JP3117092B2 - セファロスポリン誘導体をグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転化する方法 - Google Patents
セファロスポリン誘導体をグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転化する方法Info
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Description
【０００１】本発明は、セファロスポリン誘導体をグル
タリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転
化する方法に関する。
タリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転
化する方法に関する。
【０００２】セファロスポリンＣ（３−アセトキシメチ
ル−７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタン
アミド）セフ−３−エム−４−カルボン酸）を酵母トリ
ゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ
ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）の透過性化された細胞により酸
化してα−ケトアジピニル−７−アミノセファロスポラ
ン酸となし、次いで過酸化水素による酸化脱カルボキシ
ル化を行ってグルタリル−７−アミノセファロスポラン
酸を得ることができる（ドイツ特許出願公開第２ ２１
９ ４５４号明細書）。そこに記載される条件下では、
０．５−３時間の反応時間が必要であり、６０−７３％
の収率が達成される。
ル−７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタン
アミド）セフ−３−エム−４−カルボン酸）を酵母トリ
ゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ
ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）の透過性化された細胞により酸
化してα−ケトアジピニル−７−アミノセファロスポラ
ン酸となし、次いで過酸化水素による酸化脱カルボキシ
ル化を行ってグルタリル−７−アミノセファロスポラン
酸を得ることができる（ドイツ特許出願公開第２ ２１
９ ４５４号明細書）。そこに記載される条件下では、
０．５−３時間の反応時間が必要であり、６０−７３％
の収率が達成される。
【０００３】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼＥ．Ｃ．１．
４．３．３（以下、ＤＡＯと呼ぶ）は、Ｄ−アミノ酸か
らα−ケト酸、アンモニアおよび過酸化水素への酸化的
脱アミノ化を触媒する。
４．３．３（以下、ＤＡＯと呼ぶ）は、Ｄ−アミノ酸か
らα−ケト酸、アンモニアおよび過酸化水素への酸化的
脱アミノ化を触媒する。
【０００４】市販されるブタ腎臓からのＤＡＯのほか
に、この酵素は細菌、酵母および菌類により合成され
る。これらのうちトリゴノプシス・バリアビリスは良好
なＤＡＯ産生体として著名である。この酵素はＤ，Ｌ−
アミノ酸のラセミ体分割および各種溶液中のＤ−アミノ
酸の定量的検出に用いられるほか、セファロスポリンＣ
の酸化的脱アミノ化に対する効力に特に注目すべきであ
る。
に、この酵素は細菌、酵母および菌類により合成され
る。これらのうちトリゴノプシス・バリアビリスは良好
なＤＡＯ産生体として著名である。この酵素はＤ，Ｌ−
アミノ酸のラセミ体分割および各種溶液中のＤ−アミノ
酸の定量的検出に用いられるほか、セファロスポリンＣ
の酸化的脱アミノ化に対する効力に特に注目すべきであ
る。
【０００５】ベルギー特許第７３６ ９３４号明細書に
よれば、ＤＡＯは菌類（ｆｕｎｇｉ）から得られ、上記
セファロスポリンＣ酸化のためには細胞溶解によって放
出されなければならない。
よれば、ＤＡＯは菌類（ｆｕｎｇｉ）から得られ、上記
セファロスポリンＣ酸化のためには細胞溶解によって放
出されなければならない。
【０００６】ドイツ特許出願公開第２ ２１９ ４５４
号（米国特許第３ ８０１ ４５８号）明細書には、ト
リゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０９５の活性化細
胞を用いるセファロスポリンＣ誘導体の製造が記載され
ている。これに関して″活性化″は、酵母細胞が物理的
および／または化学的処理を受けて、細胞中に含まれる
ＤＡＯがセファロスポリンＣ（ＣＰＣ）酸化を触媒しう
る状態になされているが、実質的に放出されてはいない
ことを意味する。
号（米国特許第３ ８０１ ４５８号）明細書には、ト
リゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０９５の活性化細
胞を用いるセファロスポリンＣ誘導体の製造が記載され
ている。これに関して″活性化″は、酵母細胞が物理的
および／または化学的処理を受けて、細胞中に含まれる
ＤＡＯがセファロスポリンＣ（ＣＰＣ）酸化を触媒しう
る状態になされているが、実質的に放出されてはいない
ことを意味する。
【０００７】本発明の目的は、セファロスポリン誘導体
を対応するグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸
誘導体に実質的に完全に転化する方法において、既知の
水溶液中におけるセファロスポリンの分解が実質的に防
止され、用いられるＤＡＯ含有触媒の安定性が改良さ
れ、かつ高いグルタリル−７−アミノセファロスポラン
