SU744002A1 - Способ получени иммобилизованных ферментов - Google Patents
Способ получени иммобилизованных ферментов Download PDFInfo
- Publication number
- SU744002A1 SU744002A1 SU772527891A SU2527891A SU744002A1 SU 744002 A1 SU744002 A1 SU 744002A1 SU 772527891 A SU772527891 A SU 772527891A SU 2527891 A SU2527891 A SU 2527891A SU 744002 A1 SU744002 A1 SU 744002A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- immobilized
- preparation
- glutaraldehyde
- stability
- activity
- Prior art date
Links
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
1
Изобретение относитс к области биотехнологии и, в частности, к способу получени иммобилизованных ферментов , которые сохран ют общие 5 свойства ферментов и могут быть использованы в качестве гетерогенных катализаторов в реакци х превращени органических соединений и биохимических препаратов как в периодическом, Ю так и непрерывном процессе катализа, в химической, микробиологической, медицинской и пищевой промышленности.
Известные в насто щее врем способы получени иммобилизованных фер- .с ментов методами ковалентногр св зывани ферментного белка На водонерастворим|1е носители основывеиотс аа применении бифункциональных реагентов , которые способны реагировать с -Q водонерастворимым носителем и с ферментным белком 1. Общим недостатком большинства известных способов можно считать относительно низкую термическую стабильность получаемых 25 препаратов.
Известен также способ получени иммобилизованных ферментов посредством ковалентного св зывани ферментов с водонерастворимыми носител ми, -Q
Ьктивированньми бифункциональным реагентом - 1.,4-бензохиноном 2. Согласно известному способу иммобилизованные ферменты (например, трипоин,
пеницшшинамидаза) или другие протеины получают путем ковалентного св зывани их с полисахаридньши носител ми при помощи 1,4-бензохинона или
1,2-нафтох;инона. Гели (например, An-Sepharose 4В) подвергают инкубации при перемешивании в фосфатном буфере (рН 7,4) в,присутствии 1,4-бенisoxHHOHa при комнатной температуре в течение 20 ч. После удале 1ИЙ непро реагировавшего бензохинона промыванйем гел добавл ют фермент и провод т реакцию при С в течение 24 ч. Иммобилизованный фермент промыйайт многократно буфером, а затем 1 М раствором хлористого натри . Отмечаетс , что активность препарата сохран етс при температуре 4 С в течение 3 мес цев.
Этот cnocq6 прост. Однако в этом способе не устран етс указанньий : недостаток , присущий другим известным способам иммобилизации, а именно низка термостабильность получаемых прв . наратов. . Целью изобретени вл етс увели ченйетёрйостабилЁйоётй препаратов щмобилиэованных ферментов. Указанна цель достигаетс за сче того, что иммобилизованные ферменты дапоЛнительно обрабатывают глутаровым альдегидом в количестве 0,5 - 4-40 с 3 Mft/экв, на 1 г носител при в течение 1-24 ч. Согласно изобретению описываетс способ получени иммобилизованных ферментов с повышенной стабильностью Орепаратов путём ковалентного св зыШа й ферментов с водонерастворимыми носител ми, предварительно активированными 1,4-бвнзоз4йноном, с послёдую вдрй обрабрткой Препаратов глутаровым альдегидом в количестве 0,5-3 на 1 г носител при втечение 1-24 ч. - - -- Реакдан св зывани ферйента с 1,4 -бензо синоном Осуществл етс через аминогруппы белка и носител . С цель увёлйчани количества аминогрупп на йосйтёлё его можно предварительно об рабатывать З-амийопропилтрйэтЬКСйсиланом . После нуйлеофйльного присоеди нени Г, 4-бенэохинона носителем и ферментным белком на поверхности но .