KR950014967B1

KR950014967B1 - 모라노린 유도체의 제법

Info

Publication number: KR950014967B1
Application number: KR1019870004727A
Authority: KR
Inventors: 신 스기야마; 히로하루 에즈라; 마시히꼬 고지마; 가쯔노리 미야자끼
Original assignee: 닛본신야꾸 가부시기가이샤; 모리시다 히로시
Priority date: 1986-05-14
Filing date: 1987-05-14
Publication date: 1995-12-20
Also published as: ATA121387A; KR870011253A; ES2007346A6; AT392288B; JPS62267292A

Abstract

내용 없음.

Description

모라노린 유도체의 제법

본 발명은 하기 일반식[Ⅰ]로 표시되는 올리고글루코실 모라노린 유도체의 새로운 제조방법에 관한 것이다.

식중, R은 수소 또는 1개 이상의 수소기를 가져도 되는 저급 알킬을 표시하고, n은 0-15의 정수를 표시한다.

상기 일반식[Ⅰ]으로 표시되는 화합물중, 예를 들면 n이 0-15를 함유하는 것의 혼합물은 예를 들면 글루코아밀라제(α-1,4-글루칸글루코하이드로라제 EC 3.2.1.3)를 작용시키므로써 하기 일반식[Ⅲ]으로 표시되는 화합물로 극히 우수한 수율로 변환이 가능하고(일본국 특개소 57-058890호 공보 등), 또[Ⅰ]의 혼합물에서 극성용매를 사용하는 분별 결정법을 적용하므로써 우수한 수율로 [Ⅲ]을 얻을 수 있다(일본국 특원소 59-237326호 기타).

[식중, R은 상기와 동일]

(주. 또 [Ⅲ]은 [Ⅰ]에 있어서의 n=0의 화합물이다).

화합물[Ⅲ]은 당 부하(負荷)시에 있어서의 우수한 혈당 상승 억제작용등을 가지고, 의약품, 예를 들면 당뇨병 치료약으로서 극히 유용하다(일본국 특개소 56-081595호 공보 등). 따라서 본 발명은 극히 유용한 의약품 원료를 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명 화합물을 제조하기 위해서는 다음과 같은 방법이 상용된다.

즉, 하기 일반식[Ⅱ]로 표시되는 모라노린 유도체와 사이클로 덱스트린 또는 가용성 전분을 함유하는 수용액에 사이클로 덱스트린 글리코실 트랜스퍼라제(EC 2.4.1.19. cyclodextrin glycosyltransferase)를 작용시켜서, 일반식[Ⅰ]로 표시되는 올리고 글루코실 모라노린 유도체의 혼재물을 제조하는 것이다.

[식중, R은 상기와 동일함]

그러나, 상기 사이클로 덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(이하, 「CGTase」로 표시함)는 대단히 값이 비싸고, 상기 효소의 회수, 재이용을 할 수 있는 방법이 요망되고 있다. 또 CGTase는 양성물질이므로 이효소반응에 따라 얻어지는 반응 혼합물중에서 염기성물질인 일반식[Ⅰ]의 순수한 제품을 취득하기 위해서는 효소의 분리를 위한 여러가지 전 처리 조작이 필요했다. 또, 공업적 규모로의 반응을 희망하는 경우에는 장기간에 걸친 반복 사용이 가능한 제조법을 확립할 필요가 있으나, 불안정한 상태에 있는 효소를 이 목적에 사용하기에는 기술적인 어려움이 있었다.

본 발명자등은 상기의 종래 기술을 인식한 후에 예의 연구를 계속한 결과, CGTase를 고정화하므로써 상기 문제점이 해결되는 것을 발견하고 본 발명을 완성할 수 있었다.

본 발명의 요지는 일반식[Ⅱ] 화합물에서 일반식[Ⅰ] 화합물을 취득하는 과정에 있어서 고정화 CGTase를 사용하는 점에 있다. 또 본 명세서에 있어서 「고정화」CGTase는 포괄형 및 결합형을 포함하는 개념이다(千畑一郞 편집「고정화 효소」講談社 사이엔티픽 참조).

