KR900002839B1 - 담체 매트릭스에서 세포 및 효소를 고정시키는 조성물 및 방법 - Google Patents

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Description

담체 매트릭스에서 세포 및 효소를 고정시키는 조성물 및 방법

제 1 도는 컬럼 반응기 장치에서의 PEI-알긴산-효모 비드의 작용

본 발명은 균일하게 분산되고 결합된 음이온 다당류 중합체 및 양이온 중합체를 함유하는 겔에서 매트릭스(matrix) 구조를 형성하여 미생물, 촉매물 및 효소를 고정시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 알긴산(alginate), 폴리에틸렌이민, 및 효모의 음이온 형태를 수성계에 균일하게 분산시킨 후 오일상과 혼합하여 비드(beads)를 형성시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

최근의 관심은 고정된 세포에서 "생기촉매물"시스템을 사용하여 생물전환 방법의 생산성을 향상시키는데 집중되고 있다. 본 출원의 전문에서 용어 "생기촉매물"은 거시적 담체를 통해 고정된 효소 또는 전체 세포 미생물을 포함하는 생물 시스템을 의미한다. 여기에서 사용된 용어 "생기촉매실체(biocatalytic entity)"는 생기촉매물에 혼입되어야 하는 효소 또는 전체 세포 미생물을 가리킨다. 세포 고정의 높은 가격, 한정된 세포 생명, 촉매 활성의 상실 및 고정 세포의 생물학적 성질의 변화가 제안된 생기촉매물 계의 광범위한 상업적 사용을 지연시키는 주요인이었다.

현재 세포를 고정시키는 기술에는 2가지가 있다. 한가지 기술은 고체 지지물의 사용을 포함하고 있다. 통상 세포는 고체 지지물의 표면에 배양 또는 부착한다. 나무조각, 다공성 연와, 라싱 환(Rasching rings), PVC박편, 유리섬유, 다공성 유리, 및 점토가 에탄올 생산시 표면 배양키 위해 사용된다. 고체 지지물의 사용은 세포 세척문제, 한정된 세포 증량 능력, 및 육즙에서의 유리 세포 고생산률에 의해 제한되고 있다.

세포 고정을 위한 다른 기술은 통상 비드 또는 결정소구 형태의 겔 매트릭스내에서 세포를 고정시키는 것이다. 비드 또는 결정소구는 분산된 상태에서 배지에 커다란 표면적을 제공하며 영양소 및 반응 생성물을 작은 단면적의 안 또는 밖으로 확산시킨다.

통상 피낭(encapsulation) 시스템은 폴리아크릴아마이드 겔을 사용한다. 폴리아크릴아마이드로 만들어진 겔의 유용함은 단량체 물질의 독성 및 겔의 연질에 의해 제한된다. 해양 식물로부터 유래한 하이드로겔(hydrogel)은 생세포 담체로서 더욱 바람직하게 여겨진다. 하이드로겔의 불활성, 고도의 수분 함유 능력, 투과성, 형성의 용이성 및 풍부함은 생물전환 방법에서 세포를 고정시키는데 요구되는 특성들이다. 광범위하게 연구되온 하이드로겔의 실례는 알긴산, 카라게난(carrageenan), 및 한천이다.

하이드로겔을 사용하는 겔 비드 형성의 전형적인 실례는 50℃에서 하이드로겔 용액에 효모 슬러리의 분취량을 혼합하는 것이다. 이어서 용액을 하이드로겔과 반응하여 하이드로겔을 비드 모양의 구조로 교질화시키는 냉각된 유기용매에 적하한다. [참조 : K. Toda and M. shoda, Biotechnology and Bioengineering, Vol.17, p.481(1975)].

엠.와다(M. Wada), 제이.카토(J. Kato), 및 아이. 키바타(I. Chibata)는 하기 참조 문헌에 효모 세포를 함유하는 2% 카라게난 용액을 환경 기온에서 2% 염화 칼륨 용액에 적하하므로써 효모 세포를 함유하는 비드를 제조한다고 기록하고 있다 [참조 : "A New Immobilization of Mictobial Cells", European Journal of Applied Microbiology, Biotechnology, Vol.8, pp. 241-247(1979)]. 유사하게, 티.시오타니(T. Shiotani) 및 티.야만(T. Yamane)은 하기 참조문헌에 염화 칼슘 용액에 적하된 알긴산 혼합물로 부터 효모-알긴산 비드를 제조한다고 기록하고 있다[참조 : "A Horizontal Packed Bed Bioreactor to Reduce Co₂Gas Holdup in the Continuous Production of Ethanol by Immobilized Yeast Cells", Eutopean Journal of Applied Microbiology, Biotechnology, Vol.13(2), pp. 96-101(1981)].

아이.벨리키(I. Veliky)및 알.윌리암즈(R. Williams)는 하기 참조 문헌에 알긴산 칼슘 매트릭스에서 미생물의 성공적인 고정은 고정후 폴리에틸렌이민(이후 PEI로 호칭함)으로 또한 표면 처리된다고 기록하고 있다 ["The Production of Ethanol by Saccharomyces Ceevisiae Immobilized in Polycation-Stabilized Calcium Alginate Gels", Biotech. Lett., Vol.3, pp.275-280-(1981)].

란테로(Lantero)는 하기 참조 특허에서 미생물의 전체 세포를 함유하는 수성 배지를 제공하는 배지에 글루타르알데하이드를 가하여 미생물의 반응 생성물을 형성 시킴으로써 세포를 고정할 수 있다고 기술하고 있다(참조:미합중국 특허 제4,355,105호, "Glutaraldehyde/Polyethyleneimine Immobilization of Whole Microbial Cells"). 그후 PEI를 수성 배지에 가하여 반응 생성물을 응결시킨다. 반응 생성물은 또한 입자 또는 기타 형태로 공정할 수 있는 케이크 또는 결정소구로서 수성 배지로 부터 회수한다.