酸（Ｇ−７−ＡＣＡ）収率が達成される方法を見出すこ
とであった。
を対応するグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸
誘導体に実質的に完全に転化する方法において、既知の
水溶液中におけるセファロスポリンの分解が実質的に防
止され、用いられるＤＡＯ含有触媒の安定性が改良さ
れ、かつ高いグルタリル−７−アミノセファロスポラン
酸（Ｇ−７−ＡＣＡ）収率が達成される方法を見出すこ
とであった。
【０００８】セファロスポリン誘導体をグルタリル−７
−アミノセファロスポラン酸誘導体に実質的に完全に転
化しうる方法において、ＤＡＯ含有触媒により連続的に
反応を行い、適切である場合には次いで過酸化水素を添
加することよりなる方法が見出された。
−アミノセファロスポラン酸誘導体に実質的に完全に転
化しうる方法において、ＤＡＯ含有触媒により連続的に
反応を行い、適切である場合には次いで過酸化水素を添
加することよりなる方法が見出された。
【０００９】意外にもプロセスを連続的に実施すること
により、″バッチ（ｂａｔｃｈ）″法と比較して触媒の
利用率を実質的に改良することができた。さらに基質を
連続添加した場合、ＤＡＯ含有触媒の有効寿命がバッチ
法と比較して顕著に延長される。反応器内におけるＣＰ
Ｃ滞留時間の短縮も可能となった。
により、″バッチ（ｂａｔｃｈ）″法と比較して触媒の
利用率を実質的に改良することができた。さらに基質を
連続添加した場合、ＤＡＯ含有触媒の有効寿命がバッチ
法と比較して顕著に延長される。反応器内におけるＣＰ
Ｃ滞留時間の短縮も可能となった。
【００１０】従って本発明は、セファロスポリン誘導体
を対応するグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸
誘導体に転化する方法において、ＤＡＯ含有触媒により
連続的に反応を行い、適切な場合には次いで過酸化水素
を添加することよりなる方法に関する。
を対応するグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸
誘導体に転化する方法において、ＤＡＯ含有触媒により
連続的に反応を行い、適切な場合には次いで過酸化水素
を添加することよりなる方法に関する。
【００１１】本発明方法には、セファロスポリン環の位
置７にＤ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド
基をもつセファロスポリン誘導体をすべて用いることが
できる。式ＩＩのセファロスポリン誘導体
置７にＤ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド
基をもつセファロスポリン誘導体をすべて用いることが
できる。式ＩＩのセファロスポリン誘導体
【００１２】
【００１３】（式中、Ｘはアセテート基、求核体の残基
（ｒａｄｉｃａｌ）、複素環、ヒドロキシル基または水
素である）および式ＩＩのセファロスポリン誘導体の塩
類が、好ましくは式Ｉの化合物
（ｒａｄｉｃａｌ）、複素環、ヒドロキシル基または水
素である）および式ＩＩのセファロスポリン誘導体の塩
類が、好ましくは式Ｉの化合物
【００１４】
【００１５】（式中、Ｘは前記の意味を有し、Ｒはカル
ボキシル基またはケトカルボキシル基である）および式
Ｉのセファロスポリン誘導体の塩類に転化される。
ボキシル基またはケトカルボキシル基である）および式
Ｉのセファロスポリン誘導体の塩類に転化される。
【００１６】式ＩＩの化合物は比較的不純な状態および
予備精製された状態の双方で用いることができる。
予備精製された状態の双方で用いることができる。
【００１７】求核体（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）という
語は、たとえばピリジン類または第三アミンなどの化合
物を意味する。複素環という語は、たとえばチアゾリル
誘導体、ピリミジン類、６，７−ジヒドロシクロペンタ
［ｂ］ピリジン、チエニル、ピリジル、ピリダジニル、
チアゾリニル、ピラジニル、インドリニルまたはインダ
ゾリルを意味する。式ＩまたはＩＩの化合物の塩類は、
たとえば亜鉛塩、アンモニウム塩、またはアルカリ金属
もしくはアルカリ土類金属、たとえばナトリウム、カリ
ウム、カルシウムもしくはマグネシウムの塩類であ
る。″ＤＡＯ含有触媒″という語は、固定化されたＤ−
アミノ酸オキシダーゼ、粗製酵素、透過性化もしくは活
性化されたＤＡＯ含有細胞、粗く破壊されたＤＡＯ含有
細胞、または単離精製されたＤＡＯを意味する。活性化
または透過性化は、米国特許第３ ８０１ ４５８号明
細書の記載に従って、または既知の物理的もしくは化学
的方法により行われる。
語は、たとえばピリジン類または第三アミンなどの化合
物を意味する。複素環という語は、たとえばチアゾリル
誘導体、ピリミジン類、６，７−ジヒドロシクロペンタ
［ｂ］ピリジン、チエニル、ピリジル、ピリダジニル、
チアゾリニル、ピラジニル、インドリニルまたはインダ
ゾリルを意味する。式ＩまたはＩＩの化合物の塩類は、
たとえば亜鉛塩、アンモニウム塩、またはアルカリ金属
もしくはアルカリ土類金属、たとえばナトリウム、カリ
ウム、カルシウムもしくはマグネシウムの塩類であ
る。″ＤＡＯ含有触媒″という語は、固定化されたＤ−
アミノ酸オキシダーゼ、粗製酵素、透過性化もしくは活
性化されたＤＡＯ含有細胞、粗く破壊されたＤＡＯ含有
細胞、または単離精製されたＤＡＯを意味する。活性化
または透過性化は、米国特許第３ ８０１ ４５８号明
細書の記載に従って、または既知の物理的もしくは化学
的方法により行われる。
【００１８】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ）は多
数の生物から、たとえば微生物、植物、菌類、またはブ
