殊に、緩衝剤の濃度は１０〜１００ミ
リモル／、特に２０〜７０ミリモル／である。水性
リン酸カリウム緩衝液が特に有利であることが明らかに
なつた。
実施例 次に本発明による方法及び試薬混合物について実施例に
つき詳説する。
つき詳説する。
例 １ フルクトサミン測定 Ａ） 試薬の組成 ａ） 試薬Ｉ（第１恒温保持工程） ｂ） 試薬II（第２恒温保持工程） Ｂ） 試験の実施 波長 ５４６nm 温度 ３７℃ 層厚 １０mm（半マイクロキユベツト） キユベツト中に次のものをピペツト装入し、点 ５分間恒温保持し、次いで試薬IIを混合し、 改めて恒温保持し、かつ試薬IIの添加後、一定時間△ｔ
（１〜５分間）の色素形成の動力学（△ＥPないしは△
ＥRL）を測定する。
（１〜５分間）の色素形成の動力学（△ＥPないしは△
ＥRL）を測定する。
△Ｅ＝（△ＥP−△ＥRL）／△ｔ 試料に関して記載したように、既知含量のDMFを含む標
準溶液（Ｓ）を測定する。測定値から△Ｅ標準を次のよ
うに計算する： 試料中の濃度は“１−デソキシモルホリノ−フルクトー
ス単位”（DMF単位）で表わす。計算のためにロツシユ
（Roche）社（スイス国、バーゼル在）のフルクトサミ
ン試験からの補正標準（製品No.０７−１１２１−７）
を使用した。
準溶液（Ｓ）を測定する。測定値から△Ｅ標準を次のよ
うに計算する： 試料中の濃度は“１−デソキシモルホリノ−フルクトー
ス単位”（DMF単位）で表わす。計算のためにロツシユ
（Roche）社（スイス国、バーゼル在）のフルクトサミ
ン試験からの補正標準（製品No.０７−１１２１−７）
を使用した。
第１図に、本発明方法による試験バツチの吸光度（曲線
１）とジヨンソン及びその他共著、“クリニカ・キミカ
・アクタ”、１２７巻、８７〜９５頁（１９８２年）に
よる方法の吸光度（曲線２）とが比較して図示されてお
り、この際に試料として前記のロツシユ社のフルクトサ
ミン試験からの補正標準を使用した。
１）とジヨンソン及びその他共著、“クリニカ・キミカ
・アクタ”、１２７巻、８７〜９５頁（１９８２年）に
よる方法の吸光度（曲線２）とが比較して図示されてお
り、この際に試料として前記のロツシユ社のフルクトサ
ミン試験からの補正標準を使用した。
例 ２ 直線性 本発明方法による吸光度変化の直線性を試験するため
に、ヒト血清を１−デオキシ−１−モルホリノフルクト
ース（DMF）により段階的に増加させかつ試験を例１に
相応して実施した。
に、ヒト血清を１−デオキシ−１−モルホリノフルクト
ース（DMF）により段階的に増加させかつ試験を例１に
相応して実施した。
第２図から明らかなように、少なくとも１０ミリモル／
までの吸光度変化／分は試料中のDMF濃度に直線的に
比例する。
までの吸光度変化／分は試料中のDMF濃度に直線的に
比例する。
例 ３ ビリルビンによる妨害 本発明によるフルクトサミンの測定法における測定シグ
ナルに対するビリルビンの作用を試験するために、ヒト
血清中のビリルビンを１２mg／dlの濃度まで段階的に高
めかつ試験を例１に記載したように実施した。
ナルに対するビリルビンの作用を試験するために、ヒト
血清中のビリルビンを１２mg／dlの濃度まで段階的に高
めかつ試験を例１に記載したように実施した。
第３図から明らかなように、ジヨンソン及びその他
〔“Clin.Chim.Acta”、１２７巻、８７〜９５頁（１９
８２年）〕の方法によるフルクトサミン測定（曲線１）
ではビリルビン濃度２mg／dlで測定シグナルは約４０％
上昇し、一方本発明方法（曲線２）ではビリルビン少な
くとも１２mg／dlまでは全く影響を受けない。
〔“Clin.Chim.Acta”、１２７巻、８７〜９５頁（１９
８２年）〕の方法によるフルクトサミン測定（曲線１）
ではビリルビン濃度２mg／dlで測定シグナルは約４０％
上昇し、一方本発明方法（曲線２）ではビリルビン少な
くとも１２mg／dlまでは全く影響を受けない。
例 ４ 尿酸による妨害 尿酸の測定シグナルに対する作用を測定するために、異
なる量の尿酸を含むヒト血清を使い、かつ一方ではジヨ
ンソン及びその他（“Clin.Chim.Acta”、前記文献）の
方法により、他方では本発明方法により例１と同様にし
てE/t−線図をプロツトした。
なる量の尿酸を含むヒト血清を使い、かつ一方ではジヨ
ンソン及びその他（“Clin.Chim.Acta”、前記文献）の
