KR100837375B1 - 효소가 고정화된 실리카의 제조방법 - Google Patents

효소가 고정화된 실리카의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양이온 계면활성제를 이용한 효소가 고정화된 실리카의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 소수성의 실리케이트 전구체를 가수분해하여 얻어진 실리카 졸의 음(-)이온과 화학적으로 결합할 수 있는 양(+)이온을 가지는 양이온성 계면활성제를 첨가반응시킴으로써 효소를 고수율로 고정시킬 수 있으며, 짧은 순간에 실리카 겔을 형성할 수 있고 상온에서 가혹하지 않은 조건으로 제조할 수 있어 효소의 실활을 방지할 수 있어 장기간 효소 활성을 발현할 수 있는 효소가 고정화된 실리카의 제조방법에 관한 것이다.
효소고정화, 양이온 계면활성제

Description

효소가 고정화된 실리카의 제조방법{Preparing method of enzyme immobilized silica}
도 1은 실시예 1에서 제조된 효소가 고정화된 실리카의 전자현미경(Philips (Japan) XL30S scanning electron microscope(SEM)) 사진이다.
삭제
도 2는 비교예 1에서 제조된 효소가 고정화된 실리카의 전자현미경 사진이다.
도 3은 비교예 2에서 제조된 효소가 고정화된 실리카의 전자현미경 사진이다.
도 4는 실시예 2에서 제조된 효소가 고정화된 실리카의 전자현미경 사진이다.
도 5는 실시예 1에서 제조된 효소가 고정화된 실리카의 원소 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 양이온 계면활성제를 이용한 효소가 고정화된 실리카의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 소수성의 실리케이트 전구체를 가수분해하여 얻어진 실리카 졸의 음(-)이온과 화학적으로 결합할 수 있는 양(+)이온을 가지는 양이온성 계면활성제를 첨가반응시킴으로써 효소를 고수율로 고정시킬 수 있으며, 짧은 순간에 실리카 겔을 형성할 수 있고 상온에서 가혹하지 않은 조건으로 제조할 수 있어 효소의 실활을 방지할 수 있어 장기간 효소 활성을 발현할 수 있는 효소가 고정화된 실리카 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
효소는 생체 촉매로서 기존의 화학 촉매에 비해서 환경 친화적이고 기질 특이성이 뛰어나는 장점을 지니고 있다. 그럼에도 불구하고 주변 환경에 매우 민감하게 활성이 변하고, 재활용이 어려우며, 만들어진 생성물과의 분리가 어렵다는 점이 산업적으로 사용하는데 있어서 한계이다.
이에, 상기한 문제를 해결하기 위해 여러 가지 방법이 연구되어져 왔는데, 그 중 가장 활발히 연구된 것이 효소를 고정화하는 방법이다. 효소는 부반응이 적고, 반응조건이 온화하며, 생체내의 모든 반응에 관여할 만큼 다양한 반응성을 갖는 장점을 갖고 있다. 반면 반응조건이 까다롭고, 안정성에 문제가 있으며, 기질선택성(substrate selectivity)이 있고, 상용화의 측면에서 비용의 문제가 단점이다. 특히 비용 문제와 반응 후 효소를 분리하는 일은 효소를 이용한 반응에 있어서 가장 큰 걸림돌이다. 이러한 단점을 극복하고자 제안된 방법이 효소를 고정하는 방법이다.
고정화 효소는 반복 사용이 가능하고, 생성물과 효소의 분리가 용이하여 효소의 단점을 극복할 수 있다. 이러한 고정화 효소는 비록 고정화 하지 않은 효소에 비해 활성이 떨어지는 단점이 있으나, 산업 현장에 이용할 수 있는 여러 장점들을 가지고 있다. 고정화 효소는 무엇보다 편리하게 다룰 수 있다는 장점을 가지고 있으며, 생성물과 효소의 분리가 매우 용이하고, 쉽게 재활용이 가능하여 효소 공정에서 가장 많은 비용을 차지하는 효소의 단가를 낮추는 이점이 있다. 또한 유기용매에서의 반응과 고온 반응 등에서 효소의 안정성을 증대시킬 수 있어서 다양한 반응 시스템 개발이 가능하다.