보르글럼(Borglum)은 하기 참조 특허에서 미생물을 갑파-카라게난의 수용액과 혼합시켜 미생물을 고정시키는 방법에 대해 기술하고 있다(미합중국 특허 제 4,347,320호, "Immobilization of Microorgani는 in Gelled Carrageenan").

미생물 및 갑파-카라게난을 노즐을 통해 물방울로 만들고 이 물방울을 PEI를 함유한 교질화제의 수용액과 접촉시켜 교질화한다. 생성된 비드는 PEI 표피를 갖는다.

수하일라(Suhaila) 및 살레(Salleh)는 하기 참조문헌에서 젤라틴-프로필렌 글리콜 알긴산 겔(이후 프로필렌 글로콜 알긴산은 PGA로 호칭함)과 비교한 PEI-프로필렌 글리콜 알긴산 겔의 특성을 토로하고 있다["Physical Properties of Polyethyleneimine-Alginate Gels", Biotechnology Letters. Vol.4, No.9, pp.66-614(1982)].

그들은 PEI-PGA 겔이 젤라틴-PGA 겔보다 훨씬 연질이나 산성 조건에서는 상당한 정도로 그들의 순도를 유지하고 열 및 빙결에 안정하다는 것을 발견하였다. 한편 그들은 매트릭스를 형성시키기 위하여 균일하게 분산 및 결합된 음이온 다당류 및 양이온 중합체에 노출시키지 않고, 연질 PEI-PGA 구조의 고유한 특정 제한내에서 효소 세포를 고정시키는데 PEI-PGA 겔이 유용하다고 제안했다.

하기 참조 문헌은 매사추세츠 기술원(Massachusetts Institute of Technology)의 조균 라(chokyun Rha)가 키토산(용해된 탈아세틸화 키틴) 및 알긴산을 사용하여 조절된 다공성의 크기 10μ 내지 5mm 원형구를 제조했다고 보고하고 있다("Crab chitosan Microbeads Entrop Cells in One Step, Chollenge Damon, Encapcal", Newswathc P.3, March 17, 1984). 그 문헌은 또 세포 또는 효소는 양이온 키토산용액에 현탁된다고 수록한다. 세포-키톤산 혼합물을 알긴산 또는 다른 중합체의 음이온 용액에 점적하여 일단의 액체 키토산-세포 혼합물을 피낭하는 막을 형성시킨다. 막은 2가 이온의 교차-결합 또는 부가적인 중합체충에 의해 강화될 수 있다. 캡슐은 2,000-G의 힘에 견딜 수 있으며 파열없이 90%까지 변형될 수 있다.

우리가 아는 한 이들 제안은 충분한 강도 및 탄성을 가진 반면 세포 생존을 유지할 수 있는 비드를 사용하는 생기촉매물 시스템으로 유도하지 못한다. 글루타르알데하이드 및 PEI와 같은 물질을 생기촉매물 겔매트릭스 시스템에서 널리 사용되지 않고 있다. 일반적으로 용액중의 PEI 및 글루타르알데하이드는 매트릭스로 혼입되기 위한 그들의 용도를 크게 제한하는 살진균 및 살균 활성을 갖는다. 특히 PEI는 용액중에서 이온성이며 세포 용해를 유발할 수 있다. 따라서, 혹자는 매트릭스 계내의 PEI의 균질한 혼입이 촉매 활성을 갖는 생세포 계를 유발시킨다고 예견하지 못한다.

과거 PEI는 방울에 고체성을 부여하기 위해 1차적으로 사용되었다. PEI는 비드 구조에 피복 또는 표피로서 응용되어 PEI의 독성 효과가 생기촉매물에 손상을 주지 않았다. 굳거나 단단한 비드는 컬럼에 채워넣기에 아주 적합한 것으로 생각되었다. 그러나 굳거나 단단한 비드는 세포 성장을 수용할 수 없고 가스상의 물질대사 부산물을 분기할 수 없다. 장시간의 발효 공정에서, 고체 비드 구조는 겔 매트릭스로 부터 생기촉매물을 파열하고 방출한다.

선행 기술은 예정된 상당히 균일한 크기의 비드를 수득하기 위한 실질적인 방법을 제안하지 못한다. 비드 크기는 생기촉매시스템에서 중대한 사항이다. 대형 비드의 내부에 혼입된 세포는 매트릭스 구조를 통하여 필요한 영양분을 얻을 수 없기 때문에 증식 또는 발효공정에 기여할 수 없다. 단지 겔 매트릭스의 표면까지 이 혼입된 세포만이 증식하여 활성적으로 발효 공정에 기여한다.

교차-결합 구조의 형성을 위해 칼슘을 사용한 하이드로겔로 구성된 겔 매트릭스는 결국 용해하여 생기촉매물을 용출시킨다. 미생물은 통상 그자체의 목적을 위하여 매트릭스 구조내에서 칼슘을 사용하고, 칼슘은 수성 배지내에 비드 성분의 용해로 인해 진행중인 용출의 일부로서 매트릭스로부터 용출된다.

대규모로 계속적인 생물전환 공정을 가능케하는 진보된 생기촉매물 시스템을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

본 발명의 목적, 특징, 및 잇점은 하기의 본 발명을 예시하는 바람직한 태양의 좀더 상세한 설명으로부터 당분야의 숙련가에게 명백해질 것이다.