본 발명의 실시에 있어서 포괄형(包括型)을 적용할 경우에는 예를 들어 CGTase를 지지체에 포괄시키므로써 실시 가능하다. 포괄시키는 지지체로서는 중합체의 겔 등이 바람직하고, 합성 고분자의 폴리아크릴아미드겔, 폴리비닐알콜겔등을 들 수 있고, 또, 예를 들면 CGTase를 팽윤에 의하여 겔화가 가능한 k-카라게닌(carrageenin)등의 다당류 물질에 포함시켜서 사용할 수도 있다. 지지체는 필요에 따라, 예를 들면 글루타르알데히드나 헥사메텔렌디아민등을 첨가하므로써 물리적으로 보강할 수 있다. 이와 같은 물리적 보강을 해서 본 발명을 실시할 경우에는 효소반응을 저해하는 일없이 반응액과의 접촉을 원활하게 할수 있으므로 바람직하다.

지지체는 예를 들면, 1㎜ 이상 1㎝ 이하의 직경을 가지는 구상(球狀)등의 형을 형성시키고, 이것을 컬럼에 물리적으로 충진시킨후 상기 컬럼에 반응액을 순환시키는 등의 방법에 의하여 화합물[Ⅱ] 및 사이클로 덱스트린 또는 가용성 전분을 함유하는 용액을 CGTase와 접촉시켜서 화합물[Ⅰ]을 취득할 수 있다.

포괄형에 의한 고정화에 의하면 CGTase를 정제하는 일없이 조효소액의 형태 그대로 사용할 수 있으므로 보다 유리한 방법이라 할 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서 결합형을 적용할 경우에는 예를 들면 공유결합법, 이온결합법 및 물리적 흡착법등을 선택하여 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서 공유결합법을 실시할 경우에는 CGTase가 가지는 작용기, 예를 들면 아미노기가 카르복실기와 공유결합할 수 있는 기를 가지는 불용성 담체와 공유 결합시켜서 그 담체에 결합시킬 수 있다. 예를 들면 정제후의 CGTase를 예를 들면 CNBr-세파로즈 등의 다당류와 반응시켜서 결합시키고, 이것을 수용액 등에 현탁시킨 상태로 화합물[Ⅱ]의 수용액 및 사이클로 덱스트린 또는 가용성 전분을 함유하는 용액을 CGTase접촉시키므로써 화합물[Ⅰ]을 취득할 수 있다.

이 경우에도 CGTase와 결합시키는 담체로서 사용할 수 있는 것은 모두 본 발명에서 말하는 고정화에 포함되는 담체이다.

일반적으로 효소를 반복 계속적으로 사용할 경우에 해당효소를 고정화하는 것은 고려하지 않은 것은 아니다. 그러나, CGTase를 고정화하여 본 발명 화합물에 적용하는 것에 착상한 것은 본 발명자 등이 최초이고, 또 고정화 CGTase가 후술하는 바와 같이 120일을 초과하는 장기간에 걸쳐서 안정된 효소활성을 지니는 것을 발견한 것도 본 발명자등의 업적이다.

[실시예]

이하, 실시예를 들어서 더욱 상세히 설명한다.

[참고예]

[바실러스ㆍ마세란스의 배양]

500㎖의 3각 플라스크에 콘ㆍ스티풀리카 1%, 가용성전분 1%, 황산 암모늄 0.5%, 탄산칼슘 0.5%, 및 pH 7의 배양액 100㎖를 첨가형 120℃에서 15분간 가열 멸균한다.

펩톤 1%, 이스트 0.5%, 글루코스 0.3%, 글리세롤 1.5%, 식염 0.3%, 레버분말(OXOID(등록상표)) 2.5%, 한천(우무) 1.5%의 사면 배양지상에서 충분히 생장하고 있는 바실러스ㆍ마세란스 IFO 3490 균주를 백금 루프(loop)로 3회 접종하여 37℃에서 3일간 진탕(振湯) 배양한다. 상기 배양액 600㎖를 동일한 배지조성 18ℓ의 배양기(jarㆍfermenter : 내용량 30ℓ)에 접종하여 37℃에서 3일간 충분히 통기 교반하면서 배양하면 원심 상청액으로 통상 130-150단위의 효소액을 얻는다.