에너지 소비 측면에서도 효소를 이용한 생물학적 공정은 온화한 조건에서 수행되어 에너지 소모가 적어 에너지 소비의 절감이 되며, 효소의 기질 특이성에 의한 부산물 억제로 생산물의 품질 향상을 이룰 수 있다. 그리고 환경적인 측면에서도 공해물질의 발생을 억제 할 수 있는 장점이 있다.
그러나, 효소가 촉매작용을 발현하기 위해서는 효소의 일부가 기질과 반응하는 영역, 즉 활성부위가 필요하다. 이들 부위는 몇 가지의 아미노산 잔기로 형성되어 있으며, 효소가 고정화된 상태에서 촉매작용을 발현하기 위해서는 활성 중심의 아미노산 잔기가 변하지 않으면서 효소 고유의 3차 구조가 보존 및 유지 되어야 한다.
현재까지 연구되어지고 있는 효소를 고정화하는 방법으로는 다음과 같은 것이 있다. 즉, 효소를 적당한 고체 지지체에 고정하여 물리적으로나 화학적으로 쉽게 분리하려는 노력이 시도되고 있고, 이러한 노력의 결과로 다양한 효소를 고정화하여 사용할 수 있다. 대부분의 고체 지지체들은 그 외부표면의 유기 그룹으로 인해 효소를 고정화 하는데 용이하고, 강한 물리적, 화학적인 환경을 제공한다.
상기한 효소 고정화 방법은 크게 담체결합법, 가교법, 포괄법 등으로 나눌 수 있으며, 결합방법에 따라 화학적 방법과 물리적 방법으로 나눌 수 있고, 화학적 방법으로는 이온교환법, 공유결합법, 가교법 등이 있으며, 물리적 방법으로는 흡착법, 포괄법, 미세캡슐화법, 막(membrane)이용법 등이 있다.
상기 이온결합법은 이온교환기를 갖는 수불용성 담체에 효소를 이온결합 시켜서 고정하는 방법으로, 다당류와 합성 고분자 유도체가 담체로 쓰인다. 이온결합법은 공유결합법에 비해 방법이 간단하고, 고정화 조건이 온화하여 단백질 3차원적 구조의 변화가 적어서 비교적 높은 활성을 보인다. 그러나, 담체와 효소간 결합력이 공유결합에 비해 매우 약해서 이온성 성분들이 많은 상태에서 반응시키면 효소가 담체로부터 떨어지는 경우가 빈번한 문제점이 있다.
상기 공유결합법은 수불용성 담체에 효소를 공유결합 시켜서 고정하는 방법으로, 작용기로는 아미노기, 카르복실기, 수산기, 이미다졸기, 페놀기 등이 있다. 또한 효소와 담체 간에 별도의 연결물질을 이용하기도 하기도 하는데, 이는 일종의 유동적 스페이서(flexible spacer)를 붙이는 방법으로, 이렇게 하면 효소가 고정화 담체 표면에 약간의 거리를 두고 결합하므로 효소가 기질과 만나서 반응할 때 고유의 효소활성을 가질 수 있게 된다. 공유결합법에 의한 효소의 고정화는 효소가 담체와 공유결합으로 강하게 결합하고 있으므로 고농도 기질용액이나 염류용액 등 에 의하여 쉽게 떨어지지 않는 장점이 있다. 그러나, 이온결합에 의한 고정화 방법에 비하여 반응 조건이 까다롭고 반응조작이 복잡하며, 가혹한 조건에서 반응시키므로 단백질의 3차원적 구조에 변성이 일어나 활성이 높은 고정화 효소를 얻기 어려우며, 효소의 반응특성에 변화가 발생되는 문제점이 있다.
