JPH0229318B2 - Seitaitaiekiseibunnosokuteiho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、公知の方法により生体体液成分を測
定するに際し、あらかじめ固定化ビリルビンオキ
シダーゼと生体体液試料とを反応させたのちの体
液試料を検液することを特徴とする生体体液成分
の測定法に関する。さらに詳しくは、固定化ビリ
ルビンオキシダーゼと生体体液試料との反応によ
り生体体液試料に含まれるビリルビンを減少又は
消失せしめ、ビリルビンの生体体液成分測定反応
に対する干渉を回避又は軽減することを特徴とす
る生体体液成分の測定法である。本発明におい
て、生体体液とは血清、尿などであり、又、測定
される成分はグルコース、コレステロール、尿
酸、中性脂肪、遊離脂肪酸、リン脂質、クレアチ
ニン、クレアチンなどである。

近年、臨床化学分析における酵素的分析法の進
歩はめざましく、前述の各種生体体液成分の測定
のためにグルコースオキシダーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アシルコエンザイ
ムＡオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、グリセ
ロール―３―リン酸オキシダーゼ、ザルコシンオ
キシダーゼなどの酸化酵素が広範に用いられてい
る。これら酸化酵素を用いる方法では生成した過
酸化水素をパーオキシダーゼ水素供与体系を用い
る方法で比色定量するのが常であるが、この方法
では、検液中に存在する種々の還元物質、投与薬
剤、生体色素などにより干渉を受ける。これら干
渉物質のなかで、ビリルビンによる干渉機序につ
いては、 (1) ビリルビンの特異吸収（460nm付近）による
直接的影響 (2) ビリルビンがパーオキシダーゼの水素供与体
となる (3) 生成された呈色色素に直接的に作用して分解
する などが言われている（臨床化学 第８巻、63−72
ページ、1979年）。

ビリルビンの血清中での濃度は、正常人では１
mg／dl以下であるが、病的には20mg／dlに達する
こともあり、臨床検査上その影響は重大な問題で
ある。

これらの問題に関する公知技術としては、例え
ばフエロシアン化物、アスコルビン酸、EDTA
―鉄錯体又はビリルビン特異性菌性酵素組成物を
反応系に添加する方法などが知られている（特公
昭55−25840号公報、特開昭55−138656号公報、
特開昭55−29718号公報、特開昭57−71398号公
報、特開昭54−151193号公報及びクリニカルケミ
ストリー第26巻、227−231ページ、1981年）。し
かし、これら従来の方法はいずれも欠点があり、
十分満足できる方法とはいえない。

本発明者らは、上述のような酸化酵素を用いた
公知の生体体液成分の測定において、同時又はあ
らかじめビリルビンオキシダーゼを試料に作用さ
せるときは、試料中に含まれるビリルビンが酸化
されてビリルビンを経てほぼ無色の生成物に変化
し、かつ、過酸化水素も生成しないためビリルビ
ンによる干渉が回避されることを知つた。しか
し、ビリルビンオキシダーゼを水溶性の状態で使
用することは、使い捨てとなるため経済的に不利
であるし、又、ビリルビンオキシダーゼは測定試
薬に含まれるフエノールに若干反応性があるため
ブランク値を上昇させるという欠点がある。かか
る欠点を改良するため本発明者らは鋭意研究した
ところ、酵素ビリルビンオキシダーゼを固定化し
て使用することにより、ビリルビンオキシダーゼ
の反復使用ならびに生体体液成分測定における反
応系への混入防止ができることを見出し本発明を
完成した。

まず、本発明において用いる酵素ビリルビンオ
キシダーゼについて説明すると、本酵素の生産菌
としてはミロセシウム（Myrothecium）属又は
コプリナス（Coprinus）属に属する菌株があげ
られる。具体的にはミロセシウム属菌としては、
本発明者らが見いだしたミロセシウム・ベルカリ
ア（Myr.verrucaria）MT―１，FERM―P5918
〔アグリカルチユラル アンド バイオロジカル
ケミストリー（Agricultural and Biological
Chemistry）第45巻、2383―2384ページ（1981
年）参照〕のほか、ミロセシウム・ベルカリア
IFO6113，ミロセシウム・ベルカリアIFO6133，
ミロセシウム・ベルカリアIFO6351，ミロセシウ
ム・ベルカリアIFO9056，ミロセシウム・チンク
タム（Myr.cinctum）IFO9950，ミロセシウム・
ロリダム（Myr.roridum）IFO9531などの保存菌
株があげられる。又、コプリナス属菌としては、
コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）
IFO8371、コプリナス・ラゴピデス（Cop.
lagopides）IFO30120などの保存菌株があげられ
る。