タ腎臓のような動物器官から得られる。トリゴノプシス
からのＤＡＯが本発明方法に特に好適であることが証明
された。特にトリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０
９５からのＤＡＯを本方法に用いることができる。
数の生物から、たとえば微生物、植物、菌類、またはブ
タ腎臓のような動物器官から得られる。トリゴノプシス
からのＤＡＯが本発明方法に特に好適であることが証明
された。特にトリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０
９５からのＤＡＯを本方法に用いることができる。
【００１９】トリゴノプシス・バリアビリスからのＤＡ
Ｏの調製は、たとえば米国特許第３８０１ ４５８号明
細書に記載される発酵法により行われる。細胞はグルコ
ース、酵母エキス、リン酸カリウム、慣用される塩類お
よび微量元素、ならびに窒素源としてのメチオニンまた
はアラニンを含有する複雑な栄養培地中で培養される。
Ｏの調製は、たとえば米国特許第３８０１ ４５８号明
細書に記載される発酵法により行われる。細胞はグルコ
ース、酵母エキス、リン酸カリウム、慣用される塩類お
よび微量元素、ならびに窒素源としてのメチオニンまた
はアラニンを含有する複雑な栄養培地中で培養される。
【００２０】ＤＡＯは、精製された酵素、分離された粗
製抽出物、細胞抽出物として、粗く破壊された細胞の形
で、または他の酵素と共に、固定化することができる。
トリゴノプシス・バリアビリス細胞は、たとえば培養後
に化学的または物理的方法（米国特許第３ ８０１ ４
５８号明細書）により破壊し、次いで既知の方法で固定
化することができる。たとえば固定化は多糖類、たとえ
ばアルギナート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、寒天、キトサン
またはカラジーナン内にトラップすることにより、また
はポリマー、たとえばアクリルポリマー、たとえばポリ
アクリルアミド、もしくは架橋ポリアミン内にトラップ
することにより行われる。架橋ポリアミンは、好ましく
はジ−またはポリアルデヒド、たとえばグルタルアルデ
ヒドにより架橋した不活性蛋白質、たとえばアルブミン
またはゼラチンである。ジ−もしくはポリアルデヒドま
たはポリリン酸により架橋した多糖類、たとえばキチン
またはキトサンを用いることもできる。
製抽出物、細胞抽出物として、粗く破壊された細胞の形
で、または他の酵素と共に、固定化することができる。
トリゴノプシス・バリアビリス細胞は、たとえば培養後
に化学的または物理的方法（米国特許第３ ８０１ ４
５８号明細書）により破壊し、次いで既知の方法で固定
化することができる。たとえば固定化は多糖類、たとえ
ばアルギナート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、寒天、キトサン
またはカラジーナン内にトラップすることにより、また
はポリマー、たとえばアクリルポリマー、たとえばポリ
アクリルアミド、もしくは架橋ポリアミン内にトラップ
することにより行われる。架橋ポリアミンは、好ましく
はジ−またはポリアルデヒド、たとえばグルタルアルデ
ヒドにより架橋した不活性蛋白質、たとえばアルブミン
またはゼラチンである。ジ−もしくはポリアルデヒドま
たはポリリン酸により架橋した多糖類、たとえばキチン
またはキトサンを用いることもできる。
【００２１】ＤＡＯを含有する精製された、部分精製さ
れた、または粗製の細胞抽出物の固定化に適した方法
は、たとえばキャリヤー結合固定化法である。たとえば
ＤＡＯは触媒反応に本質的でないリジン残基を介して共
有結合により高分子キャリヤーに結合させることができ
る。他の方法はＤＡＯをキャリヤーに吸着させ、次いで
たとえばグルタルアルデヒドにより架橋する方法であ
る。
れた、または粗製の細胞抽出物の固定化に適した方法
は、たとえばキャリヤー結合固定化法である。たとえば
ＤＡＯは触媒反応に本質的でないリジン残基を介して共
有結合により高分子キャリヤーに結合させることができ
る。他の方法はＤＡＯをキャリヤーに吸着させ、次いで
たとえばグルタルアルデヒドにより架橋する方法であ
る。
【００２２】適切な酵素キャリヤーは、高分子多孔質キ
ャリヤー、たとえばセルロース、たとえばＤＥＡＥ−も
しくはＣＭ−セルロース、セファロース、たとえばＢｒ
ＣＮもしくはジビニルスルホンにより活性化されたセフ
ァロース、アミノ基もしくはヒドロキシル基を含む改質
ポリアクリルアミドゲル、またはアクリルアミド、メタ
クリレートもしくはメタクリルアミドおよび無水マレイ
ン酸の各種有機コポリマーである。さらに酵素キャリヤ
ーとして、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジ
ルエーテル、メチレンビスメタクリルアミドおよびメタ
クリルアミドのコポリマー、たとえばユーペルギット
（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ、登録商標）を用いることもでき
る。
ャリヤー、たとえばセルロース、たとえばＤＥＡＥ−も
しくはＣＭ−セルロース、セファロース、たとえばＢｒ
ＣＮもしくはジビニルスルホンにより活性化されたセフ
ァロース、アミノ基もしくはヒドロキシル基を含む改質
ポリアクリルアミドゲル、またはアクリルアミド、メタ
クリレートもしくはメタクリルアミドおよび無水マレイ
ン酸の各種有機コポリマーである。さらに酵素キャリヤ
ーとして、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジ
ルエーテル、メチレンビスメタクリルアミドおよびメタ
クリルアミドのコポリマー、たとえばユーペルギット