간단하게, 본 발명의 태양은 음이온 다당류 중합체 및 양이온 중합체의 균질한 혼합물의 반응 생성물내에 생기촉매물 실체를 분산시킴을 특징으로 하는 생기촉매물 시스템을 포함한다.

바람직한 양이온 중합체는 폴리알켄 아민 또는 이민 및, 특히 PEI이다. 기타 양이온 중합체는 제한 없이 실시예를 통하여. 폴리에피할로하이드린아민 및 이민, 폴리프로필렌 아민 및 이민, 폴리리신, 다양이온성 폴리펩타이드 등이다. 놀랍고도 예기치 않게, 통상 진균 및 세균에 독성이 있는 PEI와 같은 양이온 중합체는 알긴산 나트륨과 같은 음이온 다당류 중합체와 균일하게 분산된 경우 중화되어 효모에 대해 무독하게된다. 알긴 산염-PEI 매트릭스내에 혼입된 효모는 생존 생태이다. 또한 PEI 알긴산염 매트릭스 내로 혼입된 PEI는 감염의 가능성을 감소시켜 반응기의 무균 상태에 기여한다.

바람직한 음이온 다당류 중합체는 알긴산 나트륨, 알긴산 칼륨, 및 알긴산 암모늄과 같은 알긴산의 알칼리 금속염 또는 암모늄염이다. 그밖의 음이온 다당류 중합체는 갑파-카라게난, 한천 카복시메틸셀룰로오스 및 통상 설폰 또는 카복실 그룹을 함유하는 다당류이다.

바람직한 태양은 효모 형태의 생기촉매 실체를 포함한다. 기타 생기촉매 실체는 제한없이 실시예를 통하여, 곰팡이 및 조류를 포함한다. 본 발명은 사카로마이세스 세리비지에(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 후라길리스(Kluyveromyces fragilis), 칸디다 우틸리스(Candida utilis), 사카로마이콥시스리폴리티카(Saccharomycopsis lipolytica), 에레모테시움 아시비(Eremothecium ashbyi)등을 포함한 효모에게 있어 특별히 상업적 중요성을 갖고 있다. 관심이 있는 곰팡이는 페니실리움 로퀘훠티(Pennicillium roguefortii), 페니실리움 카멤버티(Pennicillium camembertii), 페니실리움 크리소게눔(Pennicillium chrysogenum), 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger), 리조푸스 니그리칸스(Rhizopus nigricans), 뮤코(Mucor), 모나스커스 퍼퍼레(Monascus purpurea), 트리코티마레시(Trichoderma reesii), 엔도티아 파라시티카(Endothia parasitica), 세팔로-스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium), 블라케스레아 트리스포라(Blakeslea trispora)등이다.

또한 본 발명의 태양은 음이온 다당류 중합체 및 양이온 중합체의 균질한 혼합물의 반응 생성물 생기촉매 실체의 혼합물을 제공하여 중합체-생기촉매물 분산제를 형성시키는 단계를 포함하는 생기촉매 시스템을 만드는 방법을 포함한다. 이어서 중합체-생기촉매물 분산제를 오일상과 혼합시켜 비드를 형성한다. 바람직하게는, 중합체-생기촉매물 분산제를 불용성 계면활성제 및 수용성 계면활성제를 포함하는 계면활성제의 존재하에 오일상과 혼합한다. 계면활성제의 상대농도는 비드의 크기를 결정한다. 본 발명은 균일한 크기 및 형태의 비드를 제공한다.

비드를 수용성-오일 불용성 경화 분말에 가하여 교질화 및 탈수화시킨다. 바람직하게는, 분말은 다가 양이온의 염, 특히 염화 칼슘 또는 황산 알루미늄을 포함한다. 그러나 그룹 Ⅱ 또는 Ⅲ 금속의 다른 다가 양이온염도 미생물에 대한 그들의 잠재적 독성을 미리 고려하여 사용할 수 있다.

본 발명은 컬럼 반응기에서 계속적으로 에탄올 또는 유기산을 생산하는데 아주 적합하다. 에탄올을 생산키 위한 본 발명은 컬럼 반응기에서 글루코스 전환에 응용시 매시간 ℓ 당 86g(g/ℓ/h)의 생산비로 수득된다. 컬럼 반응기에서, 생성물의 에탄올 농도는 22℃에서 1회 통과후 5%이다. 본 발명은 통상적인 배취(batch) 발효조의 속도보다 80배 빠른 속도의 급속 에탄올 생산을 제공한다. 16.4%의 글로코스 공급은 거의 0.53h^-1의 속도에서 글루코스 공급에 의거한 47% 수율로 에탄올로 완전히 전환시킨다. 따라서 본 발명은 이론 수율의 92%로 에탄올을 생산시킨다.

PEI를 사용한 본 발명의 태양에서 무균조작의 유지가 PEI의 살균 작용에 의해 반응기 시스템을 멸균시키지 않고도 장기간 가능하다.

알긴산-PEI-효모 비드로 구성되는 본 발명의 태양은 알코올 발효조 숙성 환경에서의 강력한 가스 활동을 지탱할 수 있다. 이와는 대조적으로 PEI 없이 알긴산으로 만들어진 비드는 쉽게 파열, 변형 및 부분적으로 용해되어 생기촉매물을 방출한다.