상기 가교법은 둘 이상의 작용기를 갖는 시약을 사용하여 효소끼리 결합시켜서 고정하는 방법으로, 이온결합법과는 다르게 수불용성 담체를 사용하지 않고 효소를 고정화 한다. 이때 시약으로는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 시아누릭 클로라이드(cyanuric chloride), 헥사메틸렌 디이소시아네이트(hexamethylene diisocyanate), N,N'-에틸렌 비스말레이미드(N,N'-ethylene bismaleimide) 등을 많이 사용한다. 가교결합에 관여하는 효소 단백질의 작용기로는 N-말단의 알파-아미노기, 리신의 아미노기, 티로신의 페놀기, 시트리신의 티롤기, 히스티딘의 이미다졸기 등이다.
상기 물리적 방법으로는 흡착에 의한 방법이 있는데 활성탄, 실리카겔, 전분, 점토에 흡착시키는 방법과 메조 포어 분자체에 흡착시키는 방법이 있다. 이때 흡착시키는 원리는 정전기적인 인력을 적용하는 것이다. 즉, 지지체로 사용되는 실리카의 등전점(isoelectric point)이 pH 2이므로, pH가 2 보다 큰 환경에서는 음(-)전하를 띠게 되는데, 보통 효소의 경우에는 고정시키는 조건의 pH를 효소의 등전점(isoelectric point)보다 작게 하여 효소가 양(+)전하를 띠도록 조절함으로써 효소와 지지체 사이의 정전기적 인력에 의해 물리적으로 흡착이 일어나게 되어 효소가 고정화되는 원리를 이용하는 것이다.
상기 졸-겔 방법은 졸-겔 형성에 의하여 효소를 졸-겔 구조 안에 고정시키는 방법으로, 졸-겔 구조 안에 고정된 효소의 활성을 측정하는 연구가 많이 진행되었다. 이 방법은 효소가 존재하는 상태에서 이 주위로 졸-겔의 무기 지지체 연결 구조가 형성되고 효소가 상기 무기 지지체 연결 구조 내의 기공 안에 존재하기 때문에 효소가 엉키거나 변형되지 않고, 효소 고정화에서 가장 큰 문제점으로 지적되는 효소가 분출되는 현상을 줄일 수 있다는 장점이 있다. 또 졸-겔에 의해서 형성되는 실리카 구조는 화학적으로 안정하고 친수성이며 합성시 적은 비용이 드는 장점이 있으며, 유기 폴리머 등에 고정화 된 것과 비교하여 더 높은 기계적 강도와 열적 안정성을 가지고, 세균으로부터 잘 보호 되는 장점이 있다. 그러나, 졸-겔 물질이 제조될 때 적용되는 산성 혹은 염기성 분위기 형성의 가혹한 합성 조건과 시약으로 인하여 효소가 변성되는 형상이 발생되기 쉽다는 단점도 존재한다.
상기 포괄법은 지지체의 미세한 격자내부에 효소가 들어가게 하여 누출되지 않는 상태로 고정시키는 방법으로 원료로 사용되는 알긴산, 펙틴, 키토산, 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 우레탄 중합체(urethane polymer) 등의 지지체로부터 효소가 빠져 나오지 않도록 해야 함과 동시에 효소의 기질들이 자유롭게 드나들 수 있도록 하는 구조를 만들어야 한다. 이러한 포괄법은 효소의 화학적인 변형이 없으므로 효소의 특성이 변하지 않지만 지지체 안에 효소를 고정시키는 과정 중에 효소가 활성을 잃을 수 있는 단점이 있다.
이에, 본 발명의 발명자들은 기존의 효소 고정화 방법의 문제점으로 지적되던 효소의 실활이 없으면서도 반복 재사용이 가능하고 효소의 분리가 용이하여 산업적으로 유용한 효소 고정화 방법을 찾기 위하여 연구 노력하였다.
