NO180594B - Fremgangsmåte for kontinuerlig omsetning av cefalosporinderivater til glutaryl-7-aminocefalosporansyrederivater - Google Patents

Description

Cefalosporin C (3-acetoksymetyl-7p<->(D-5-amino-5-karboksypen-tanamido)-cef-3-em-4-karboksylsyre) kan oksyderes med permeaMliserte celler av gjæren Trigonopsis variabilis til a-ketoadipinyl-7-aminocefalosporansyre og deretter oksydativt dekarboksyleres med hydrogenperoksyd til glutaryl-7-aminocefalosporansyre (DOS 2 219 454). Under de der angitte betingelsene er reaksjonstider på 0,5 til 3 timer påkrevet for å oppnå et utbytte på 60 til 73$. D-aminosyre-oksydase E.C. 1.4.3.3 (i det følgende betegnet DAO) katalyserer den oksydative desamineringen av D-aminosyrer til de tilsvarende a-ketosyrene, ammoniakk og hydrogenperoksyd.

Ved siden av den kommersielt tilgjengelige DAO fra svinenyrer blir enzymet syntetisert av bakterier, gjær og sopp. Blant disse utmerker Trigonopsis variabilis seg som god DAO-produsent. Ved siden av anvendelsen av dette enzymet for racemat-adskillelse av D,L-aminosyrer og den kvantitative påvisningen av D-aminosyrer i forskjellige oppløsninger skal evnen til oksydativ desaminering av cefalosporin C spesielt fremheves.

Ifølge det belgiske patentskrift 736 934 utvinnes DAO fra sopper og må for den nevnte oksydasjonen av cefalosporin C settes fri ved lysering.

I det tyske utlegningsskrift 22 19 454 (US-patentskrift 3 801 458) beskrives fremstillingen av cefalosporin C-derivater ved hjelp av aktiverte celler av Trigonopsis variabilis CBS 4095. "Aktivert" betyr her at gjærcellene er blitt underkastet en fysikalsk og/eller kjemisk fremgangsmåte slik at det i cellene inneholdte DAO blir tilgjengelig for katalyse av oksydasjonen av cefalosporin C (CPC), men imidlertid ikke settes substantielt fritt.

Oppgaven ved foreliggende oppfinnelse var å finne en fremgangsmåte for i det vesentlige fullstendig omsetning av cefalosporinderivater til de tilsvarende glutaryl-7-aminoce-falosporansyrederivatene, hvorved den kjente dekomponeringen av cefalosporin i vandige oppløsninger i det vesentlige forhindres, stabiliteten av den anvendte DAO-holdige katalysatoren er forbedret og hvorved det oppnås et høyt utbytte av glutaryl-7-aminocefalosporansyre (G-7-ACS).

Det er nå funnet en fremgangsmåte for omsetning av cefalosporinderivater med en D-5-amino-5-karboksypentanamidgruppe ved posisjon 7 av cefalosporinringen, til tilsvarende glutaryl-7-aminocefalosporansyrederivater, kjennetegnet ved at reaksjonsoppløsningen føres gjennom en rørekjelekaskade og at reaksjonen gjennomføres kontinuerlig i nærvær av D-aminosyreoksydase (E.C.1.4.3.3.)-holdig katalysator som eventuelt er immobilisert med polysakkarider og at det eventuelt deretter kontinuerlig tilsettes hydrogenperoksyd.

Overraskende kunne det ved kontinuerlig fremgangsmåtegjen-nomføring oppnås en vesentlig forbedring av katalysatorut-nyttelsen sammenlignet med den "satsvise" fremgangsmåten. Videre ble standtiden for den DAO-holdige katalysatoren forhøyet ved den kontinuerlige tilsatsen av substratene sammenlignet med den satsvise fremgangsmåten. Videre kunne oppholdstiden for CPC i reaksjonsbeholderene reduseres.