йител образуетс оболочка изфермен ного белка, котора вследствие дйссо tftiaiiHH легко удал 1етс и тем самим уменьшает стабильность иммобилизован ного фермейта После реакции свободных остатков аминогрупп с такой оболочкой обра3 уют с прочные дополн ит ель ные св зи йё щу отйельными молекулами ферментного белка и глутарового альдегида. Тайим образом, образуетс препарат иммрЬилйЭЪванного фёр1мейта, который обладает более высокой термической стабильностью. Следовательно, сочетание йвух самосто тельно п отё1гШгдйх реакций в присутствий реакционно спосрбных бифункциональных реагентов приводит к повышению доли стабильной фракции иммобилизованного фермента в препарате от 30 до 55%, а скорость Термической инактивации стабильйой фракции фер5иента уменьшаетс в 4 раза при температуре 70с. При м е р 1. Взвешивают 10 г силанизированного 3-аминопропилтриэтоксйланбм силохрома СХ-2 с размерами частиц 0,25-0,5 мм и содержанием активйых аминогрупп на поверх нрсти носител 190 мл-экв/г. Добав .л к5т 1,5 г кристаллического 1,4-бен4 зохинона и 40 МП технического зтанола . После контактировани суспензии в течение 1 ч при комнатной температуре полученный продукт промывают техническим зтанолом до полного исчезновени темно-коричневого цвета в промывных водах (всего 500 мл/г), а затем дистиллированной водой (всего 200 мл/г) дл удалени следов зтанола . Получают 22,3 г влажного материала . Длд проведени иммобилизации пенициллинамидазы 10 г материала смешивают с 50 мл ферментного раствора с пенициллинамидазной активностью 20000 Е/мл. За единицу де)стви пенициллийамидазы прин то такое ее количество , которое гидролизует К-соль бензилпенициллина в 17 мл раствора при и рН 7,0 в присутствии 0,1 М КС6 с образованием одного мкмоль фенилуксусной кислоты в 1 ч. После инкубации смеси при комнатной температуре в течение 10 ч готовый материал промывали сначала дистиллиройанной водой (всего 1000 мл), а затем 1 М раствором НаСЙ дл удалени нёпрореагировавшего фермента. Получают 9,9 г иммобилизованной , пенициллйнамидазы, котора обладает активностью 5200 Е/г сухого препарата . Дл увеличени стабильности полученного препарата его обрабатывшот при помощи водного раствора глутарового альдегида: на 8,5 г иммобилизованной пенициллинамидазы добавл ют 90 мл 0,1 м фосфатного буфера рН 7,0 и 10 мл раствора глутарового альдегида (1,5 мл.экв. на 1 г влажного материала). СмеСь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. После обработки препарат промывают дл удалени следов глутарового альдегида дистиллированной водой- (всего 500 мл). . Дл определени стабильности препарата инкубируют его при температуре 40с в 0,1 М фосфатномбуфере (рН 7,5), в течение 800-1000 ч. Скорость термической инактивации иммобилизованной пенициллинамидазы равн етс 0,000333 ч . Сравнительные данные по стабильности препаратов пенициллинамидазы, обработанной глутаровым альдегидом и без него, приведены в табл. 1.
Стабильность препаратов иммобилизованной пенициллииамидазы, полученной ковалентным св зьшанием фермента 1,2-бензохиноном и обработанных глутаровым альдегидом и без него
,Табл
Таким образом, применение глутарового альдегида приводит к увеличению работоспособности иммобилИзоваиной пенициллинамидазы (активность не ниже 3000 Е/г) не меньше, чем в 3 4 раза. Пример 2. Получение активйрованного носител осуществл ют так же, как описано в примере 1. С целью получени препарата с - галактозидаз ной активностью составл ют смесь из фермента и носител (5 мл ферментного раствора активностью 48 Е/мл на 1 г носител ). После инкубации в течение 5 ч при комнатной температуре гранулы промывают 0,1 М ацетатным буфером рН 4,5 и 1 М раствором NaC6. Получают препарат с активностью 201,8 Е/г сухого материала. За единицу действи р-галактозида зы прин то такое ее количество, кото рое осуществл ет гидролиз синтетичес кого субстрата О-нитрофенил-fV-D-raлактопиранозида при температуре в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,2 с образованием мкмоль О-нитрофен6ла в течение 1 мин. Обработку глутаровум альдегидом провод т, как описано в Услови проведени о пенициллинамидазы глу и стабильность пол
1,17
1,50 0,77 0,64
22 22
900