方法により、他方では本発明方法により例１と同様にし
てE/t−線図をプロツトした。
ジヨンソン及びその他による試験では既に尿酸濃度１
３．７mg／dlで出発値＝（尿酸6.9mg／dl）よりも１３
％高いシグナルが認められ、一方本発明方法では濃度約
３０mg／dlまでの尿酸で実質的に作用を受けなかつた。
３．７mg／dlで出発値＝（尿酸6.9mg／dl）よりも１３
％高いシグナルが認められ、一方本発明方法では濃度約
３０mg／dlまでの尿酸で実質的に作用を受けなかつた。
例 ５ アスコルビン酸による妨害 測定シグナルに対するアスコルビン酸の作用を測定する
に当り、ヒト血清を異なる量のアスコルビン酸で増量
し、かつ一方ではジヨンソン及びその他（“Clin,Chim.
Acta”前記文献）の方法により、他方で本発明方法によ
り例１と同様にしてE/t−線図をプロツトした。
に当り、ヒト血清を異なる量のアスコルビン酸で増量
し、かつ一方ではジヨンソン及びその他（“Clin,Chim.
Acta”前記文献）の方法により、他方で本発明方法によ
り例１と同様にしてE/t−線図をプロツトした。
ジヨンソン及びその他による試験ではアスコルビン酸濃
度の上昇と共に△mE/分のパーセントは上昇し、本発明
方法による試験では約５０mg／の濃度までは実質的に
作用されない。
度の上昇と共に△mE/分のパーセントは上昇し、本発明
方法による試験では約５０mg／の濃度までは実質的に
作用されない。
例 ６ 脂肪血症血清の澄明化 例１に相応する試験バツチにおいて、試料として強度に
過脂肪血症の血清（トリグリセリド２０００mg／dl）を
使用した。
過脂肪血症の血清（トリグリセリド２０００mg／dl）を
使用した。
第４図から明らかなように、第１恒温保持工程で既に５
分後には完全で継続的な混濁の除去が達成される。
分後には完全で継続的な混濁の除去が達成される。
例 ７ 医薬による妨害 測定シグナルに対する医薬の作用を測定するために異な
る量の種々の医薬又は医薬分解生成物を含むヒト血清を
使用しかつジヨンソン及びその他（“クリニカ・キミカ
・アクタ”、前記文献）による方法及び本発明方法によ
り例１と同様にしてE/t−線図を作成した。
る量の種々の医薬又は医薬分解生成物を含むヒト血清を
使用しかつジヨンソン及びその他（“クリニカ・キミカ
・アクタ”、前記文献）による方法及び本発明方法によ
り例１と同様にしてE/t−線図を作成した。
例 ８ 試料中の全蛋白質量の測定シグナルに対する作用 １つのモデル実験において、生理食塩液中の異なる濃度
の牛血清アルブミン（RSA）を含有する溶液を、一方で
は盲検値測定のために１−デオキシモルホリノフルクト
ース（DMF）を添加せずに、他方は一定量のDMF（２．５
ミリモル ／）を添加して製造した。この試験は、ジヨン
ソン及びその他（“クリニカ・キミカ・アクタ”、前記
文献）の方法によりかつまた本発明方法により例１に相
応して実施した。
の牛血清アルブミン（RSA）を含有する溶液を、一方で
は盲検値測定のために１−デオキシモルホリノフルクト
ース（DMF）を添加せずに、他方は一定量のDMF（２．５
ミリモル ／）を添加して製造した。この試験は、ジヨン
ソン及びその他（“クリニカ・キミカ・アクタ”、前記
文献）の方法によりかつまた本発明方法により例１に相
応して実施した。
表から明らかなように、試料中のDMFにより発生した測
定シグナルは、ジヨンソン及びその他による試験では蛋
白質濃度の上昇と共に非常に強く低下し、本発明方法に
よる試験では少なくともRSA１００ｇ／までは実質的
に蛋白質量の作用を受けない。
定シグナルは、ジヨンソン及びその他による試験では蛋
白質濃度の上昇と共に非常に強く低下し、本発明方法に
よる試験では少なくともRSA１００ｇ／までは実質的
に蛋白質量の作用を受けない。
例 ９ フルクトサミン測定 Ａ） 試薬の組成 ａ） 試薬Ｉ（第１恒温保持工程） ｂ） 試薬II（第２恒温保持工程） Ｂ） 試験の実施 試験は日立７０４自動分析機を使つて実施した。
波長 ５４６nm 温度 ３７℃ 層厚 １０mm（半マイクロキユベツト） キユベツト中に次のものをピペツト装入し： ５分間恒温保持し、引続いて次のものを添加混合し、 再度恒温保持し、かつ試薬IIの添加後、一定時間△ｔ
（８〜１０分間）の色素形成の動力学（△ＥPもしくは
△ＥRL）を測定した。