Under begrepet "DAO-holdig katalysator" forstås immobiliserte D-aminosyreoksydaser, rått enzym, permeabiliserte eller aktiverte DAO-holdige celler, grovt oppsluttede DAO-holdige celler eller isolert, renset DAO. Aktiveringen eller permeabiliseringen foregår som beskrevet i US 3 801 458 eller ved kjente fysikalske eller kjemiske fremgangsmåter.

D-aminosyreoksydase (DAO) kan utvinnes fra tallrike organ-ismer, eksempelvis fra mikroorganismer, planter, sopper eller animalske organer, som svinenyrer. Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har DAO fra Trigonopsis vist seg spesielt velegnet. Spesielt DAO fra Trigonopsis variabilis CGS 4095 kan anvendes i fremgangsmåten.

Fremstillingen av DAO fra Trigonopsis variabilis foregår ved fermentering som for eksempel beskrevet i US-patent 3 801 458. Dyrkingen av cellene foregår i et komplekst næringsmed-ium som inneholder glukose, gjærekstrakt, kaliumfosfat, vanlige salter og sporelementer, samt metionin eller alanin som nitrogenkilde.

DAO kan immobiliseres som renset enzym, isolert råekstrakt, celleekstrakt, i form av grovt oppsluttede celler eller sammen med andre enzymer. Trigonopsis variabilis cellene kan eksempelvis brytes opp etter dyrkingen ved kjemiske eller fysikalske fremgangsmåter (US-patent 3 801 458) og deretter immobiliseres ved kjente fremgangsmåter. Eksempelvis kan det foregå en immobilisering ved inneslutning i polysakkarider som for eksempel alginat, agar, chitosan eller carrageenan eller ved inneslutning i polymerer som akrylpolymer, for eksempel polyakrylamid eller tverrbundne polyaminer. Det tverrbundede polyaminet er fortrinnsvis et med et di- eller polyaldehyd som glutaraldehyd tverrbundet inert protein, som for eksempel albumin eller gelatin. Det kan også anvendes polysakkarider, som chitin eller chitosan, som er tverrbundet med et di- eller polyaldehyd henholsvis polyfosfat.

For immobiliseringen av rensede, delvis rensede eller rå celleekstrakter som inneholder DAO, kommer for eksempel bærerbundede immobil iseringsfremgangsmåter på tale. Eksempelvis kan DAO kobles ved hjelp av en kovalent binding over en for katalyse ikke vesentlig lysinrest til den polymere bæreren. En ytterligere mulighet er adsorpsjonen av DAO på en bærer samt etterfølgende tverrbinding med for eksempel glutardialdehyd.

Som enzymbærer kommer polymere, porøse bærere som celluloser, for eksempel DEAE- eller CM-celluloser, sefaroser, som for eksempel BrCN- eller divinylsulfonaktlverte sefaroser, modifisete polyakrylamidgeler med amino- eller hydroksylgrup-per eller forskjellige organiske kopolymerisater av akryl-amid, metakrylater eller metakrylamid og maleinsyreanhydrid på tale. Videre kan det som enzymbærer også anvendes kopolymerer av glycidylmetakrylat, allylglycidyleter, metylenbismetylakrylamid og metakrylamid, som for eksempel "Eupergit".

Foretrukne enzymbærere er tverrbundne polymer på basis av polyvinylester og polyvinylalkoholer ifølge DOS 33 44 912. Forankringsreaksjonen mellom DAO og enzymbærer foregår på kjent måte, som for eksempel beskrevet i DE 2 215 687. For det meste foregår omsetningen ved romtemperatur, henholdsvis ved + 40°C eller lavereliggende temperaturer, spesielt ved temperaturer under +10°C, fortrinnsvis ved 0 til +5°C.