그 결과, 실리케이트 전구체를 가수분해한 후 얻어진 실리카 졸의 음(-)이온과 화학적으로 결합가능한 양(+)이온을 가지는 양이온성 계면활성제를 부가함으로써 실리카 졸이 겔화되면서 얻어진 불투명한 실리카 겔 구조내에 효소가 담지될 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 의하면 기존의 효소 고정화 방법 중 함침법 적용시 유기용매에 의해 발생되는 효소의 실활을 방지하고, 담체의 약한 강도를 대체할 수 있으며, 졸-겔법의 장점으로 효소가 기공 내에 존재하기 때문에 효소가 엉키거나 변형되지 않으며 효소가 분출되는 현상을 줄일 수 있고, 기존의 유기 폴리머 등을 지지체로 사용하여 효소를 고정한 사례와 비교하여 높은 기계적 강도와 열적 안정성 및 세균에 대한 안정성이 부여되며, 지지체로 사용된 실리카 구조가 화학적으로 안정하고 친수성인 잇점과 합성시 적은 비용이 드는 장점을 가짐을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하여 제조된 효소가 고정화된 실리카는 생물 공정 산업, 식품, 수 처리, 제약, 바이오 관련 산업 등 고정화 효소를 사용하는 업계에 및 국내 효소 고정화 기술 발전에 일조할 수 있는 효과를 나타낸다.
따라서 본 발명은 양이온 계면활성제를 이용하여 기존의 졸-겔 법의 장점을 가지고 있으면서 합성 조건을 완화시켜 효소의 실활을 방지할 수 있으며, 효소의 활성이 장기간 발현되는 효소가 고정화된 실리카와 그의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 실리카 졸의 음(-)이온과 계면활성제의 양(+)이온이 화학적 결합을 이루고 있는 다공성 실리카 담체에, 효소가 담지되어 있는 효소가 고정화된 실리카를 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은1) 실리케이트 전구체를 가수분해하여 실리카 졸 용액을 얻는 단계와, 2) 상기 실리카 졸 용액에 효소를 혼합하는 단계, 및 3) 상기 2)단계에서 얻어진 혼합용액에 상기 실리카 졸의 음(-)이온과 화학적으로 결합할 수 있는 양(+)이온을 가지는 양이온성 계면활성제를 혼합하는 단계를 포함하여 이루어지는 효소가 고정화된 실리카의 제조방법을 포함한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 소수성의 실리케이트 전구체를 가수분해하여 얻어진 실리카 졸의 음(-)이온과 화학적으로 결합할 수 있는 양(+)이온을 가지는 양이온성 계면활성제를 첨가반응시킴으로써 효소를 고수율로 고정시킬 수 있으며, 짧은 순간에 실리카 겔을 형성할 수 있고 상온에서 가혹하지 않은 조건으로 제조할 수 있어 효소의 실활을 방지할 수 있으므로 장기간 효소 활성을 발현할 수 있는 개선된 효소가 고정화된 실리카를 제조할 수 있다.
이하 본 발명의 효소가 고정화된 실리카를 구체적으로 설명한다.
본 발명의 효소가 고정화된 실리카는 실리카 졸의 음(-)이온과 계면활성제의 양(+)이온이 화학적 결합을 이루고 있는 다공성 실리카 담체에, 효소가 담지되어 있는 특징을 가진다.
즉, 기존의 효소고정화 실리카에서 효소가 실리카 담체에 물리적으로 흡착된 형태인 경우, 효소의 초기 담지율이 높지만 고정화된 효소의 유출량 또한 높으므로 효소의 장기적인 고정이 어려웠다.