대부부의 선행기술은 생기촉매 비드를 단단하고 강력하게 하는 방법을 제안하는 반면에 본 발명은 상당한 탄성을 갖는 비드를 포함한다. 놀랍고도 예기치 않게 매트릭스 구조를 통한 PEI의 혼입은 매트릭스내에 효모의 성장으로 인한 팽창을 수용할 수 있는 비드를 제공하고 물질 대사 가스의 분기를 허용한다. 과거 PEI는 경화제로서 사용되어 왔다. PEI를 혼입한 매트릭스는 과거 단단하나 부서지기 쉬운 것으로 기술되어 왔다.

본 발명은 개개의 비드 중량이 600% 및 직경이 약 90%증가시킬 수 있는 비드-모양 구조의 알긴산-PEI-효모 매트릭스를 포함한다. 본 발명의 담체 매트릭스는 에탄올 발효 공정시 통상 예상되는 인 및 고농도의 에탄올에 견딜 수 있다. 극심한 환경에서의 조작시, 본 발명에 따라 제조된 비드는 한달동안 사용할 수 있다. 선행 기술에서 흔히 사용되던 대부분의 칼슘-알긴산-효모 비드는 3 내지 5일후 용해 또는 파열된다.

본 발명에 따라 제조된 비드는 보통 선선한 온도에서 밀봉된 용기의 1% 염화칼슘 용액 또는 일반 저장수에 보관할 수 있다. PEI는 진균을 제외한 부패를 효과적으로 방지하다. 4℃에 보관할 경우 본 발명의 비드는 무한하게 보관될 것이다.

본 발명의 특징 및 잇점을 좀더 명확하게 설명하기 위하여 본 발명은 예시하는 실험 실시예를 하기에 정의하였다. 그러나 본 내용이 단지 실시예를 통하여 이루어질 뿐이고 본 발명의 영역을 서술하거나 첨부한 특허청구의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명은 본 발명이 또한 다른 생물 전환에 응용될 수 있다는 이해와 함께 에탄올 생성시의 생기촉매 시스템의 관점에서의 논의될 것이다.

[실시예 1]

하기 논의되는 PEI를 위스콘신(Wisconsin)주, 밀워키(Milwaukee) 소재의 알드리취 케미컬 컴퍼니(Aldrich Chemical Company)로 부터 수득하였다. 사용된 PEI는 몰당 평균 분자량이 50,000 내지 100,000g이었다. 하기 논의에 사용된 효모는 위스콘신주, 밀워키소재의 유니버설 푸드 코포레이션(Universal Food Corporation)으로 부터 수득한 탈수화 베이커(Baker's)효모였다. 알긴산 나트륨은 미조리(Missouri)주, 세인트 루이스(St.Louis) 소재의 시그마 케미컬 컴퍼니(Sigma Chemical Company)에서 수득한. 마크로시티스 피리페라(Macrocystis pyrifera), 타이프 IV로 부터 유래한 것이다. 계면활성제는 트리톤(Triton) GR-7M이란 상표명으로 시판되는 디옥틸 나트륨 설포 석시네이트, 및 스판(Span) 80이란 상표명으로 시판되는 소르비탄 모노올레이트를 포함한다. 해당 옥수수 기름을 식용이었다. 케로신(Kerosene)은 일리노이즈(Illinois)주, 레몬트(Lemont) 소재의 퀴맥스 인코포레이션(Quimasx, Inc)에 의해 표식 F-158301로 시판된다. 염화칼슘을 포함하여 모든 무기 물질은 분석용이었다.

탈수화 베이커 효모를 증류수로 재수화시켜 20% 효모 슬러리 150㎖로 만들고 사용전 4℃에서 1 내지 2 시간 유지한다. 2% 알긴산 나트륨 분산액을 위어링 혼합기(Waring Blender)에서 제조하고, 분산액의 PH를 7.0으로 조정한다. 이산화탄소 흡착에 의해 겔이 두꺼워지는 것을 방지하기 위해서 알긴산 분산액을 기밀 용기에 보관한다. 50% PEI 수용액의 분취량 0.3㎖를 위어링 혼합기에서 2% 알긴산 나트륨 분산액 150ml에 격렬하게 혼합시켜 균일하게 분산시킨다.

격렬한 혼합은 PEI에 유발된 지엽적인 알긴산 침전을 방지하기 위해 필요하다. PEI-알긴산 분산액은 약 0.1%의 PEI 농도를 갖는다. PEI-알긴산 분산액을 효모 현탁액과 합하고 추가의 물을 넣어 하기 조성의 효모-중합체 분산액 300㎖를 제조한다.

효모(건조중량) -30g

알긴산 나트륨 -3.0g

PEI -0.15g

물 -266.8g

알긴산, PEI, 및 효모를 혼합하는 순서가 중요하다. PEI는 통상 그의 전하성으로 인해 효모에 독성적이다. 효모와 합하기 전에 PEI를 알긴산과 혼합하여 PEI의 독성효과를 중성화한다.

2l둥근 플라스크, 및 반달형의 날과 여러가지 자동전환기가 장착된 상부(overhead) 혼합기를 포함한 일단계 조립 장치를 조립한다. 완만하게 교반하면서 옥수수 기름 400ml 및 케로신 200ml를 플라스크에 유입한다. 오일산 계면활성제 1 내지 15㎖를 플라스크에 유입하고 완만하게 교반하여 혼합한다. 효모-중합체 분산액 300ml를 플라스크내 오일상에 가한다. 연속 완만 교반과 함께 효모-중합체 분산액이 또한 오일상 내에서 분산되며 5 내지 10분후 효모-중합체 분산액이 미세한 비드-모양의 구를 형성한다.