Forankringsreaksjonen foregår fortrinnsvis i omgivelsen omkring en nøytral pH-verdi, eksempelvis ved pH-verdier på 5 til 9. Som regel er det heller ikke nødvendig å anvende sterkere sure eller alkaliske betingelser, idet de makro-porøse perlepolymerisatene reagerer raskt med DAO også allerede i nøytralområdet. Den derved dannede bindingen gir tilstrekkelig stabilitet for lengre lagring og høy opera-sj onsstabilitet.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen går man fortrinnsvis fram slik at man fyller den DAO-holdige katalysatoren i en, to eller flere reaksjonsbeholdere som er forbundet med hverandre og kontinuerlig fører substratene gjennom reaksjonsbeholderen eller -beholderene. Beholderene består av et inert materiale som ikke reagerer med substratene og produktene. Beholderene er for eksempel rørekar, blæresøyler eller sløyfereaktorer og kan være omgitt med en kjøle/varme-mantel. Beholderene har innløps- og utløpsåpninger for substrat- og produkt strømmen og er anordnet slik at det kan komme til en god gjennomblanding i reaksjonsbeholderen. Beholderene kan ved hjelp av en ytterligere åpning tilføres oksygen eller en oksygenholdig gassblanding, for eksempel luft, Og anriket luft eller nitrogen/oksygen-blandinger. Eventuelt kan reaksjonsoppløsningen blandes ved hjelp av en rører. Reaksjonsbeholderene utstyres med en tilsvarende tilbakeholdelsesinnretning som for eksempel fritte, membran eller filtersikt, hvis gjennomtrengelighet velges slik at en bortflytning av den DAO-holdige katalysatoren i det vesentlige forhindres. Reaksjonsbeholderene er også utstyrt med tilsvarende åpninger, slik at en fjernelse av den ikke-forbrukte gassen er mulig. Reaksjonsbeholderene har videre måleposisjoner for å følge reaksjonsforløpet, for eksempel måling av pH-verdien eller oksygenpartialtrykket.

Substratoppløsningen pumpes inn i den første reaksjonsbeholderen. Her foregår den av DAO katalyserte reaksjonen av cefalosporinderivater med oksygen til tilsvarende a-ketoadi-pinyl-7-aminocefalosporansyrederivat, ammoniakk og hydrogenperoksyd. De dannede produktene og fremdeles ikke omsatte cefosporinderivatene kan pumpes inn i den neste reaksjonsbeholderen. Denne fremgangsmåten gjentas inntil cefalosporinderivatene er i det vesentlige omsatt. Videre finner det i reaksjonsbeholderene med det dannede hydrogenperoksydet og a-ketoadipinyl-7-aminocefalosporansyrederivatet (KA-7-ACS) sted en oksydativ dekarboksylering til glutaryl-7-aminocefalosporansyre. Dersom det ikke kommer til en fullstendig omsetning av KA-7-ACS, kan det i en etterkoblet reaksjonsbeholder kontrollert tildoseres hydrogenperoksyd, slik at reaksjonen forløper i det vesentlige fullstendig til G-7-ACS. Ved tilsats av hydrogenperoksyd forandres redokspotensialet i reaksjonsbeholderen. Ved kontinuerlig drift kan ved hjelp av en redokselektrode det for fullstendig omsetning nødvendige hydrogenperoksydinnholdet måles og via en tilsvarende kontrollinnretning holdes konstant ved etterdosering av hydrogenperoksyd. Ved denne fremgangsmåten unngås en overdosering som ellers kan føre til bireaksjoner, som for eksempel oksydasjon av svovel.

Tilsatsen av cefalosporinderivatet til reaksjonsblandingen kan foregå i fast form eller som oppløsning i vann med eventuelt ytterligere bufferkomponenter. Konsentrasjonen av cefalosporinderivatene kan varieres innenfor vide grenser, eksempelvis mellom 0,001 og 1 M, fortrinnsvis mellom 0,01 og 0,1 M. Den innførte oksygenmengden kan utgjøre mellom 1 og 500 1 Og pr. time og 1 reaksjonsoppløsningsvolum, fortrinnsvis 10 til 100 1 Og pr. time og 1 reaksjonsoppløsningsvolum. Den anvendte DAO konsentrasjonen ligger mellom 10 og 5000 enheter (U) pr. liter reaksjonsbeholdervolum. Av den DAO-holdige katalysatoren anvendes mellom 0,1 og 95 vekt-#, fortrinnsvis 0,5 til 50%, spesielt 1 til 20%.