반면, 본 발명의 효소가 고정화된 실리카는 실리카 졸의 음(-)이온과 화학적으로 결합할 수 있는 양(+)이온을 가지는 양이온성 계면활성제를 사용함으로써, 이들이 결합하여 이루어지는 망상구조에 의해 효소가 고정되어 담지율을 높일 수 있고, 또한 효소가 초기에 과도하게 유출되는 현상을 억제할 수 있어 장기적으로 효소의 활성을 유지하도록 하였다.
또한, 본 발명은 실리카 졸을 양이온성 계면활성제 및 효소와 혼합하여 효소가 고정화된 실리카를 제조하는 방법으로서, 현재까지는 효소 존재하에 양이온성 계면활성제를 사용한 사례는 보고 된 바가 없다.
이러한 본 발명의 제 1 단계는 실리케이트 전구체를 가수분해하여 실리카 졸을 얻는 단계이다.
상기 실리케이트 전구체로는 통상적으로 당분야에서 사용되는 것을 선택사용할 수 있으며, 구체적으로 테라메틸 오르토실리케이트(TMOS), 테라에틸 오르토실리케이트(TEOS) 등의 소수성 실리케이트 전구체를 사용할 수 있는데, 본 발명의 실시예에서는 상기한 실리케이트 전구체로서 TMOS를 사용하고 있으나 이로써 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기한 실리케이트 전구체의 농도에 따라서 효소고정화 후 활성도뿐만 아니라 입자크기, 입자형태가 달라질 수 있으므로 효소의 종류나 양이온성 계면활성제의 농도 등에 따라 조절하는 것이 좋은데, 여러 조건을 고려하여 실리케이트 전구체의 농도를 0.3 ∼ 3 M, 바람직하기로는 0.5 ∼ 1.5 M 범위를 사용하는 것이 좋다. 구체적으로 실리케이트 전구체로서 TMOS를 사용할 경우 양이온성 계면활성제의 농도는 0.1 ∼ 1 중량% 비율로 조절하는 것이 바람직하다. 제시하지는 않았지만, 상기 제시된 실리케이트 전구체 외에 특정 실리케이트 전구체를 사용하고, 특정 효소를 선택사용할 경우 이들이 사용되는 용도에 따라 실리카 담체의 입자크기의 조절이 필요하므로, 이를 고려하여 실리케이트 전구체와 양이온성 계면활성제의 사용비율을 적절히 조절하는 것이 바람직하다.
상기 실리케이트 전구체를 가수분해하여 실리카 졸을 얻는데, 상기 가수분해는 pH 10 ∼ 12 범위의 염기성조건에서 수행된다. 상기 염기성 조건을 위해서는 암모니아 수용액 등의 염기성 수용액을 사용할 수 있다. 무기산 또는 유기산의 산성 수용액을 사용하여 pH 2 ∼ 4 범위 등의 산성 조건에서도 가수분해를 수행할 수 있으나, 상기 염기성 조검으로 가수분해를 수행하는 것이 보다 바람직하다. 상기와 같은 가수분해 조건은 효소의 종류 및 효소 고정화 실리카의 용도 등에 따라 선택할 수 있다.
이러한 실리케이트 전구체의 가수분해는 실리카 졸을 형성하기에 충분한 정도로 수행되고, 실리케이트 전구체의 종류 및 농도와, 효소의 종류 및 농도에 따라서 변동될 수 있으며, 구체적으로 30 ∼ 2000 분, 바람직하기로는 30 ∼ 1000 분, 더욱 바람직하기로는 30 ∼ 100 분 정도의 범위 내에서 수행될 수 있다. 이때 가수분해 시간이 너무 짧을 경우에는 실리케이트 전구체의 가수분해가 충분히 일어나지 않을 수 있고, 가수분해 시간이 너무 과도할 경우에는 효소의 활성도에 비해 시간적인 부담이 있으므로 주의한다.
본 발명의 제 2 단계는 상기 실리카 졸 용액에 효소를 혼합하는 단계이다.