（８〜１０分間）の色素形成の動力学（△ＥPもしくは
△ＥRL）を測定した。
フルクトサミンの濃度は例１と同様にDMF単位として測
定し、第５ａ図の縦軸にプロツトした（ミリモル／
）。これらの結果は、HPLC-参考法〔“J.Clin.Chem.C
lin.Biochem.”、１９巻、８１〜８７頁（１９８１
年）〕によりフロシンを測定することにより得られた測
定値に対してプロツトした。HPLC測定値としては、その
都度相対的なピーク面積単位を使用した。
定し、第５ａ図の縦軸にプロツトした（ミリモル／
）。これらの結果は、HPLC-参考法〔“J.Clin.Chem.C
lin.Biochem.”、１９巻、８１〜８７頁（１９８１
年）〕によりフロシンを測定することにより得られた測
定値に対してプロツトした。HPLC測定値としては、その
都度相対的なピーク面積単位を使用した。
第５ｂ図には、付加的にヘンケル社製のデハイクオート
ＲＳＰ（DehyquartRSP）１．２％が試薬Ｉ中に含まれて
いる場合の同様のフルクトサミン測定の結果が図示され
ている。
ＲＳＰ（DehyquartRSP）１．２％が試薬Ｉ中に含まれて
いる場合の同様のフルクトサミン測定の結果が図示され
ている。
第５ｃ図は、付加的にクロラミンＴ２５０μモルが試薬
Ｉ中に含まれている場合の同様のフルクトサミン測定の
結果を示す。
Ｉ中に含まれている場合の同様のフルクトサミン測定の
結果を示す。
第５ｄ図は、付加的に試薬Ｉ中にデハイクオートＲＳＰ
１．２％もクロラミンＴ ２５０μモルも含まれている
場合の同様のフルクトサミン測定の結果を示す。
１．２％もクロラミンＴ ２５０μモルも含まれている
場合の同様のフルクトサミン測定の結果を示す。
これらの第５ａ図〜第５ｄ図より、特にクロラミンＴと
デハイクオートＲＳＰとを組合せると明らかに軸との交
点が低下している。
デハイクオートＲＳＰとを組合せると明らかに軸との交
点が低下している。
第１図は、試験バツチの吸光度を本発明方法（曲線１）
とジヨンソン及びその他による方法（曲線２）により測
定した結果を示す線図、第２図は本発明方法による、DM
F濃度に対する吸光度変化の直線性を示す線図、第３図
はフルクトサミン含量測定法におけるビリルビンの測定
シグナルに対する作用を示す線図、第４図は本発明によ
る過脂肪血症血清の澄明化を示す線図、第５ａ図DMF濃
度をフロシンに対してプロツトして示す線図、第５ｂ図
は付加的にデハイクオートＲＳＰを添加した場合のDMF
濃度とフロシンとの相関関係を示す線図、第５ｃ図は付
加的にクロラミンＴを添加した場合のDMF濃度とフロシ
ンとの相関関係を示す線図、第５ｄ図は付加的にデハイ
クオートＲＳＰとクロラミンＴとを添加した場合のDMF
濃度とフロシンとの相関関係を示す線図である。
とジヨンソン及びその他による方法（曲線２）により測
定した結果を示す線図、第２図は本発明方法による、DM
F濃度に対する吸光度変化の直線性を示す線図、第３図
はフルクトサミン含量測定法におけるビリルビンの測定
シグナルに対する作用を示す線図、第４図は本発明によ
る過脂肪血症血清の澄明化を示す線図、第５ａ図DMF濃
度をフロシンに対してプロツトして示す線図、第５ｂ図
は付加的にデハイクオートＲＳＰを添加した場合のDMF
濃度とフロシンとの相関関係を示す線図、第５ｃ図は付
加的にクロラミンＴを添加した場合のDMF濃度とフロシ
ンとの相関関係を示す線図、第５ｄ図は付加的にデハイ
クオートＲＳＰとクロラミンＴとを添加した場合のDMF
濃度とフロシンとの相関関係を示す線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リーゼロツテ・シエロング ドイツ連邦共和国ミユンヘン 19・シユル ーデルシユトラーセ 14 (72)発明者 ベルント・フオークト ドイツ連邦共和国トウツイング・モーツア ルトシユトラーセ １ (56)参考文献 特開 昭56−151498（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−76100（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−34900（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−18000（ＪＰ，Ａ) Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，127 （１），1983，Ｐ．87−95 西九州大学・佐賀短期大学紀要，Ｎｏ. 17，1986，Ｐ．１−５