미세한 염화 칼슘 분말을 준비하여 7 내지 50g을 조립 플라스크에 가한다. 비드가 완전히 교질화될 때까지 교반기하에 10 내지 20분 경화를 유지한다. 미세한 염화칼슘 분말은 매크릭스 교질화제, 접착방지제, 및 탈수화제로 행동한다. 염화 칼슘 분말이 염화칼슘 용액으로 대치되는 경우, 효모-중합체 분산액은 신속히 응결되어 두꺼운 점성 반죽을 형성하면서 용기의 바닥으로 가라앉는다. 칼슘 분말의 개개의 비드가 완전히 단단해질 때까지 서로 부착하는 것을 방지해 준다.

조립 배취에 가한 염화 칼슘 분말의 양은 생성된 비드의 탈수화 정도를 결정한다. 전체 교체가 알긴산 칼슘의 덩어리인 두개의 다른 비드 배취를 함유할 때 건조 효모를 각 배취에 가하고 일정하게 유지한다. 10g의 염화 칼슘은 약 150g의 비드를 산출하고, 반면에 염화 칼슘을 40g으로 중량하면 단지 90g의 비드가 수득된다.

교반을 정지하자마자 유동성 오일상으로부터 효모 비드 및 수용액이 분리된다. 비드를 수거해서 물로 세척한다. 염화 칼슘은 비드-제조 공정중에 용해된다. 벤토나이트 또는 활석 분말과 같은 불용성 부착 방지제는 비드를 오염시키고 비드 매트릭스내로 혼입될 것이다. 염화칼슘 분말로 제조된 비드는 매끄러운 구형이다.

황산 알루미늄이 교질화제, 부착 방지제 및 탈수화제로서 염화칼슘과 함께 또는 염화칼슘의 대응물로 사용될 수 있다. 그러나 황산 알루미늄의 사용은 덩어리지거나 조직적인 형태의 비드를 산출한다. 또한 수용성 및 오일 불용성인 그룹 Ⅱ 또는 그룹 Ⅲ 금속의 그밖의 다가 양이온이 사용될 수도 있다. 그러나 많은 종류가 독성적인 것으로 사료되고 비드내에 고정된 세포의 효능 또는 활성을 감소시킬 수 있다.

계면활성제는 생성된 비드의 크기를 결정하는데 결정적인 역할을 한다. 2가지 계면활성제, 디옥틸나트륨 설포석시네이트 및 소르비탄 모노올레이트를 다른 비율로 조합하거나 또는 분리 사용하여 아주 광범위한 비드의 크기, 20μ내지 1500μ을 수득할 수 있다. 따라서 오일상의 l당 디옥틸 나트륨 설포석시네이트 16g을 혼합하고 소르비탄 모노올레이트를 결핍시키면 직경 20μ의 비드를 생성한다. 오일상의 1당 소르비탄모노올레이트 1.0g을 사용하고 디옥틸나트륨 설포석시네이트를 결핍시키면 1500μ의 중앙비드 직경을 갖는 비드를 생성한다. 하기 표 1는 다양한 비드 크기를 위해 사용되는 계면활성제 제형을 정리하고 있다.

[표 1]

약 1g./오일상 1 농도의 나트륨 모노올레이트 및 10.0g의 염화 칼슘 존재하에 형성된 PEI-알긴산-효모비드의 스크린 분석은 하기표 2에 정리된 바와 같이 좁은 범위의 비드 크기를 나타낸다.

[표 2]

비드 147.0g의 수득량이 효모-중합체 혼합물 300ml로 부터 수득되었다.

PEI의 존재하에서 효모-알긴산 분산액은 비드 형성 공정중에 부착으로 인해 조절하기가 매우 어렵다는 것을 명심해야 한다. 생성된 비드-모양의 구조는 불규칙하거나 섬유상이고 또는 부착하여 덩어리진다. 칼슘-알긴산 매트릭스의 스크린 분석(PEI의 존재하에)은 하기표 Ⅲ에 정리된 바와 같이 광범위한 비드 크기를 나타낸다.

[표 3]

PEI변형 중합체-효모 조성물에서 형성된 비드의 92%가 0.7 내지 1.7mm의 좁은 범위내인 반면, PEI로 변형되지 않은 알긴산-효모 조성물은 0.3 이하에서 0.7mm 이상에 이르는 광범위한 분산을 갖고 있다.

1500μ보다 큰 비드는 교질화 고정중 PEI, 알긴산, 및 효모 분산액의 pH를 조정함으로써 제조한다. 크기가 직경 0.5 내지 3.0mm 범위의 대형 비드의 경우, PEI, 알긴산, 및 효모 혼합물의 pH를 7.5 내지 8.0 및 그 이상으로 유지하여 양이온에 의한 시기 상조의 교질화를 방지한다. 겔 형성은 오일상에 PEI, 알긴산, 및 효모 분산액을 혼합하고 완만한 교반하에, 오일상 분산액의 pH를 약 6으로 하향조정함으로써 개시된다.

장시간 동안 pH가 상승 유지되지 않도록 주의를 기울여야 한다. 통상 효모 및 기타 미생물은 pH가 8이상으로 상승 또는 6 이하로 감소된 상태에 장시간 노출되면 생존하지 못한다.

계면활성제는 비드 크기 증가시 비드 형성 조절에 작은 역할을 담당한다. 따라서, 직경 0.5mm의 비드는 유일한 계면활성제, 소르비탄 모노올레이트의 농도가 오일상의 1당 17g인 경우 형성되고 1.5mm의 비드는 유일한 계면활성제 소르비탄 모노올레이트의 농도가 1당 1.0g인 경우에 형성된, 직경 2.0mm 비드의 경우, 계면활성제 소르비탄 모노올레이트는 단지 미량으로 존재하며 3.0mm의 경우 거의 부재한다. 다른 계면활성제가 소르비탄 모노올레이트 및 디옥틸 설포석시네이트 대신에 대체될 수 있다는 것을 당분야 숙련가들은 인지할 것이다.