[사이클로 덱스트린 글리코실 트랜스퍼라제 활성의 단위]

0.05M 초산 완충액(pH 5.5)에 가용성 전분(半井化學製 생화학 연구용) 0.7%를 용해하여, 기질 용액을 제조한다. 상기 기질 용액 950㎕에 효소액 50㎕를 첨가하여 40℃에서 10분 반응시킨후 0.5N 초산 0.5㎖를 첨가하여 반응을 종료시킨다. 반응액 100㎕를 취하여 0.25M의 요오드칼륨 수용액에 0.01M이 되도록 요오드를 용해한 요오드 용액 0.8㎖와 물 3㎖를 첨갛여 교반한후 660㎚에서 흡광도를 측정하여 AT치로 한다. 동일하게 기질용액 950㎕에 물 50㎕, 0.5N 초산 0.5㎖를 첨가한 용액 100㎕를 취하여 요오드 용액을 첨가하여 660㎚에서 흡광도를 측정하여 AR치로 한다.

1단위=[(AR-AT)/AR]×100×2

1단위는 효소용액 1㎖가 40℃에서 1분간에 1%의 흡광도의 감소를 발생시키는 활성을 나타낸다.

[조(粗)효소액의 조제]

바실러스ㆍ마세란스 IFO 3490의 배양액을 원심분리하여 상청액을 얻어, 이것을 동결 건조시켜 소량의 물에 용해하여 효소의 농축액을 얻는다. 5℃에서 외액(外液)으로 물을 사용하여 충분히 투석(透析)하여 저분자를 제외한 내액을 조효소액으로 사용한다. 필요에 따라 동결 건조시켜 분말로서 사용한다.

[효소의 정제]

조효소액은 황산암모늄을 0.25포화가지 첨가하여, 셀라이트(Celite)를 사용해서 여과하여 여액을 콘ㆍ스타치에 흡착시킨다. 0.033M의 인산수소나트륨으로 용출하여, 용출액을 황산암모늄으로 염석(salting out)(0-0.6포화)한다. 그후 투석하여, 투석액을 DEAE 셀룰로즈 컬럼 크로마토그래피에 회부하여 수세후, 용출한다. 용출액을 농축한후, 세파덱스 G-75컬럼크로마토그래피에 희부하면, 정제 효소를 얻는다(S. Kitahata 등. Agr. Biol. Chem., 38, 387-393(1974)).

[실시예 1]

(1) 0.9% 식염수중에 k-카라게닌을 65℃에서 5%(w/v)가 되도록 용해한 액 100㎖를 조제하여 65℃로 보온한다. 사이클로 덱스트린 글리코실 트랜스퍼라제 조효소액의 동결건조품(4150유닛/g) 33g을 물 400㎖에 30℃로 용해하여 30℃로 보온한다. 두 액을 혼합하여, 상기 용액을 별도로 조제한 0.3M CaCl₂수용액 4000㎖중에 교반하에 적하하여 구상의 고정화 사이클로 덱스트린 글리코실 트랜스퍼라제를 조제하여 그대로 5℃로 하룻밤 방치했다. 눈이 성긴 바구니를 준비하여 이것으로 용액을 선별하여 살짝 수세한 후 직경수 ㎜의 원 및 타원의 측면을 가지는 입상의 물질을 얻는다. 이것을 2.5% 글루타르 알데히드 수용액 4000㎖중에 넣어 살짝 교반하면서 40분간 처리한다. 또 0.5%의 헥사메틸렌디아민 수용액 4000㎖중에 넣어, 동일하게 30분간 처리한다. 눈이 성긴 바구니를 사용해서 용액과 선별하여 수세한다. 입상의 고형물을 얻는다.