Claims (17)
- 【請求項１】血液又は血液から誘導された試料中の血清
フルクトサミン含量を、好適な呈色試薬と反応させかつ
その際に生じた色の変化を測定することにより特異的に
測定する際に、蛋白質基質効果を回避するための方法に
おいて、呈色反応の前に、試料を酵素系酸化剤及び／又
は非酵素系酸化剤１種又は数種及び界面活性剤１種又は
数種によりｐＨ値６〜９で処理し、引き続いてｐＨ値を
ｐＨ１０〜１２に調節しかつ呈色試薬を添加することを
特徴とする、血液又は血液から誘導された試料中の血清
フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質
効果を回避するための方法。 - 【請求項２】酵素系酸化剤としてアスコルベートオキシ
ダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ及び／又はウリカーゼ
を使用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】非酵素系酸化剤として次亜塩素酸塩又は次
亜塩素酸塩供与化合物を使用する、特許請求の範囲第１
項記載の方法。 - 【請求項４】非酵素系酸化剤としてＮ−クロル−ｐ−ト
ルエンスルファミド及び界面活性剤としてオキシエチル
アルキルアンモニウムホスフェートを添加する、特許請
求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項５】付加的にリパーゼを添加する、特許請求の
範囲第１項から第４項までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】付加的に強酸の塩を添加する、特許請求の
範囲第１項から第５項までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】界面活性剤としてカチオン系、アニオン系
及び／又は非イオン系界面活性剤及び強酸の塩としては
塩酸又は硫酸のアルカリ塩又はアルカリ土類塩を使用す
る、特許請求の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項８】付加的にペルオキシダーゼ及び／又はカタ
ラーゼを添加する、特許請求の範囲第１項から第７項ま
でのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】ｐＨ値１０〜１２に調節するため範囲１
０．５〜１２．５のｐＨ値を有する緩衝剤を加える特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１０】範囲１０．５〜１２．５にｐＨ値を有す
る緩衝剤を加えるのと同時に呈色試薬を添加する特許請
求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１１】血液又は血液から誘導された試料中の血
清フルクトサミン含量を、特異的に測定する際に蛋白質
基質効果を回避するための製剤において、該製剤が酵素
系酸化剤及び／又は非酵素系酸化剤及び界面活性剤を含
有するｐＨ値６〜９の試薬、範囲１０．５〜１２．５の
ｐＨ値を有する緩衝剤を含有する緩衝域変換試薬及びフ
ルクトサミンを検出するためのレドックス呈色試薬より
成ることを特徴とする、血液又は血液から誘導された試
料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に
蛋白質基質効果を回避するための製剤。 - 【請求項１２】酵素系酸化剤としてアスコルベートオキ
シダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ及び／又はウリカー
ゼを含有する、特許請求の範囲第１１項記載の製剤。 - 【請求項１３】非酵素系酸化剤として次亜塩素酸塩又は
次亜塩素酸塩供与化合物を含有する特許請求の範囲第１
２項記載の製剤。 - 【請求項１４】非酵素系酸化剤としてＮ−クロル−ｐ−
トルエンスルファミド及びカチオン系界面活性剤として
オキシエチルアルキルアンモニウムホスフェートを含有