[실시예 Ⅱ]

알긴산, PEI, 및 효모의 본 비드 조성물은 격렬한 가스 활동, 고 알코올농도, 및 숙성 효소가 있는 거친 조건에 견딜 수 있다. 비드는 팽창하여 효모의 성장을 허용하고 내부에서 발생한 이산화탄소를 내부 손상없이 효과적으로 비드의 외부로 전달하였다.

따라서 0.0087in²의 평균 단면적을 갖는, PEI 및 100(pph) PEI당 10 부 알긴산의 필름은 평방 인치당104.3파운드(psi)의 평균 장력 강도 및 98.0%의 평균 최대 신장률을 갖는다. 2배 두께인 0.0177in²의 알긴산 칼슘 겔 필름은 단지 83.7 psi의 평균 장력 강도 및 79.3%의 평균 최대 신장률을 나타낼 뿐이다.

10pph의 PEI 및 0.01in²의 평균 단면적을 갖는, 효모와 혼합된 PEI-알긴산-효모세포 필름은 17.6psi의 평균 장력 강도 및 55.3%의 평균 최대 신장률을 갖는다. 대조적으로 거의 3배 두께인 약 0.032in²의 효모-칼슘-알긴산 겔 필름은 단디 10.4psi의 평균 장력 강도 및 59.7%의 평균 최대 신장률을 나타낸다.

발효후, PEI-알긴산-효모 겔 필름은 계속해서 놀랍고도 예기치 않은 강도 및 탄성을 보인다. 0.04in²의 평균 두께를 갖는 발효후의 PEI-알긴산-효모 필름은 약 6.2%의 평균 장력 강도 및 24%의 평균 최대 신장률을 나타낸다. 이와 비교해서 더 두꺼운 평균 0.064in²를 갖는 발효후의 효모-칼슘 알긴산 겔 필름은 약 3.9psi의 평균 장력 강도 및 단지 22.3%의 최대 신장률을 갖는다.

비멸균 조건임에도 불구하고 PEI는 세균 성장을 억제하는데 효과적이다. 따라서 10pph PEI의 존재하에 젤라틴, 한천 또는 알긴산에서 고정된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)세포가 광물 및 영양소를 함유한 pH 7 및 9의 0.1몰 글리신 완충액에서 35℃로 10일간 배양시킨 경우 전혀 성장하지 못하였다. 대조적으로 PEI 부재의 동일한 담체 물질은 모두 에스케리치아 콜라이의 풍부한 성장을 보였다.

[실시예 Ⅲ]

본 발명은 비드는 배취 발효공정 또는 밀봉 컬럼내에서의 에탄올 발효에 아주 적합하다. 하기 논의에서 효모 발효용 배지는 미조리(Missouri)주, 세인트 루이스(St. Louis)소재의 시그마 케미컬 컴퍼니(Sigma Chemical Co,pany) 제품인 베타-D-글루코스 약 5%를함유하는 옥수수 가수분해물로부터 유래한 알파-D-글루코스를 포함한다. YM 육즙은 미시간(Michigan)주, 디트로이트(Detroit)소재의 디프코 래브러토리스(Difco Laboratories)의 제품이다. 비타민 및 효모 추출물은 시그마 케미칼 컴퍼니 제품이고, 모든 무기 화학 제품은 분석용이다.

다른 제형을 갖는 글루코스 배지를 제조하여 50ml 분취량으로 발효 플라스크에 옮긴다. 각 배지는 글루코스 13%를 함유한다. 일반 저장수 배지로서 하기에 동정되는 제 1배지는 일반 저장수에 단지 13%의 글루코스만을 함유한다. 유기 배지로 동정되는 제 2.13% 글루코스 배지 제형은 또한 YM 육즙 2%, 효모추출물 0.3%, (NH₄)₂SO₄1g/ℓ, KH₂PO₄0.2g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 1.2g/ℓ, 및 CaCl₂·2H₂O 0.74g/ℓ를 함유한다. N-배지로 하기에 동정되는 제3배지는 글루코스 13%에 더하여 단지 MgSO₄·7H₂O 1.2g/ℓ, KH₂PO₄0.2g/ℓ, 및 CaCl₂·2H₂O 0.74g/ℓ성분만을 함유하는 질소가 결핍된 것이다. PK-배지로 하기에 동정되는 제 4 배지는 글로코스 13%외에(NH₄)₂SO₄1g/ℓ 및 MgSO₄·7H₂O 1.2g/ℓ를 함유한다. Mg-배지로 하기에 동정되는 제5배지는 글루코스 13%외에 단지 KH₂PO₄0.2g/ℓ, (NH₄)₂SO₄1g/ℓ, 및 CaCl₂·2H₂O 0.74g/ℓ만을 함유하는 마그네슘이 결핍된 것이다.

플라스크를 솜 뭉치로 막고 121℃에서 15분간 가압멸균시킨다. 플라스크에 비드 5g을 주입하고 "A"로 표지 또는 비드 1.3g을 주입하고 "B"로 표지한다. 뉴우 브런스위크(New Brunswick) G10 회전 진탕기에서 150rpm으로 발효를 수행한다. 발효 온도는 25℃ 또는 30℃이다. 육즙 표본을 무균실에서 수득하여 0.33N 과염소산의 4부피로 급냉시키고 -20℃에서 분석이 시행될 때까지 완전 밀봉 용기에 보관한다. 시그마 컴퍼니의 글루코스 분석 바이알(vial), 15-10을 사용하여 글루코스를 효소학적으로 분석한다. NADPH의 형성은 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)람다 5정밀 분광광도계를 사용, 340nm에서 흡광도를 측정하여 검출한다. 에탄올은 알코올 탈수소화제를 사용하여 검사한다.