（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ、登録商標）を用いることもでき
る。
【００２３】好ましい酵素キャリヤーは、ドイツ特許出
願公開第３ ３４４ ９１２号明細書によるポリビニル
エステルおよびポリビニルアルコールを基礎とする架橋
ポリマーである。ＤＡＯと酵素キャリヤー間の固着反応
（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、たとえ
ばドイツ特許第２ ２１５ ６８７号明細書に記載の既
知方法により行われる。この反応は通常は室温で、また
は＋４０℃もしくはそれ以下の温度で、特に＋１０℃以
下の温度、好ましくは０−＋５℃で行われる。固着反応
は好ましくは中性ｐＨ付近、たとえば５−９のｐＨ値で
行われる。マクロ多孔質粒状ポリマーは中性領域でもＤ
ＡＯと速やかに反応するので、原則としてより強い酸性
またはアルカリ性の条件を維持する必要はない。これに
より得られる結合によって、長期貯蔵に十分な安定性お
よび高い操作安定性が得られる。
願公開第３ ３４４ ９１２号明細書によるポリビニル
エステルおよびポリビニルアルコールを基礎とする架橋
ポリマーである。ＤＡＯと酵素キャリヤー間の固着反応
（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、たとえ
ばドイツ特許第２ ２１５ ６８７号明細書に記載の既
知方法により行われる。この反応は通常は室温で、また
は＋４０℃もしくはそれ以下の温度で、特に＋１０℃以
下の温度、好ましくは０−＋５℃で行われる。固着反応
は好ましくは中性ｐＨ付近、たとえば５−９のｐＨ値で
行われる。マクロ多孔質粒状ポリマーは中性領域でもＤ
ＡＯと速やかに反応するので、原則としてより強い酸性
またはアルカリ性の条件を維持する必要はない。これに
より得られる結合によって、長期貯蔵に十分な安定性お
よび高い操作安定性が得られる。
【００２４】本発明方法を実施するために最良の方法
は、互いに接続した１、２またはそれ以上の反応容器に
ＤＡＯ含有触媒を充填し、反応容器に基質を連続的に導
通することである。容器は基質および生成物と反応しな
い不活性材料から構成される。容器はたとえば撹拌槽、
バブルカラムまたはループ反応器であり、冷却／加熱ジ
ャケット内に収容することができる。容器は基質および
生成物流のための入口および出口開口を備え、反応容器
内で十分な混合が行われるように調整される。容器には
他の開口から酸素または酸素含有ガス混合物、たとえば
空気、Ｏ２富化空気または窒素／酸素混合物を供給する
こともできる。反応液は適宜、撹拌機により混合するこ
とができる。反応容器は、ＤＡＯ含有触媒が流出するの
を実質的に防止すべく透過性が選ばれた適宜な保持装
置、たとえば焼結ディスク、メンブレンまたはフィルタ
ースクリーンを備えている。反応容器は未使用ガスの排
出を可能にする適宜な開口をも備えている。さらに反応
容器は反応過程を監視するための測定点、たとえばｐＨ
または酸素分圧の測定点を備えている。
は、互いに接続した１、２またはそれ以上の反応容器に
ＤＡＯ含有触媒を充填し、反応容器に基質を連続的に導
通することである。容器は基質および生成物と反応しな
い不活性材料から構成される。容器はたとえば撹拌槽、
バブルカラムまたはループ反応器であり、冷却／加熱ジ
ャケット内に収容することができる。容器は基質および
生成物流のための入口および出口開口を備え、反応容器
内で十分な混合が行われるように調整される。容器には
他の開口から酸素または酸素含有ガス混合物、たとえば
空気、Ｏ２富化空気または窒素／酸素混合物を供給する
こともできる。反応液は適宜、撹拌機により混合するこ
とができる。反応容器は、ＤＡＯ含有触媒が流出するの
を実質的に防止すべく透過性が選ばれた適宜な保持装
置、たとえば焼結ディスク、メンブレンまたはフィルタ
ースクリーンを備えている。反応容器は未使用ガスの排
出を可能にする適宜な開口をも備えている。さらに反応
容器は反応過程を監視するための測定点、たとえばｐＨ
または酸素分圧の測定点を備えている。
【００２５】基質溶液は第１反応容器へ送入される。こ
れは、ＤＡＯにより触媒されてセファロスポリン誘導体
と酸素が反応し、対応するα−ケトアジピニル−７−ア
ミノセファロスポラン酸誘導体、アンモニアおよび過酸
化水素になる場所である。得られた生成物および未反応
セファロスポリン誘導体は次の反応容器へ送入される。
セファロスポリン誘導体が実質的に転化されるまでこの
操作が反復される。さらにα−ケトアジピニル−７−ア
ミノセファロスポラン酸誘導体（ＫＡ−７−ＡＣＡ）
は、反応容器内で生成した過酸化水素により酸化的脱カ
ルボキシル化を受けてグルタリル−７−アミノセファロ
スポラン酸となる。ＫＡ−７−ＡＣＡが完全には転化さ
れない場合、下流の反応容器内へ過酸化水素を制御され
た様式で計量装入し、これによりＧ−７−ＡＣＡへの反
応を実質的に完全に行わせることができる。過酸化水素
の添加により反応容器内のレドックス電位が変化する。
連続操作においては、完全な転化に必要な過酸化水素含
量はレドックス電極により測定され、次いで適宜な制御
装置によって過酸化水素を計量装入することにより一定
に維持することができる。この操作により過剰供給が避
けられる。さもなければ副反応、たとえばイオウの酸化
が起こる可能性がある。
れは、ＤＡＯにより触媒されてセファロスポリン誘導体
と酸素が反応し、対応するα−ケトアジピニル−７−ア
ミノセファロスポラン酸誘導体、アンモニアおよび過酸
化水素になる場所である。得られた生成物および未反応
セファロスポリン誘導体は次の反応容器へ送入される。
セファロスポリン誘導体が実質的に転化されるまでこの
操作が反復される。さらにα−ケトアジピニル−７−ア