Det arbeides fordelaktig ved en pH-verdi mellom 5 og 9, fortrinnsvis mellom 6,0 og 8,5. Det er dessuten hensiktsmes-sig å gjennomføre reaksjonen i et temperaturområde fra 4 til 65° C, spesielt 10 til 50°C. Den gunstigste fremgangsmåten avhenger av den i ethvert tilfelle anvendte DAO-holdige katalysatoren og kan lett fastslås ved enkle forforsøk.

Oppholdstiden for reaksjonsoppløsningen i en beholder kan ligge mellom 5 min. og 800 min., fortrinnsvis 20 til 120 min. Fremgangsmåten kan gjennomføres under sterile eller ikke sterile betingelser.

Reaksjonsproduktene kan etter rensing eller også i urenset tilstand ved kjente kjemiske eller enzymatiske omsetninger overføres til 7-aminocefalosporansyre (7-ACS). 7-ACS er utgangssubstrat for et stort antall semisyntetiske anti-biotika.

I det følgende belyses oppfinnelsen nærmere ved hjelp av eksempler. Prosentangivelser er angitt på basis av vekt.

Eksempel 1

Som forkultur dyrkes Trigonopsis variabilis CBS 4095 i følgende næringsoppløsning:

Vitaminoppløsning 1 ml (tilsatt etter autoklav behandling)

pH 6,0

Vitaminoppløsning:

oppløst i etanol (50%)

Sporelementoppløsning:

oppløst i dobbeltdestillert vann.

Som 1% inokulum tjente en NaCl-avskylling fra skråttstilte rør med en 0D57gnm = 18. Forkulturvarigheten utgjør 24 timer ved 30°C og 190 opm.

Fermenteringen gjennomføres under følgende betingelser:

Næringsoppløsning:

Næringsoppløsningen tilsvarer den fra forkulturen, men forøket til følgende mengder:

Fermenteringsbetingelser:

For DAO-bestemmelse innfryses 0,4 g celler, fulgt av opptining ved sur pH, for eksempel ca. pH 3-4; nedfrysingen kan gjennomføres ved en temperatur under -10°C, for eksempel ca. -20°C. Det skal nedfryses så lenge at frigivelsen av DAO fra cellen fremkalles, for eksempel minst 1 time ved -20°C.

Aktiviteten bestemmes fotometrisk med følgende forsøksbland-ing:

Oppløsninger:

Forsøksg. jennomføring: X = 4 05 nm (maksimum)

E = 4020 l/mol<*>cm

v = 30°C

Beregning:

Under de ovenfor angitte betingelsene kan det beregnes en enzymaktivitet i fermenteren på 200 enheter/liter.

Eksempel 2

For gjennomføring av en heterogen-tverrbindende perlekopoly-merisasjon ble en oppløsning av 80 g vinylacetat, 20 g divinyletylenurea, 1 g azoisobutyronitril og 200 g n-heptanol dispergert og polymerisert i oppløsningen av 0,175 g NaH2P04, 3 g Na2HP04 og 5 g polyvinylpyrrolidon i 500 ml vann. Etter fire timer ble fortynningsmidlet fjernet ved vanndampdestil-lasjon og produktet isolert. Utbyttet utgjorde 77,7 g fullstendig rundt klart perlepolymerisat. Den midlere partikkeldiameteren lå ved ca. 30 pm (rørehastighet på 460 opm).

Produktet hadde et ristevolum på 1,55 ml/g. Det forsåpede produktet hadde et ristevolum på 1,54 ml/g, det svellet i vann til 5 mg/g.

20 g av det hydrolyserte perlekopolymerisatet fikk svelle i 200 ml epiklorhydrin i 24 timer ved romtemperatur. Deretter ble under langsom omrøring temperaturen hevet til 113 til 115° C og holdt der i 4 timer. Etter avkjøling ble det filtrert over en nutsj og kopolymerisatet ble utrørt flere ganger, hver gang 1 time i aceton. Det acetonfuktige kopolymerisatet ble tørket til konstant vekt i vakuumskap ved 50°C. Epoksydekvivalenten utgjorde 244 (målt ifølge Axen: Acta Chem. Scand. B 29 (1975) nr. 4).