NADH의 형성은 시그마 케미컬 컴퍼니에 에탄올 검사 바이알, 번호 330-5, 및 글리신 완충 시약, 번호 332-9를 사용하여 흡광도적으로 검출한다.

플라스크 배취 발효의 결과가 하기 표에 정리되어 있다.

[표 4]

일련의 배취 발효는 고정된 비드가 필수 영양소의 존재에 구애됨 없이 글로코스를 에탄올로 전환시키는데 활성적임을 가리킨다. 대량의 비드가 사용된 경우, 모든 발효 플라스크는 배지에 관계없이 고농도의 에탄올을 함유하였다. 비드가 1/4로 감소된 경우, 완전한 유기 배지만이 대조군과 비교해서 동일량의 에탄올로 생산할 수 있었다. 3일간의 장기 배양에서는 에탄올의 고수율을 위해 완전한 영양소 제형이 필요하다 ; 그러나 완전한 영양소 제형은 비드 매트릭스내에 효모를 과다 성장시켜 전반적인 에탄올 수율에 해롭게 된다.

[실시예 Ⅳ]

밀폐 컬럼 장치에서 연속 에탄올 발효를 수행한다. 약 면적 26mm×40cm의 유리 발효 컬럼에 직경 0.7 내지 1.7mm의 PEI-알긴산-효모 비드 약 60g으로 3-쿼터를 채워 촉매 베드(bed)를 형성한다. 비드는 지지 스크린에 대해 상층으로 부유하여 발효 육즙 및 발효 가스를 발효 컬럼의 정상에 위치한 유리 액체 분리기에서 분리되도록 한다. 멸균 배지는 연동 공급 펌프를 통하여 저장소로부터 컬럼의 바닥에 상향적으로 연속 공급한다. 공기는 공기 주입 펌프를 통하여 표준 온도 및 압력에서 400㎖/시간의 연속 비율로 배지상에 주입한다. 집수 펌프(sump pump)를 사용하여 발효 육즙을 연속적으로 생성물 저장소에 배수한다. 배지 저장소, 공기 주입 펌프 유입구, 컬럼 가스 유출구, 및 생성물 저장소는 세균 필터로 세균 침입을 방지하나 컬럼 및 촉매 비드는 멸균하지 않는다. 액체 높이는 촉매 비드위로 약 2cm를 유지한다.

비드는 발효 배지를 50m/ℓ/시간의 속도로 유출시킴으로써 1 내지 2일간 활성적이다. 발효 배지는 하기 표 5에 정리되어 있다.

[표 5]

비드가 활성화되면, 비드의 크기는 중량이 2내지 3배로 증가하고, 비드의 밀도는 비드 내부의 격렬한 CO₂발생으로 인하여 감소한다. 완전히 활성화된 비드는 컬럼의 상부에 잘-발달된 가스통로를 갖춘 밀집된 베드를 형성한다. 비드 밀집 밀도는 베드 용적 ㎤당 0.45 내지 0.55g의 범위이다. 베드 용적은 초기 급속 신장후 활성화 기간동안 일정하게 유지된다. 활성화 이후, 배지의 유속을 조절하고 유출 육즙에서 일정한 에탄올농도가 수득되어 샘플을 취할때까지 컬럼을 평형화한다. 다른 유속으로 샘플을 취하고, 발효조를 20℃의 등온 조건하에 조작한다. 발효육즙 샘플을 0.33N 과염소산으로 냉각하고 상술한 바와 같이 증발시킨다.

컬럼 반응장치에서 PEI-알긴산-효모 비드의 작용은 제 1 도에 정리되어 있다. 원형점은 매시간 ℓ당 에탄올의 g생성량을 나타낸다. 사각형점은 발효배지 백분률로서의 에탄올 농도를 가르친다. 삼각형으로 둘러싸인 점은 발효배지 백분률로서의 잔여 당농도를 나타낸다.

개방형(백색)은 본 발명 PEI-알긴산-효모 비드의 사용을 가리킨다. 고체 폐쇄형(흑색)은 칼슘-알긴산-효모 비드의 사용을 나타낸다.

도표에 서술된 자료는 발효육즙의 분석을 근거로 한 것이다. 가스상으로의 에탄올 유실에 대한 회수는 이루어지지 않았다. 84g/ℓ/시간의 최대 생산량이 1.68시간^-1의 유속에서 50g/ℓ로 수득되었다. 가스상으로의 에탄올 유실을 회수할 경우, 실질적인 생산량은 촉매베드 용적에 근거하여 86gℓ/시간 만큼 높아질 것이다. 반응기를 통하여 1회 통과로 수득된 최고 에탄올 농도는 유속 0.53시간^-1에서 74g/ℓ였다. 가스상 회수로, 74g/ℓ의 값은 글루코스 공급에 근거하여 47% 만큼 높은 에탄올 수율의, 7.7% 에탄올 농도에 동등한 것이다.

따라서, 베드 용적당 86g/ℓ/시간의 생산량을 수득하는 본 PEI-알긴산-효모 비드는 선행 출원에서 티.시오타니(T.Shiotani) 및 티.야맨(T.Yamane)에 의해 청구된, 효모를 고정시키기 위해 알긴산 칼슘을 사용한 46g/ℓ/시간의 선행기술 생산량과는 좋은 대조가 되고 있다. 본 발명의 우월성은 비드의 균일성 및 발효공정중 그들의 구조를 유지하는 비드의 능력에 기인한다. 따라서, 본 PEI-알긴산-효모 담체 매트릭스는 커다란 촉매 효력 및 안정성, 기계적 강도 및 탄성, 비드에서의 증강된 효모세포 고정력, 및 증가된 에탄올 수율을 제공한다.