ミノセファロスポラン酸誘導体（ＫＡ−７−ＡＣＡ）
は、反応容器内で生成した過酸化水素により酸化的脱カ
ルボキシル化を受けてグルタリル−７−アミノセファロ
スポラン酸となる。ＫＡ−７−ＡＣＡが完全には転化さ
れない場合、下流の反応容器内へ過酸化水素を制御され
た様式で計量装入し、これによりＧ−７−ＡＣＡへの反
応を実質的に完全に行わせることができる。過酸化水素
の添加により反応容器内のレドックス電位が変化する。
連続操作においては、完全な転化に必要な過酸化水素含
量はレドックス電極により測定され、次いで適宜な制御
装置によって過酸化水素を計量装入することにより一定
に維持することができる。この操作により過剰供給が避
けられる。さもなければ副反応、たとえばイオウの酸化
が起こる可能性がある。
【００２６】セファロスポリン誘導体は反応混合物に固
体状で、または適宜追加の緩衝剤成分を含む水溶液とし
て添加することができる。セファロスポリン誘導体の濃
度は広範に、たとえば０．００１−１Ｍ、好ましくは
０．０１−０．１Ｍの範囲に及びうる。酸素の導入量
は、毎時、反応液の体積リットル当たり１−５００ｌの
Ｏ２、好ましくは毎時、反応液の体積リットル当たり１
０−１００ｌのＯ２である。用いられるＤＡＯ濃度は、
反応液の体積リットル当たり１０−５０００単位（Ｕ）
である。ＤＡＯ含有触媒は０．１−９５重量％、好まし
くは０．５−５０％、特に１−２０％の量で用いられ
る。
体状で、または適宜追加の緩衝剤成分を含む水溶液とし
て添加することができる。セファロスポリン誘導体の濃
度は広範に、たとえば０．００１−１Ｍ、好ましくは
０．０１−０．１Ｍの範囲に及びうる。酸素の導入量
は、毎時、反応液の体積リットル当たり１−５００ｌの
Ｏ２、好ましくは毎時、反応液の体積リットル当たり１
０−１００ｌのＯ２である。用いられるＤＡＯ濃度は、
反応液の体積リットル当たり１０−５０００単位（Ｕ）
である。ＤＡＯ含有触媒は０．１−９５重量％、好まし
くは０．５−５０％、特に１−２０％の量で用いられ
る。
【００２７】５−９、好ましくは６．０−８．５のｐＨ
を用いるのが有利である。反応を４−６５℃、特に１０
−５０℃の温度範囲で行うことも適切である。最適な方
法は用いられる個々のＤＡＯ含有触媒に依存し、簡単な
予備試験によって容易に確立される。
を用いるのが有利である。反応を４−６５℃、特に１０
−５０℃の温度範囲で行うことも適切である。最適な方
法は用いられる個々のＤＡＯ含有触媒に依存し、簡単な
予備試験によって容易に確立される。
【００２８】容器内における反応液の滞留時間は５−８
００分、好ましくは２０−１２０分である。この方法は
無菌条件下または非−無菌条件下で行うことができる。
００分、好ましくは２０−１２０分である。この方法は
無菌条件下または非−無菌条件下で行うことができる。
【００２９】反応生成物は精製後、または未精製状態
で、既知の化学的または酵素による転化法によって７−
アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）に転化するこ
とができる。７−ＡＣＡは多数の半合成抗生物質の出発
物質である。
で、既知の化学的または酵素による転化法によって７−
アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）に転化するこ
とができる。７−ＡＣＡは多数の半合成抗生物質の出発
物質である。
【００３０】以下、本発明を例によってより詳細に説明
する。％のデータは重量基準である。
する。％のデータは重量基準である。
【００３１】例１ トリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０９５を下記の
栄養素溶液中で前培養として培養した： グルコース ２０ ｇ／ｌ（別個にオートクレーブ処理） Ｄ，Ｌ−メチオニン ４ ｇ／ｌ（別個にオートクレーブ処理） ＫＨ２ＰＯ４ ２ ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４ × ７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／ｌ ＣａＣｌ２ × ６Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０．１ｇ／ｌ 微量元素溶液 １０ ｍｌ ビタミン溶液 １ ｍｌ（オートクレーブ処理後に添加） ｐＨ６．０ ビタミン溶液： ビオチン ２０ ｍｇ／ｌ チアミン １００ ｍｇ／ｌ エタノールに溶解（５０％） 微量元素溶液： ホウ酸 ５ ｇ／ｌ ＭｎＣｌ２ × ４Ｈ２Ｏ ２ ｇ／ｌ ＣｕＣｌ２ × ３Ｈ２Ｏ ２ ｇ／ｌ ＺｎＳＯ４ × ７Ｈ２Ｏ １ ｇ／ｌ ＦｅＣｌ３ × ６Ｈ２Ｏ ３．４ｇ／ｌ ２回蒸留水に溶解斜面培養試験管からのＮａＣｌ懸濁
液、ＯＤ５７８ｎｍ＝１８、を１％接種物として用い
た。前培養は３０℃および１９０ｒｐｍで２４時間行わ
れた。
栄養素溶液中で前培養として培養した： グルコース ２０ ｇ／ｌ（別個にオートクレーブ処理） Ｄ，Ｌ−メチオニン ４ ｇ／ｌ（別個にオートクレーブ処理） ＫＨ２ＰＯ４ ２ ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４ × ７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／ｌ ＣａＣｌ２ × ６Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０．１ｇ／ｌ 微量元素溶液 １０ ｍｌ ビタミン溶液 １ ｍｌ（オートクレーブ処理後に添加） ｐＨ６．０ ビタミン溶液： ビオチン ２０ ｍｇ／ｌ チアミン １００ ｍｇ／ｌ エタノールに溶解（５０％） 微量元素溶液： ホウ酸 ５ ｇ／ｌ ＭｎＣｌ２ × ４Ｈ２Ｏ ２ ｇ／ｌ ＣｕＣｌ２ × ３Ｈ２Ｏ ２ ｇ／ｌ ＺｎＳＯ４ × ７Ｈ２Ｏ １ ｇ／ｌ ＦｅＣｌ３ × ６Ｈ２Ｏ ３．４ｇ／ｌ ２回蒸留水に溶解斜面培養試験管からのＮａＣｌ懸濁