3,33 3,7-5 800 примере 1. Примен ют 0,24 мл 25%-но-, ГО раствора глутарового альдегида на 1 г сухого носител в 10 мл дистиллированной вода. Обработка продолжает;с в течение 2,5 ч. готовый арепаратг. промыва;йт 0,1 М ацетатным буфером ;РН 4,5, . Термостабильность имйобйли зованной ji-галактозидазы изучают Инкубированием препарата в 5%-ном растворе лактозы {рН .4,5) при температуре 70°С в течение 180 мин. Установлено, что препарат инак йвируетс в две (Стадии: за первой стадией (т.н. нестабильна фракци фермента, всего 42%) , следует втора стади с iстабильной фракцией фермента (58%). Скорость инактивации ста- бильной фракции фермента 0,0095 мин. Примеры З-б. Эти примеры описывают обработку глутаровым альдегидом препаратов иммобилизованной пенициллинамидазы в различных услови х . ; Услови проведени обработки и результаты по стабильности препаратов приведены в табл. 2. IT а .6 л и ц а 2 тки иммобилизованной зым альдегидом ных препаратов
Ста бильность определ ют после инкубации препарата в 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,5 и температуре 4(fc. П РИМ е р 7, Получают активиро ваиннй 1,4 бенэохиноном носитель еле дующим образом. Взвешивают 10 г силохрома СХ-2 с рйэмерами частиц 0,25-0,5 мм,добавл ют 20 мл дистиллированной воды и 1,0 мл 3-аминопропилтриэтоксисилана {ссэДержание аминогрупп в силане 3800 мк-экв/ип) перемешивают и остав л ют при комнатной температуре. Чераэ 3 ч гранулы фильтруют и нагреваю при температуре 120С в течение 1 ч. 1Транулы промывают многократно (5 раз по 300 мл дистиллированной водой) до исчезновени в промывных водах следов снлана (обнаруживают хиноном). С«адержа:ние активных аминогрупп на по вёрхнрсти носител 180 м(экв/гсухогоматериала . На 10 г обработамйого сйланом силохрома добавл ют 1,5 г кристалличес кого 1/4-бе1Нзохинона и 40 мл техничебкого этанола. После контактировани суспензий в течение 1 i при ком 1атной температуре полученный темнокоричневый продукт промывают 1Рёхническим этанолом, дистиллированной водой и 0,05 М ацетатным буфером рН 4,7. ;. - -..:-; . . .г..:.--. - Дл получени имйобилизовйнвой инвертазы примен ют дрожкёву о йнвертазу марки А Олайнеского завода химреактивов. 7,5 г порошка инвертазы раствор ют в 50 мл 0,05 М ацетатного буфера рН 4,7, активность 15400 Е/мл (всего 770000 Е). Активность инвертазы выражают в микромол х сахарозы,котора расщепл етс пр действии фермента в 7%-ном растворе сахарозы в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,7 при температуре 40с. 50 МЛ раствора инвертазы приливают к 50 г гранул влажного активированного силохрома . Полученную суспензию (после
Продолжение табл.2 тщательного перемешивани ) оставл ют в xoJ: oдильникё. Реакци носител с фермен том проДОлжает с 17,5 ч,фильт рацией удал ют 48 мл ферментного pacTBOiia с активностью 3120 (вce го 149760 Ё, 19,4%).Препарат иммобилизованной инвертазы промывают ацетатным буфером (т.е. удал ют еще ч 81000 Е, 10,5%) и дополнительно 1 М раствором КСЙ (т.е. удал ют еще ISSOO Е, 2,2%) . Активнос-гь препарата иммобилизованной инвертазы - 4500 Е/г влажного носител (всего 225000 Е, 29,2%). :: Дл увеличени стабИ7 ьности полученного препарата его обрабатывают при помощи водного раствора глутарового альдегида} на 50 г икмобилизованной инвертазы добавл ют 480 мл 0,05 М ацетатного буфера рН 4,7 и 20 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида (0,5 мл-экв. на 1 г влажного материала), Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. После обработки препарат npoNHвают дл удалени следов глутарового альдегида 0,05 М а1 етатным буфером. Активность полученного npenajpaTa 4430 Е/г (всего 221500 Е, 28,8%). Дл проверки работоспособности данного препарата 49,8 г гранул им-. мобилизованной инвертазы помещают в терморегулируемую при колонку, а через нее пропускают раствор сахарозы с концентрацией 700 мг/мл со скоростью 14 мл/мин. Содержание редуцирующих Сахаров в продукте 690 мг/мл, степень конверсии 98,6%. Сравнителйные данные по термостабильности препаратов иммобилизованной инвертазы, обработанной глутаровым альдегидом и без него, приведены в табл. 3.