(2) 상기 입상 고형물의 50g(습중량)을 컬럼(2.5㎝ ID×30㎝)에 충진한다. 모라노린 3g과α-사이클로 덱스트린 12g을 물 200㎖에 용해하여 pH 5.7로 조정한 액을 40℃, 유속 20m/h로 상기 컬럼에 72시간 순환시킨다. 반응액을 모아서, 강산성 이온효관수지 다우엑스 50W×(2H⁺) 50㎖에 회부하여 충분히 수세하고, 1N 암모니아수로 용출하여 감압하에 농축건조시켜, 분말 8.7g을 얻었다. 이것은 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 모라노린 11%, 올리고글루코실 모라노린 89%로 구성되는 혼합물이었다.

또, 고속액체 크로마토그래피의 조건은 이하와 동일하다.

Sumipax R741(Nucleosil 5NH₂, 5㎛, 4㎜ ID×25㎝), 전개용매 : 아세토니트릴-물(65 : 35), 유속 : 1㎖/min, RI 검출(애루마 光學株式會社, ERC-7510), 데이터ㆍ프로세서(日立製作所製, 655-60).

[실시예 2]

(1) 세파덱스 G-75컬럼 크로마토그래피를 경유하여 얻은 정제 사이클로 덱스트린 글리코실 트랜스퍼라제 105㎎을 0.5M 식염함유의 0.1M 탄산수소나트륨 수용액 30㎖에 용해하여, 이 용액에 CNBr-세파로즈 4B의 활성화담체(동결건조품 3g에 상당)을 첨가한다. 또, CNBr-세파로즈 4B의 활성화 담체는 시판의 CNBr-세파로즈 4B의 동결건조품 3g을 유리필터위에 취하여 1mM 염산 600㎖를 사용하여 세정 및 팽윤조작을 반복하여 조제했다. 25℃에서 3시간 진탕하여 반응시키고, 반응 종료후, 얻어진 분말을 수세하여, 이어서 0.5M 에탄올아민 30㎖를 사용해서 실온에서 2시간 처리한다. 0.5M 식염 함유 0.1M 인산-수소나트륨 수용액으로 충분히 세정한 후 충분히 수세하면 분말상의 고형물을 얻는다.

(2) 가용성전분 18g을 물 200㎖에 가열하면서 용해하여, 이것에 모라노린 3g을 용해하여 pH 5.7로 조정한다. 상기에서 얻은 분말 1g을 첨가하여 40℃에서 3일간 진탕을 계속한다. 반응액을 여과하여 수지하고, 강산성 이온 교환수지 다우엑스 50W×2(H⁺) 50㎖에 회부하여 충분히 수세한 후, 1N 암모니아수로 용출하여, 감압하에 농축건조ㆍ고화하여 분말 6.9g을 얻었다.

이것을 실시예 2와 동일한 방법으로 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 미 반응의 모라노린 18%, 올리고글루코실 모라노린 82%로 구성되는 혼합물이었다.

[실시예 3]

실시예 1의 (1)과 같은 방법으로 얻은 입상물 50g (습중량)을 컬럼(2.5㎝ ID×30㎝)에 충진하여 N-메틸모라노린 1.4g과 α-사이클로 덱스트린 22.4g을 물 200㎖에 용해하여 pH 5.7로 조정한 액을 40℃, 유속 20㎖/h로 상기 컬럼 내를 100시간 순환시켰다. 반응액을 수집하여 강산성 이온 교환수지 다우엑스 50W×2(H⁺) 50㎖에 회부하여 충분히 수세한 후, 1N 암모니아수로 용출하여, 감압하에 농축건조ㆍ고화시켜 분말 3.5g을 얻었다.

실시예 1과 동일한 방법으로 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 미반응의 N-메틸모라노린 15%, 올리고글루코실-N-메틸모라노린 85%로 구성되는 혼합물이었다.

[실시예 4]

가용성 전분 18g을, 물 200㎖에 가열하면서 용해한다. 또, N-메틸모라노린 3g을 용해하여 pH를 5.7로 조정한다. 실시예 2의 (2)와 동일한 방법으로 얻은 분말 1g을 첨가하여 40℃로 3일간 진탕을 계속한다. 반응액을 여과하여 수집해서 강산성 이온 교환수지 다우엑스 50W×2(H⁺) 50㎖에 회부하여 충분히 수세한 후, 1N 암모니아수로 용출하여 감압하에 농축 건조ㆍ고화해서 분말 6.3g을 얻었다.