する特許請求の範囲第１１項から第１３項までのいずれ
か１項記載の製剤。 - 【請求項１５】付加的にリパーゼを含有する特許請求の
範囲第１１項から第１４項までのいずれか１項記載の製
剤。 - 【請求項１６】強酸の塩を含有する特許請求の範囲第１
１項から第１５項までのいずれか１項記載の製剤。 - 【請求項１７】付加的にペルオキシダーゼ及び／又はカ
タラーゼを含有する特許請求の範囲第１１項から第１６
項までのいずれか１項記載の製剤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3620817.5 | 1986-06-21 | ||
| DE19863620817 DE3620817A1 (de) | 1986-06-21 | 1986-06-21 | Verfahren zur spezifischen bestimmung des serumfructosamingehalts sowie hierfuer geeignetes reagenzgemisch |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6315168A JPS6315168A (ja) | 1988-01-22 |
| JPH0640836B2 true JPH0640836B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=6303412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62149317A Expired - Lifetime JPH0640836B2 (ja) | 1986-06-21 | 1987-06-17 | 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0250991B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0640836B2 (ja) |
| KR (1) | KR880000797A (ja) |
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| AU (1) | AU583737B2 (ja) |
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| DE (2) | DE3620817A1 (ja) |
| DK (1) | DK314987A (ja) |
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| YU (1) | YU46053B (ja) |
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| DE3732688A1 (de) * | 1987-09-29 | 1989-04-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung des serumfructosamingehalts sowie hierfuer geeignetes reagenzgemisch |
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| DE3824562A1 (de) * | 1988-07-19 | 1990-02-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von fructosamin |
| JP2694004B2 (ja) * | 1989-03-24 | 1997-12-24 | 三光純薬株式会社 | 血清又は血漿中のフルクトサミンの測定法 |
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| US5312760A (en) * | 1992-06-08 | 1994-05-17 | Modrovich, Ivan Endre | Fructosamine reagent and calibrator system |
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