Стабильность препарйтЬв иммобилизованной йнве полученной ковалентным св зыванием фермента с 1,4-бензохиноном и обработанной глутаровым альдегидом и без него (стабильность определ ют хранением препаратов при в 0,05 М ацетатном буфере рй 4,7)
Врем полужйзни иммобилизованной инвертазы равн етс дл препарата, обработанного глутаровым альдегидом и без него, 160 и 86 мин соответственно . .Скорость тёрМоинактивации препарата увеличиваетс до 2 раз-.
Пример 8. Получение активированного нрсйфел дл иммобилизаций глюкоамилазы ;осу1Цёс вл ют так же, как опирано в примере 7. В рабрте примен ют- глюкЬайилазуфйрМы Ново (Да .ни ) Из Asp. hlgeг активностью i500 Е/мл и с содержанием белка 300 мг/мл. Активность фермента выра жаетс по способности образовывать из О,5%-ного растворимого крахмала в течение 1 мин при температуре 20 С и рН 4,7 (0,05 М ацетатный буфер) ;1 мкмоль глюкоаы. Концентрацию белка определ ют по поглощению фёрМентнЪго раствора, при 280 им.
На 11,6 г активированного силанрм и 1,4-бензЬхиноном силохрома добав л ют 25 мл ферментного раствора глюкоамилазы с активностью 500 Е/мП (всего 12500 .Е) и конт актируют суспензию в течение 114 ч при комнатной температуре . Маточный раствор содержит после реакции белка 117,5 мг/мл (всего 2938; мг, 39,2%) и имеет активность 480 1:/мл (всего 12000 Ё, 96%) . Препарат иммобилизованной глюкрамилазы имеет активность по 0,5% крахмалу 3093 Е/г влажного препарата.
ТаблицаЗ
Дл увеличени стабильности полученного препарата его ое5рабатывают при помощи водного раствора глутарового альдегида; на 11,0 г иммобилизованной глюкоамил азы дрб авЛ йт 91 Мл 0,05 М ацетатйого буфера рН 4,7 и 8,6 мл 25%-ногр раствора гЛутарозэого альдётйда (1,0 мл.-экв. на 1 г йЛаж-/ ного матё риала) . Смесь выдерживешт при комнатной тем11ератУ1 ё в течение 3 ч. После обработки прёпйрат ttfiotsaвают 0,05 М а1цетатным буфером дл удалени с Ледов глу т apoBplO альдегида. Активность полученного препарата 30,2 Е/г.
Дл проверки работоспособности иммобилизованной глюкоамилазы i О 94 г препарата помещают в термостатируемый реактор с перемешиванием и добавл ют 35%-ный раствор мальтодекстрииа (фирма Майзен, исходный|декстрозньай эквивалент 17,5) s 0,05 М ацетатном буфере рН 4,7. Гидролиз мальтодекстрина провод т при температуре . После id мин гидролиза содержание редуцир5 щих Сахаров (охфедел емых по Бёрнфельду динитросалициловой кислотой) 50 мг/мл, через 40 мин - 240 мг/мл,120 мин 280 мг/мл.
Сравнительные данные по термостабильности препарата иммобилизоваиной глюкоамилазы, обработанной глутаровьм альдегидом и без него, приведены в табл. 4.