실시예 1과 동일한 방법으로 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 미반응의 N-메틸모라노린 21%, 올리고글루코실-N-메틸모라노린 79%로 구성되는 혼합물이었다.

[실시예 5]

실시예 1의 (2)에서 사용한 실시예 1의 (1)의 입상고형물 50g(습중량)을 충진한 컬럼(2.5㎝ ID×30㎝)에, 재차, 모라노린 3g과α-사이클로덱스트린 12g을 물 200㎖에 용해하여 pH 5.7로 조정한 액을 40℃, 유속 20㎖/h로 상기 컬럼에 3일간 순환시킨다. 반응액을 수집하여 강산성 이온 교환수지 다우엑스 50W×2(H⁺) 50㎖에 회부하여, 충분히 수세하고, 1N 암모니아수로 용출하여 감압하에 농축 건조ㆍ고화시켜, 분말 8.7g을 얻었다. 이것은 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 모라노린 11%, 올리고글루코실 모라노린 89%로 구성되는 혼합물이었다.

상기 조작을 합계 120일간에 걸쳐서 합계 40회 반복했다. 제40회째의 취득분말을 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 모라노린 11%, 올리고글루코실 모라노린 89%로 구성되는 혼합물이었다.

[실시예 6]

실시예 1의 (1)과 동일한 방법으로 얻은 입상물 50g(습중량)을 컬럼(2.5㎝ ID×30㎝)에 충진하여, N-(2-하이드록시에틸)모라노린 2g과α-사이클로덱스트린 32g을 물 300㎖에 용해하여, pH 5.7로 조정한 액을 40℃, 유속 20㎖/h로 상기 컬럼내를 100시간 순환시켰다. 반응액을 수집하여 강산성 이온 교환수지 다우엑스 50W×2(H⁺) 50㎖에 회부하여, 충분히 수세한 후 1N 암모니아수로 용출하여 감압하에 농축건조ㆍ고화하여 분말 4.8g을 얻었다.

실시예 1과 동일한 방법으로 고속 액체크로마토그래피로 분석한 결과, 미반응의 N-(2-하이드록시에틸)모라노린 17%, 올리고글루코실-(N-(2-하이드록시에틸)모라노린 83%로 구성되는 혼합물이었다.

[실시예 7]

실시예 1의 (1)과 같은 방법으로 얻은 입상물 50g(습중량)을 컬럼(2.5㎝ ID×30㎝)에 충진하여, N-(2,3-디하이드록시프로필)모라노린 2g과α-사이클로 덱스트린 32g을 물 300㎖에 용해하여, pH 5.7로 조정한 액을 40℃, 유속 20㎖/h로 상기 컬럼내를 100시간 순환시켰다. 반응액을 수집하여 강산성 이온 교환수지 다우엑스 50W×2(H⁺) 50㎖에 회부하여 충분히 수세한 후, 1N 암모니아수로 용출하여 감압하에 농축건조ㆍ고화시켜 분말 4.8g을 얻었다.

실시예 1과 동일한 방법으로 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 미반응의 N-(2,3-디하이드록시프로필)모라노린 20%, 올리고글루코실-(N-(2,3-디하이드록시프로필)모라노린 80%로 구성되는 혼합물이었다.

Claims

하기 일반식[Ⅰ]로 표시되는 모라노린 유도체와 사이클로 덱스크린 또는 가용성 전분을 함유하는 수용액에 고정화 사이클로 덱스트린 글리코실 트랜스퍼라제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 하기 일반식[Ⅰ]로 표시되는 올리고글루코실 모라노린 유도체를 제조하는 방법 :

(상기 식중, R은 수소 또는 1개 이상의 수산기를 가져도 되는 저급알킬을 표시하며, n은 0-15의 정수를 표시한다)