上記菌株を用いてビリルビンオキシダーゼを取
得するには、常法により菌株を液体倍養又は固体
培養し、その培養物から抽出、塩析、透析、イオ
ン交換、ゲル濾過などを行うことにより本酵素の
精製標品が得られる。

以上のようにして得られたビリルビンオキシダ
ーゼは、ビリルビンに作用してビリベルジンを経
てほぼ無色の生成物に変化せしめる結果、ビリル
ビンの特異吸収（460nm付近）が減少するととも
に、その還元性がなくなる。又、本酵素は過酸化
水素を生成しない特徴を有する。

本発明において、ビリルビンオキシダーゼを固
定化する方法は、特に限定されず、公知の方法を
利用できる。例えば、セルロース、デキストラ
ン、アガロースなどの多糖類誘導体、又はポリア
クリルアミドゲル、多孔性ガラス、ポリスチレン
などの担体に共有結合法、イオン結合法、物理的
吸着法により酵素を結合させる方法、酵素どうし
をグルタルアルデヒド、イソシアナート誘導体、
ビスジアゾベンジジン、Ｎ，N′―ポリメチレン
ビスヨードアセトアミド、又はＮ，N′―エチレ
ンビスマレイミドのような多官能性試薬を用いて
架橋させる方法、ポリアクリルアミドゲル、ポリ
ビニルアルコールゲル、ケイ素樹脂、デンプンな
どの高分子ゲルの格子の中に酵素を包括する方
法、ナイロン、ポリウレア、ポリスチレン、コロ
ジオンなどの半透膜性のポリマーの皮膜によつて
酵素をマイクロカプセル化する方法があげられ
る。これらの方法のうち、本発明法に特に適する
のはセルロース、多孔性ガラス、ポリスチレンを
担体としてこれに酵素を結合させる方法である。

上記のようにして得た固定化酵素を用いて生体
体液成分を測定するには、例えば、固定化酵素を
カラムに詰めそこへ血清などの試料を添加し、反
応させたのち緩衝液で溶出する。ポリスチレン試
料管に酵素を固定化した場合は試験管に試料を加
えて反応させたのちの液をそのまま使用できる。
このようにして得られた試料を検液として、前述
の公知のグルコース、コレステロールなどの測定
操作を行い、あらかじめ作成しておいた検量線と
対比することにより試料中の成分の濃度を求め
る。

以上のようにしてビリルビンオキシダーゼを固
定化して用いた場合は、少なくとも３ケ月間は安
定に保存でき、かつ、繰り返しの使用が可能であ
つた。又、本発明法により、前述の生体体液成分
の測定におけるビリルビンの干渉を完全に防ぐこ
とができた。

以下、試験例、実施例をもつて本発明を詳しく
説明するが、説明中にあるビリルビンオキシダー
ゼの単位は次の定義による。すなわち、エチレン
ジアミン四酢酸（1mM）を含む0.2Mトリス塩酸
緩衝液（PH8.4）250mlにビリルビン（和光純薬
製）５mgを溶解し、この２mlと酵素を37℃で反応
させ440nmの吸光度の減少を測定し、１分間に１
マイクロモルのビリルビンを酸化する酵素量を１
単位とした。

試験例 １ 固定化ビリルビンオキシダーゼの調製(1) シアン化臭素活性化セフアロース4B（CNBr―
activated Sepharose4B，フアルマシア製）１ｇ
を1mM塩酸200mlに懸濁したのち、0.5M食塩を
含む0.1M炭酸緩衝液（PH8.3、以下緩衝液Ａとい
う）で十分洗浄し、これに緩衝液Ａに溶解したビ
リルビンオキシダーゼ（40u／ml）１mlを加え、
ゆるやかに撹拌しながら４℃、一晩放置した。そ
の後緩衝液Ａ、0.2Mエタノールアミン（PH8.3）、
緩衝液Ａ、0.5M食塩を含む0.2M酢酸緩衝液（PH
5.0）0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0、以下緩衝
液Ｂという）の順で洗浄して固定化ビリルビンオ
キシダーゼを作成し、これをカラム（内径３mm×
長さ10mm）に充填し固定化酵素カラムを得た。以
上の操作による酵素活性の収率は15％であつた。