NТаблица4
Claims (2)
- Стабильность препаратов иммобилизованной глюкоамилазы, полученной ковалентным св зыванием с -бенэохиноном и обработанной глутаровым альдегидом и без него (стабильность определ ли хранением препаратов при и в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,7) faxitu образом, активность препарата , Об| а«5отайного Рлутаров1ам альЖегидом , палАвт до 76% в течение 180 Мин в то врем как акт оность препарата без обработки глутаровым альдегидом Снижаетс до 76% уже в течение 90 мин т.е/ в 2 раза быстрее. Формула изоб1)етени Способ получени и юбилизoвaнныx ферментов nyTefi ковалеитного св зывани ферментов с водонерастворимыми носител ми, предварительно активированньми 1,4-бензохнноном, о т личаюцийс ем, что, с целью увеличени термостабнльности целевых продуктов, и «4bбйлизoвaнныe ферменты дополнительно обрабатывсйот глутаровымальдегидом в количестве , 0,5-3 . на 1 г носител при 4-40с в течение 1-24 ч. Источники информации, прин т : во внимание при экспертизе , 1. Иммобилизбванные ферменты. Сб. под ред. Березина И.В, Антонблэа В.К Мартинека К.,т. 1. М,, изд-во МГУ, 1976.
- 2. Патент США О 2615349, кл. С 07 G7/OOj 1976 (прототип).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU772527891A SU744002A1 (ru) | 1977-09-29 | 1977-09-29 | Способ получени иммобилизованных ферментов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU772527891A SU744002A1 (ru) | 1977-09-29 | 1977-09-29 | Способ получени иммобилизованных ферментов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU744002A1 true SU744002A1 (ru) | 1980-06-30 |
Family
ID=20726348
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU772527891A SU744002A1 (ru) | 1977-09-29 | 1977-09-29 | Способ получени иммобилизованных ферментов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU744002A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2500814C2 (ru) * | 2011-08-19 | 2013-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермский государственный национальный исследовательский университет" | Способ получения иммобилизованного биокатализатора для синтеза водных растворов амидов |
-
1977
- 1977-09-29 SU SU772527891A patent/SU744002A1/ru active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2500814C2 (ru) * | 2011-08-19 | 2013-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермский государственный национальный исследовательский университет" | Способ получения иммобилизованного биокатализатора для синтеза водных растворов амидов |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US3802997A (en) | Method of stabilizing enzymes | |
DE2703615C2 (ru) | ||
US4013514A (en) | Preparing a reactor containing enzymes attached to dialdehyde cellulose | |
US4983524A (en) | Method of immobilizing enzymes on a support with iridoid aglycone cross-linking agents | |
CA1289091C (en) | Method for immobilization of enzyme and immobilized enzymes | |
CN112980807B (zh) | 一种基于dna与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法 | |
JPS6216637B2 (ru) | ||
Chen et al. | Preparation and characterization of urease immobilized onto porous chitosan beads for urea hydrolysis | |
EP0105736B1 (en) | Immobilization of proteins on polymeric supports | |
US5508185A (en) | Lipase immobilized on a chitosan carrier | |
Bautista et al. | Covalent immobilization of acid phosphatase on amorphous AlPO4 support | |
Burteau et al. | Stabilisation and immobilisation of penicillin amidase | |
Suckling | Immobilized enzymes | |
SU744002A1 (ru) | Способ получени иммобилизованных ферментов | |
Powell | Developments in immobilized-enzyme technology | |
Letts et al. | Chemical modification of mushroom tyrosinase for stabilization to reaction inactivation | |
US4043869A (en) | Water insoluble biologically active material | |
Cheetham et al. | Studies on dextranases: Part III. Insolubilization of a bacterial dextranase | |
Wang et al. | Immobilization of lipase on epoxy activated (1→ 3)-α-d-glucan isolated from Penicillium chrysongenum | |
AU729928B2 (en) | Immobilized esterases from crude extract and their use | |
KR950014967B1 (ko) | 모라노린 유도체의 제법 | |
Simionescu et al. | XV. Hydrolases immobilized on Biozan R | |
CA1203187A (en) | Immobilization of invertase on polyethylenimine- coated cotton cloth | |
Simos et al. | Immobilization of barley β-glucosidase on solid supports—yields and properties | |
SU1041567A1 (ru) | Способ получени водорастворимого иммобилизованного протеолитического комплекса |