液、ＯＤ５７８ｎｍ＝１８、を１％接種物として用い
た。前培養は３０℃および１９０ｒｐｍで２４時間行わ
れた。
【００３２】発酵は下記の条件下で行われた： 栄養素溶液： 前培養に用いたものに相当するが、下記の量となるよう
に供給された：グルコース ３０
ｇ／ｌ Ｄ，Ｌ−メチオニン ６ ｇ／ｌ デスモフェン ０．１％ （所望によ
り） （Ｄｅｓｍｏｐｈｅｎ、登録商標） 発酵条件： 接種量 ２．５−５％ 温度 ２８℃ 発酵時間 ５０−６０時間 ＤＡＯを測定するために、０．４ｇの細胞を凍結し、次
いで酸性ｐＨ、たとえば約３−４で融解した；凍結は−
１０℃以下の温度、たとえば約−２０℃で実施しうる。
凍結はＤＡＯを細胞から放出させるのに十分なほど、た
とえば−２０℃で少なくとも１時間持続すべきである。
に供給された：グルコース ３０
ｇ／ｌ Ｄ，Ｌ−メチオニン ６ ｇ／ｌ デスモフェン ０．１％ （所望によ
り） （Ｄｅｓｍｏｐｈｅｎ、登録商標） 発酵条件： 接種量 ２．５−５％ 温度 ２８℃ 発酵時間 ５０−６０時間 ＤＡＯを測定するために、０．４ｇの細胞を凍結し、次
いで酸性ｐＨ、たとえば約３−４で融解した；凍結は−
１０℃以下の温度、たとえば約−２０℃で実施しうる。
凍結はＤＡＯを細胞から放出させるのに十分なほど、た
とえば−２０℃で少なくとも１時間持続すべきである。
【００３３】活性は測光法により、下記のアッセイ混合
物を用いて測定された：溶液 ： １）緩衝液 １００ ｍＭ ＫＰＰ；ｐＨ７．３；空気飽和 ２）ｏ−フェニレンジアミン ０．０２ ％、Ｈ２Ｏ中 ３）ペルオキシダーゼ １ ｍｇ／ｍｌ、緩衝液中 ４）酵素 最適量：０．５−１．０ 単位／ｍｌ ５）基質 １５０ ｍＭ Ｎａ−ＣＰＣ（１００％）、緩 衝液中アッセイ法 ： λ＝４０５ ｎｍ（最大） ε＝４０２０ ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ υ＝３０℃容量 ： 最終濃度： １）２．００ ｍｌ ８３ ｍＭ ２）０．５０ ｍｌ ０．００３４ ％ ３）０．１０ ｍｌ ０．０３４ ｍｇ／ｍ
ｌ ４）０．０５ ｍｌ ２分間待つ５）０．３０ ｍｌ １５．２５ ｍＭ ２．９５ ｍｌ計算 ：単位 ＿ △Ｅ・希釈度・全容量 ｍｌ 分・ε・ｄ・試料容量 上記の条件下で発酵槽中において２００ Ｕ／ｌの酵素
活性に達した。
物を用いて測定された：溶液 ： １）緩衝液 １００ ｍＭ ＫＰＰ；ｐＨ７．３；空気飽和 ２）ｏ−フェニレンジアミン ０．０２ ％、Ｈ２Ｏ中 ３）ペルオキシダーゼ １ ｍｇ／ｍｌ、緩衝液中 ４）酵素 最適量：０．５−１．０ 単位／ｍｌ ５）基質 １５０ ｍＭ Ｎａ−ＣＰＣ（１００％）、緩 衝液中アッセイ法 ： λ＝４０５ ｎｍ（最大） ε＝４０２０ ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ υ＝３０℃容量 ： 最終濃度： １）２．００ ｍｌ ８３ ｍＭ ２）０．５０ ｍｌ ０．００３４ ％ ３）０．１０ ｍｌ ０．０３４ ｍｇ／ｍ
ｌ ４）０．０５ ｍｌ ２分間待つ５）０．３０ ｍｌ １５．２５ ｍＭ ２．９５ ｍｌ計算 ：単位 ＿ △Ｅ・希釈度・全容量 ｍｌ 分・ε・ｄ・試料容量 上記の条件下で発酵槽中において２００ Ｕ／ｌの酵素
活性に達した。
【００３４】例２ 不均質−架橋−粒状共重合反応を実施するために、８０
ｇの酢酸ビニル、２０ｇのジビニルエチレン尿素、１ｇ
のアゾイソブチロニトリルおよび２００ｇのｎ−ヘプタ
ノールの溶液を、水５００ｍｌ中の０．１７５ｇのＮａ
Ｈ２ＰＯ４、３ｇのＮａ２ＨＰＯ４および５ｇのポリビ
ニルピロリドンの溶液中で分散および重合させた。４時
間後に、希釈剤を水蒸気蒸留により除去し、生成物を単
離した。収量は完全に丸い透明な粒状ポリマー７７．７
ｇであった。平均粒子直径は約３０μｍであった（撹拌
速度４６０ｒｐｍ）。
ｇの酢酸ビニル、２０ｇのジビニルエチレン尿素、１ｇ
のアゾイソブチロニトリルおよび２００ｇのｎ−ヘプタ
ノールの溶液を、水５００ｍｌ中の０．１７５ｇのＮａ
Ｈ２ＰＯ４、３ｇのＮａ２ＨＰＯ４および５ｇのポリビ
ニルピロリドンの溶液中で分散および重合させた。４時
間後に、希釈剤を水蒸気蒸留により除去し、生成物を単
離した。収量は完全に丸い透明な粒状ポリマー７７．７
ｇであった。平均粒子直径は約３０μｍであった（撹拌
速度４６０ｒｐｍ）。
【００３５】生成物は嵩容量１．５５ｍｌ／ｇを有して
いた。加水分解生成物は嵩容量１．５４ｍｌ／ｇを有
し、水中で膨潤して５ｍｌ／ｇとなった。
いた。加水分解生成物は嵩容量１．５４ｍｌ／ｇを有
し、水中で膨潤して５ｍｌ／ｇとなった。
【００３６】２０ｇの加水分解した粒状共重合体を２０
０ｍｌのエピクロルヒドリン中、室温で２４時間膨潤さ
せた。次いで徐々に撹拌しながら温度を１１３−１１５
℃に上昇させ、４時間維持した。冷後、共重合体を吸引
ろうとにより濾別し、アセトン中で数回、１時間ずつ撹
拌することにより抽出した。アセトン含有共重合体を真
空オーブン中で５０℃において一定重量になるまで乾燥
させた。エポキシド当量は２４４であった（アキセン
（Ａｘｅｎ）：Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．Ｂ２
９（１９７５）Ｎｏ．４の方法により測定）。
０ｍｌのエピクロルヒドリン中、室温で２４時間膨潤さ
せた。次いで徐々に撹拌しながら温度を１１３−１１５
℃に上昇させ、４時間維持した。冷後、共重合体を吸引
ろうとにより濾別し、アセトン中で数回、１時間ずつ撹
拌することにより抽出した。アセトン含有共重合体を真
空オーブン中で５０℃において一定重量になるまで乾燥