試験例 ２ 固定化ビリルビンオキシダーゼの調製(2) 酵素固定化担体としてエポキシ活性化セフアロ
ース4B（Epoxy―activated Sepharose4B、フア
ルマシア製）を用い、試験例２と同様に操作して
固定化酵素カラムを得た。以上の操作による酵素
活性の収率は９％であつた。

試験例 ３ 固定化ビリルビンオキシダーゼの調製(3) アミノ基を官能基としてもつ多孔性ガラスビー
ズ（和光純薬製）１ｇに１％グルタルアルデヒド
（PH7.4）10mlを加え、室温で30分反応させたのち
緩衝液Ｂで十分洗浄し、これに緩衝液Ｂに溶解し
たビリルビンオキシダーゼ（40u／ml）１mlを加
えてゆるやかに撹拌しながら４℃、一晩放置し
た。その後試験例１に記載したと同様に、順に緩
衝液で洗浄を行い、最後に緩衝液Ｂで洗浄し固定
化ビリルビンオキシダーゼを作成し、これを前記
と同様のカラムに充填し、固定化酵素カラムを得
た。以上の操作による酵素活性の収率は12％であ
つた。

試験例 ４ 固定化ビリルビンオキシダーゼの調製(4) ポリスチレン試験管（13mm×100mm）にγ―ア
ミノプロピルトリエトキシシランを数滴滴下し試
験管内壁をコーテイングし、水洗後さらに１％グ
ルタルアルデヒド（PH7.4）を加えて内壁を処理
した。試験管を水洗後、緩衝液Ｂに溶解したビリ
ルビンオキシダーゼ（4u／ml）１mlを加えて、
室温において４時間、回転、振盪した。その後、
試験例１に記載したと同様に、順に緩衝液で洗浄
を行い、最後に緩衝液Ｂで洗浄し、固定化酵素試
験管を得た。以上の操作による酵素活性の収率は
９％であつた。

実施例 １ グルコースの測定 試験例１で調製した固定化酵素カラムにドデシ
ル硫酸ナトリウム（0.1％）を含有する0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH8.0）を流し、カラムを平衡化
した。次いで試料として、５，10，15，20mg／dl
のビリルビンを含むグルコース水溶液（200mg／
dl）各々50μを加えたのち、上記緩衝液を流し
溶出液500μを得た。溶出液を検液として、こ
の200μと公知のグルコース測定試薬であるグ
ルコースオキシダーゼ（天野製薬製、17u／ml）、
パーオキシダーゼ（ベーリンガー製、0.3u／ml）、
４―アミノアンチピリン（0.4mM）、フエノール
（15mM）を含む0.1M―燐酸緩衝液（PH7.5）３ml
を混合し37℃、20分反応させたのち、反応液の
505nmにおける吸光度を測定した。一方、比較と
して、固定化酵素処理を行わないで各試料を10倍
に希釈した検液を用いて、上記と同様のグルコー
スの測定操作を行つた。

結果を第１図に示す。同図において（―〇―）
は本実施例の結果を、（―●―）は比較例をそれ
ぞれれ表す。本発明の方法により、試料に共存す
るビリルビンの影響が無視できることがわかつ
た。

実施例 ２ 血清中のグルコースの測定 試験例１で調製した固定化酵素カラムを用い、
ここへドデシル硫酸ナトリウム（0.1％）を含有
する0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）を流し、カ
ラムを平衡化した。次いで血清試料50μを加え
たのち上記緩衝液を流し溶出液500μを得た。
溶出液を検液として、この200μと公知のグル
コース測定試薬であるグルコースオキシダーゼ
（天野製薬製、17u／ml）、パーオキシダーゼ（ベ
ーリンガー製、0.3u／ml）、４―アミノアンチピ
リン（0.4mM）、フエノール（15mM）を含む
0.1M―燐酸緩衝液（PH7.5）３mlを混合し、37
℃、20分反応させたのち、反応液の505nmにおけ
る吸光度を測定した。この吸光度を、あらかじめ
標準グルコース水溶液を検液として、上記と同様
に操作して作成した検量線と対比して本試料中の
グルコース濃度を求めたところ、96.5mg／dlであ
つた。比較として、固定化酵素処理をしていない
血清試料を検液として同様に操作したところ、
90.6mg／dlであつた。なお用いた血清試料中の総
ビリルビン濃度は12.5mg／dlであつたが、本固定
化酵素処理をしたことにより2.2mg／dl（18％）
に減少した。また用いた固定化酵素カラムは少な
くとも繰り返し50回の使用が可能であつた。