매트릭스를 형성하는 알긴산-PEI 반응은 효모에 대한 PEI의 독성 효과를 중화시켜 칼슘-알긴산 매트릭스와는 대조적으로 PEI-알긴산 매트릭스에서 에탄올 생산성의 유해 효과가 없다. 사실, 알긴산 매트릭스 내로 PEI의 혼입은 에탄올 수율을 증가시킨다. 에탄올 수율상의 10% 증가가, 표 6에 정리한 바와같이 10pph PEI가 알긴산 매트릭스에 혼입되었을 때 진탕 플라스크 발효공정에서 관찰된다.

[표 6]

게다가, 알긴산 칼슘 자체는 격렬한 이산화탄소발생, 세포 증식, 및 고속 에탄올 발효중의 수성환경으로 유발된 응력(stresses)을 견딜 수 없다. 변형되지 않은 칼슘-알긴산 비드는 세포의 손실 및 용해 매트릭스로 인해 파열되고 심하게 응고수축된다. 변형되지 않은 칼슘-알간산 비드는 4일간의 시도에서 70%정도 베드응축을 초래하였고, 반면에 본 발명의 PEI변형 알긴산 비드는 탄력적인 팽창으로 세포성장을 가능하게 하고 거친 발효환경을 견딜 수 있어 초기비드의 중량이 2 내지 3배로 급속 성장한 후 항구적인 베드 용적을 유지한다. PEI변형 알긴산-효모 비드에서 유리세포 유출은 전형적인 유리 세포 연속 발효의 세포 유출량의 약 1/15인, 건조중량 1g/ℓ(또는 4×10⁷개/cc)미만이다.

비-멸균 시스템에도 불구하고, 연속 발효공정은 어느 환경에서도 세균 증식을 일으키지 않는다. 이것은 낮은 pH 발효조건 및 PEI의 제균 효과로 기인한다. PEI는 특정 세균의 용해를 유발시켜 무균 발효공정의 유지를 크게 돕는다.

본 PEI변형 알긴산-효모 비드는 알코올 발효조의 숙성 환경에서 격렬한 가스 활동에 견딜 수 있다. PEI 변형 알긴산 비드는 유기산 생산을 포함한 생물전환 산업에서 광범위한 용도의 잠재성을 가지고 있다. 본 발명의 활용은 향상된 수율뿐만 아니라 자본 및 운영 비용상 상당한 절감을 초래할 수 있다.

따라서 바람직한 태양이 설명 및 서술되는 동안, 본 발명이 변화 및 변형될 수 있음이 이해되었고, 그러므로, 상기 정리된 실시사항에 한정되지 않으며 첨부된 특허 청구의 범위 내에서 그와 같은 변화 및 변형을 포함하여야 한다.

Claims (19)

1. 생기촉매 실체(biocatalytic-entity)를, 양이온 중합체와 음이온 다당류 중합체의 균일 분산액의 반응 생성물과 혼합하여 중합체-생기촉매 분산액을 형성하고 ; 상기 중합체 생기촉매 분산액을 오일상과 혼합하여 비드(bead)를 형성시키는 단계로 이루어짐을 특징으로 하여, 생기촉매 시스템을 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 또한 분말을 비드에 가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 분말이 다가 양이온을 갖는 수용성 및 오일 불용성 염을 포함하는 방법
4. 제 2 항에 있어서, 상기 분말을 염화칼슘 및 황산알루미늄을 포함하는 분말 그룹으로부터 선택하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 음이온 다당류 중합체가 알긴산염(alginate)의 음이온 형태인 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온 중합체를 폴리알칸 아민 및 아민을 포함하는 그룹으로부터 선택하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 양이온 중합체가 폴리에틸렌이민인 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 생기촉매 실체가 효모인 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 중합체가 생기촉매 분산액을 오일상과 혼합하는 단계를 계면활성제의 존재하에서 실시하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 중합체가 생기촉매 분산액을 pH를 조성함으로써 비드로 교질화시키는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 중합체 생기촉매 분산액의 pH가 약 7.5이상이고, 오일상과 혼합한 후 약 6으로 낮추는 방법.
12. 제 9 항에 있어서, 상기 계면활성제 및 수불용성 계면활성제 및 수용성 계면활성제를 포함하는 그룹으로부터 선택하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 수불용성 계면활성제 및 수용성 계면활성제의 상대적인 양을 다양화하여 비드의 크기를 조절하는 방법.
14. 발효가능기질을 제 1 항의 방법에 의해 제조된 생기촉매 고정화 실체와 접촉시키고, 그로부터 에탄올을 회수하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법.
15. 생기촉매 실체를 양이온 중합체와 음이온 다당류 중합체의 균일한 분산액의 반응생성물과 혼합하여 교질화된 매트릭스(matrix)를 형성시킨것임을 특징으로 하는 생기촉매시스템.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 교질화된 매트릭스가 비드의 형태의 생기촉매 시스템.
17. 제 15 항에 있어서, 상기 음이온 다당류가 알긴산염의 음이온 형태의 생기촉매 시스템.
18. 제 15 항에 있어서, 상기 양이온 중합체가 폴리에틸렌이민인 생기촉매 시스템.
19. 제 15 항에 있어서, 상기 생기촉매 실체가 효모인 생기촉매 시스템.