させた。エポキシド当量は２４４であった（アキセン
（Ａｘｅｎ）：Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．Ｂ２
９（１９７５）Ｎｏ．４の方法により測定）。
【００３７】例３ ５００μｌのＤＡＯ含有溶液（２０Ｕ／ｍｌ）を例２と
同様にして調製した１００ｍｇのキャリヤーに添加し
た。１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を添加して酵素液をｐ
Ｈ７．８に調整した。キャリヤーへの酵素の固定化には
２５℃で７２時間を要した。次いで、キャリヤーに共有
結合しなかったＤＡＯをガラス濾過器により吸引除去
し、残渣を１Ｍ塩化ナトリウム溶液で数回、次いで緩衝
液で洗浄した。吸引濾過器からの湿潤物質の収量は３２
４ｍｇであった。例１に示したと同様に活性を測定し、
湿潤状態で１８Ｕ／ｇの値を得た。
同様にして調製した１００ｍｇのキャリヤーに添加し
た。１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を添加して酵素液をｐ
Ｈ７．８に調整した。キャリヤーへの酵素の固定化には
２５℃で７２時間を要した。次いで、キャリヤーに共有
結合しなかったＤＡＯをガラス濾過器により吸引除去
し、残渣を１Ｍ塩化ナトリウム溶液で数回、次いで緩衝
液で洗浄した。吸引濾過器からの湿潤物質の収量は３２
４ｍｇであった。例１に示したと同様に活性を測定し、
湿潤状態で１８Ｕ／ｇの値を得た。
【００３８】例４ トリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０９５の細胞を
例１に示した条件下で培養し、凍結乾燥により透過性化
した。次いで湿潤重量１ｇの細胞を１０ｍｌの１％濃度
キトサン水溶液と混合し、混合物を２％濃度のトリポリ
リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０；２５℃）に滴加
することにより固定化した。２．５Ｕ／ｇ（触媒の湿潤
重量）のＤＡＯ活性が得られた。
例１に示した条件下で培養し、凍結乾燥により透過性化
した。次いで湿潤重量１ｇの細胞を１０ｍｌの１％濃度
キトサン水溶液と混合し、混合物を２％濃度のトリポリ
リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０；２５℃）に滴加
することにより固定化した。２．５Ｕ／ｇ（触媒の湿潤
重量）のＤＡＯ活性が得られた。
【００３９】例５ Ａ．１個の反応容器内での酵素による転化ＤＡＯを例３
に記載したと同様に固定化し、撹拌機およびジャケット
付きの１．５ｌガラス容器内でセファロスポリンＣと共
にインキュベートした。下記の反応パラメーターを採用
した： 作業容量 １ ｌ 温度 ２５℃ ＤＡＯ濃度 ４ ％、固定化したも
の（例３） ７２０ Ｕ／ｌ 酸素 ５０ ｌ／時 ｐＨ ７．０ セファロスポリンＣ ３０ ｍＭ 撹拌機速度 ３００ ｒｐｍ 反応時間 １１０分 １１０分後に、用いたセファロスポリンＣの８５％が転
化された。反応液を固定化ＤＡＯから分離し、酵素に新
鮮な基質溶液を供給した。３２時間後に、転化率は５０
％未満に低下した。
に記載したと同様に固定化し、撹拌機およびジャケット
付きの１．５ｌガラス容器内でセファロスポリンＣと共
にインキュベートした。下記の反応パラメーターを採用
した： 作業容量 １ ｌ 温度 ２５℃ ＤＡＯ濃度 ４ ％、固定化したも
の（例３） ７２０ Ｕ／ｌ 酸素 ５０ ｌ／時 ｐＨ ７．０ セファロスポリンＣ ３０ ｍＭ 撹拌機速度 ３００ ｒｐｍ 反応時間 １１０分 １１０分後に、用いたセファロスポリンＣの８５％が転
化された。反応液を固定化ＤＡＯから分離し、酵素に新
鮮な基質溶液を供給した。３２時間後に、転化率は５０
％未満に低下した。
【００４０】Ｂ．連結した反応容器内での酵素による転
化ＤＡＯを例３に記載したと同様に固定化し、撹拌機お
よびジャケット付きの１ｌガラス容器２個に充填した。
セファロスポリン溶液を第１反応容器に連続的に送入
し、ここから第２反応容器に導通した。下記のパラメー
ターを採用した： 作業容量／容器 ０．５ ｌ 温度 ２５℃ ＤＡＯ濃度 ４ ％、固定化したも
の（例３） ７２０ Ｕ／ｌ 酸素 ３０ ｌ／時 ｐＨ ７．０ セファロスポリンＣ ３０ ｍＭ 撹拌機速度 ３００ ｒｐｍ 滞留時間／容器 ５０分 全滞留時間 １００分 １００分後に、用いたセファロスポリンＣの８５％が転
化された。触媒の交換は４８時間後に必要となったにす
ぎない。この時点で、転化率が用いたセファロスポリン
Ｃの８５％未満に低下したからである。
化ＤＡＯを例３に記載したと同様に固定化し、撹拌機お
よびジャケット付きの１ｌガラス容器２個に充填した。
セファロスポリン溶液を第１反応容器に連続的に送入
し、ここから第２反応容器に導通した。下記のパラメー
ターを採用した： 作業容量／容器 ０．５ ｌ 温度 ２５℃ ＤＡＯ濃度 ４ ％、固定化したも
の（例３） ７２０ Ｕ／ｌ 酸素 ３０ ｌ／時 ｐＨ ７．０ セファロスポリンＣ ３０ ｍＭ 撹拌機速度 ３００ ｒｐｍ 滞留時間／容器 ５０分 全滞留時間 １００分 １００分後に、用いたセファロスポリンＣの８５％が転
化された。触媒の交換は４８時間後に必要となったにす
ぎない。この時点で、転化率が用いたセファロスポリン
Ｃの８５％未満に低下したからである。
【００４１】表１は方法Ａと本発明による方法Ｂの比較
を示す。
を示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】方法Ａ 本発明による 方法Ｂ 収率 １．０
１．０ 触媒利用率 １．０
１．５ 反応時間 １．０
０．９ 空間−時間収率 １．０
１．１
１．０ 触媒利用率 １．０