実施例 ３ 血清中のグルコースの測定 試験例２で調製した固定化酵素カラム及び実施
例２で使用した血清試料を用い、実施例２と同様
に操作したところ、本血清試料中のグルコース濃
度は96.4mg／dlであつた。なお用いた血清試料中
の総ビリルビン濃度は本固定化酵素処理をしたこ
とにより、2.5mg／dl（20％）に減少した。また
用いた固定化酵素カラムは少なくとも繰り返し50
回の使用が可能であつた。

実施例 ４ 血清中のグルコースの測定 試験例３で調製した固定化酵素カラム及び実施
例２で使用した血清試料を用い、実施例２と同様
に操作したところ、本血清試料中のグルコース濃
度は96.2mg／dlであつた。なお用いた血清試料中
の総ビリルビン濃度は本固定化酵素処理をしたこ
とにより2.5mg／dl（20％）に減少した。また用
いた固定化酵素カラムは少なくとも繰り返し50回
の使用が可能であつた。

実施例 ５ 血清中のグルコースの測定 試験例４で調製した、酵素を固定化したポリス
チレン試験管に実施例２で用いたと同じ血清試料
50μと0.1M―燐酸緩衝液（PH7.5，コール酸ソ
ーダ0.3％含有）0.5mlを入れ、室温で５分間振盪
した。ここで得られた試料を検液として実施例２
と同様に操作したところ、本血清試料中のグルコ
ース濃度は96.2mg／dlであつた。なお、用いた血
清試料中の総ビリルビン濃度は本固定化酵素処理
をしたことにより2.9mg／dl（23％）に減少した。
また用いた固定化酵素試験管は少なくとも繰り返
し50回の使用が可能であつた。

実施例 ６ 血清中の総コレステロールの測定 実施例２に記載したと同様に操作により、血清
試料を固定化酵素処理して得た検液200μと公
知の総コレステロール測定獅薬であるコレステロ
ールエステラーゼ（天野製薬製、1u／ml）、コレ
ステロールオキシダーゼ（同、2u／ml）、パーオ
キシダーゼ（ベーリンガー製、6u／ml）、４―ア
ミノアンチピリン（0.4mM）、フエノール
（15mM）、トリトンＸ―100（0.1％）を含む0.1M
―燐酸緩衝液（PH7.5）３mlを混合し、37℃、20
分反応させたのち、反応液の505nmにおける吸光
度を測定した。この吸光度と、あらかじめ標準コ
レステロール水溶液を検液として、上記と同様に
操作して作成した検量線とを対比して本試料中の
コレステロール濃度を求めたところ、163mg／dl
であつた。比較として、固定化酵素処理をしてい
ない血清試料を検液として同様に操作したところ
145mg／dlであつた。なお用いた血清試料中の総
ビリルビン濃度は15.2mg／dlであつたが、本固定
化酵素処理をしたことにより2.1mg／dl（14％）
に減少した。

実施例 ７ 血清中の中性脂肪の測定 実施例２に記載したと同様の操作により、血清
試料を固定化酵素処理して得た検液200μと公
知の中性脂肪の測定試薬であるポリプロテインリ
パーゼ（天野製薬製、200u／ml）、グリセロール
キナーゼ（同、0.3u／ml）、グリセロール―３―
リン酸オキシダーゼ（同、4u／ml）、パーオキシ
ダーゼ（ベーリンガー製、2u／ml）、４―アミノ
アンチピリン（0.4mM）、フエノール（15mM）、
ATP（0.8mM）、トリトンＸ―100（0.1％）を含む
0.1M―トリス塩酸緩衝液（PH7.5）３mlを混合し
37℃、20分反応させたのち、反応液の505nmにお
ける吸光度を測定した。この吸光度と、あらかじ
め標準トリオレイン溶液を検液として、上記と同
様に操作して作成した検量線とを対比して本試料
中の中性脂肪濃度を求めたところ、トリオレイン
として78.0mg／dlであつた。比較として、固定化
酵素処理をしていない血清試料を検液として同様
に操作したところ、68.6mg／dlであつた。なお用
いた血清試料中の総ビリルビン濃度は14.2mg／dl
であつたが、本固定化酵素処理をしたことにより
2.4mg／dl（17％）に減少した。

【図面の簡単な説明】

第１図はグルコースの測定におけるビリルビン
の影響を表す図であり、図中（―〇―）は本発明
法の結果を、（―●―）は比較例をそれぞれ表す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 生体体液中の成分を測定する方法において生
   体体液試料を固定化ビリルビンオキシダーゼに作
   用せしめたのちの試料を検液とすることを特徴と
   する生体体液成分の測定法。