Eksempel 3

Til 100 mg av en ifølge eksempel 2 fremstilt bærer ble det tilsatt 500 jjI av en DAO-holdig oppløsning (20 enheter/ml). For innstilling av enzymoppløsningen på pH 7,8 ble det tilsatt 1-molar kaliumfosfatbuffer. Varigheten av fikser-ingen av enzymet for bæreren utgjorde 72 timer ved 25°C. Deretter ble det ikke kovalent til bæreren bundede DAO suget bort over en glassfritte, og resten ble utvasket flere ganger med 1-molar natriumkloridoppløsning, deretter med bufferopp-løsning. Utbytte av nutsjfuktig materiale lå på 324 mg. Aktiviteten ble bestemt som angitt i eksempel 1 og ga en verdi på 18 enheter/g i fuktig tilstand.

Eksempel 4

Cellene av Trigonopsis variabilis CBS 4095 ble dyrket ved betingelsene angitt i eksempel 1 og permeabilisert ved innfrysing og opptining. Deretter ble 1 g fuktig cellemasse blandet med 10 ml av en 1% vandig chitosanoppløsning og immobilisert ved at blandingen dråpvis ble tilsatt i en 2% vandig natriumtripolyfosfatoppløsning (pH 8,0; 25°C). Man oppnår en DAO-aktivitet på 2,5 enheter/g fuktig katalysator-masse.

Eksempel 5

A. Enzymatisk omsetning i en reaksjonsbeholder

DAO immobiliseres som beskrevet i eksempel 3 og inkuberes i en 1,5 1 glassbeholder med rører og dobbeltmantel med cefalosporin C. Det ble anvendt følgende reaksjonsparametre: Etter 110 min. var 85% av det anvendte cefalosporin C omsatt. Reaksjonsoppløsningen ble fraskilt fra det immobiliserte DAO og enzymet ble forsynt med frisk substratoppløsning. Etter 32 timer var omsetningen falt til mindre enn 50%.

B. Enzymatisk omsetning i to etter hverandre koblede

reaksjonsbeholdere

DAO immobiliseres som beskrevet i eksempel 3 og fylles i to 1 1 glassbeholdere med dobbeltmantel og rører. Cefalosporin-oppløsningen ble kontinuerlig pumpet inn i den første reaksjonsbeholderen og derfra ført inn i den andre reaksjonsbeholderen. Det ble anvendt følgende reaksjonsparametre:

Etter 100 min. var 85% av det anvendte cefalosporin C omsatt. En utbytting av katalysatoren var først nødvendig etter 48 timer, fordi det da ble omsatt mindre enn 85% av det anvendte cefalosporinet.

Tabell 1 viser sammenligningen av fremgangsmåten A med fremgangsmåte B ifølge oppfinnelsen.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for omsetning av cefalosporinderivater med en D-5-amino-5-karboksypentanamidgruppe ved posisjon 7 av cefalosporinringen, til tilsvarende glutaryl-7-aminocefalo-sporansyrederivater, karakterisert ved at reaksjonsoppløsningen føres gjennom en rørekjelekaskade og at reaksjonen gjennomføres kontinuerlig i nærvær av D-aminosyre-oksydase (E.C.1.4.3.3.)-holdig katalysator som eventuelt er immobilisert med polysakkarider og at det eventuelt deretter kontinuerlig tilsettes hydrogenperoksyd.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes D-aminosyreoksydase fra sopper.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at D-aminosyreoksydasen immobiliseres med alginat, carrageenan eller chitosan.

4 . Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det anvendes en enzymbærer av et kopolymerisat av polyvinylester og poly-vinylalkohol eller av glycidylmetakrylat, allylglycidyleter-metylacrylamid og metylenbismetacrylamid.

5. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det anvendes celler inneholdende aktivert eller permeabilisert D-aminosyre-oksydase .