１．５ 反応時間 １．０
０．９ 空間−時間収率 １．０
１．１
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 35/00 - 35/06 C12N 9/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (10)
- 【請求項１】 セファロスポリン誘導体を対応するグル
タリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に転化す
る方法において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．
１．４．３．３．）含有触媒の存在下で連続的に反応を
行うことを含んでなる方法。 - 【請求項２】 反応液が反応器カスケードに導通され
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 菌類からのＤ−アミノ酸オキシダーゼが
使用される、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 式(II)のセファロスポリン誘導体 【化１】 ［式中、Ｘはアセテート基、求核体の残基、複素環、ヒ
ドロキシル基又は水素である］及び式(II)のセファロス
ポリン誘導体の塩が、式(I)の化合物 【化２】 ［式中、Ｘは前記の意味を有し、Ｒはカルボキシル基又
はケトカルボキシル基である］及び式(I)のセファロス
ポリン誘導体の塩に転化される、請求項１又は２に記載
の方法。 - 【請求項５】 Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが多糖類によ
り固定化される、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項６】 アルギナート、カラジーナン又はキトサ
ンが使用される、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 ポリビニルエステル及びポリビニルアル
コールの、又はグリシジルメタクリレート、アリルグリ
シジルエーテル、メタクリルアミド及びメチレンビスメ
タクリルアミドのコポリマーよりなる酵素キャリヤーが
使用される、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項８】 Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを含有する活
性化又は透過性化された細胞が使用される、請求項１又
は２に記載の方法。 - 【請求項９】 過酸化水素が連続的に添加される、請求
項１又は２に記載の方法。 - 【請求項１０】 過酸化水素が後から添加される、請求
項１又は２に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4028119A DE4028119C1 (ja) | 1990-09-05 | 1990-09-05 | |
| DE4028119:1 | 1990-09-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04229190A JPH04229190A (ja) | 1992-08-18 |
| JP3117092B2 true JP3117092B2 (ja) | 2000-12-11 |
Family
ID=6413630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03226000A Expired - Fee Related JP3117092B2 (ja) | 1990-09-05 | 1991-09-05 | セファロスポリン誘導体をグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転化する方法 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0474211B1 (ja) |
| JP (1) | JP3117092B2 (ja) |
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| AT (1) | ATE133204T1 (ja) |
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| DE (2) | DE4028119C1 (ja) |
| DK (1) | DK0474211T3 (ja) |
| ES (1) | ES2083495T3 (ja) |
| FI (1) | FI103806B1 (ja) |
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| IE (1) | IE70755B1 (ja) |
| IL (1) | IL99382A (ja) |
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| PT (1) | PT98863B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| ES2097080B1 (es) * | 1993-03-08 | 1997-11-16 | Asahi Chemical Ind | Procedimiento para la conversion de cefalosporina c en acido glutaril-7-aminocefalosporanico. |
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