즉, 상기 제 1 단계에서 실리케이트 전구체를 가수분해시킨 실리카 졸을 제조한 후 완충용액에 녹인 효소를 적정량 첨가하여 교반하는데, 상기 효소는 그 종류와 용도에 따라 농도를 다르게 조절할 수 있으며, 0.1 ∼ 1 중량% 농도로 완충용액에 희석하여 사용하는 것이 최종으로 제조된 효소가 고정화된 실리카의 활성이나, 경제적 부담 등의 조건을 고려한 측면에서 좋다. 본 발명에서 사용할 수 있는 효소는 그 종류를 특별히 한정하는 것은 아니지만, 구체적으로 트립신, 카이모트립신, 파파인 및 펩신 등을 선택사용할 수 있다. 이에, 본 발명의 실시예에서는 트립신을 사용한 사례를 제시하고 있지만 이것으로 본 발명의 권리범위를 한정할 수는 없음은 자명하다.
상기 완충용액으로는 효소의 종류에 따라서 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
본 단계에서 실리카 졸과 효소를 혼합할 때 소요되는 시간은 효소의 종류 및 활성 유지의 측면에서 적절히 조절되어야 하는데, 구체적으로 효소로서 트립신을 사용하고 실리케이트 전구체를 가수분해시킬 때 염기성 조건에서 수행할 경우, 상기 트립신이 염기성 조건에서 안정성이 저하되기 때문에 실리카 졸과 효소의 혼합 시간을 10 ∼ 60 초 정도로 짧게 조절하는 것이 좋다.
본 발명의 제 3 단계는 상기 실리카 졸의 음(-)이온과 화학적으로 결합할 수 있는 양(+)이온을 가지는 양이온성 계면활성제를 혼합하여 효소를 고정하는 단계이다.
즉, 상기 제 2 단계에서 실리카 졸과 효소를 혼합한 혼합용액에 양이온성 계면활성제를 완충용액에 녹여서 첨가 교반할 경우 불투명한 실리카 입자 덩어리들을 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 불투명한 실리카 입자 덩어리들을 행구고, 필터하여 고정화된 효소로 얻을 수 있다.
이와 같이 실리카 졸에 양이온성 계면활성제를 혼합하면 실리카 졸의 음(-)이온과 양이온성 계면활성제의 양(+)이온이 화학적으로 결합하게 되고, 순간적으로 불투명한 실리카 입자 덩어리들이 생겨나면서 효소가 고정화된다. 기존의 졸-겔 법을 이용한 효소 고정화 방법은 장시간 가혹한 조건에서 졸-겔 공정이 이루어지기 때문에 효소가 쉽게 변성되게 된다. 그러나 본 발명은 양이온성 계면활성제를 사용하여 순간적으로 효소를 고정화하기 때문에 효소의 변성을 최소화 할 수 있다.
상기 양이온성 계면활성제로는 실리카 졸의 음(-)이온과 화학적으로 결합할 수 있는 양(+)이온을 가지는 양이온성 계면활성제를 사용할 수 있으며, 이러한 양이온성 계면활성제로 3급 암모늄을 양(+)이온으로 하는 양이온성 계면활성제를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 양이온 계면활성제는 그 종류를 특 별히 한정하는 것은 아니지만 구체적으로 벤조알코늄 클로라이드(benzoalkonium chloride), 미리스탈코늄 클로라이드(miristalkonium chloride), 세틸피리디늄 클로라이드(Cetylpyridinium chloride), 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(cetyltrimethyl ammonium bromide) 및 세틸트리메틸 암모늄 클로라이드(cetyltrimethyl ammonium chloride) 등 중에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상의 혼합물을 사용하는 것이 좋다.
이러한 양이온성 계면활성제는 함께 사용되는 효소의 종류와 농도, 실리케이트 전구체의 종류 및 농도에 따라 그 농도를 조절하여 사용하는데, 0.1 ∼ 2.0 중량% 농도 범위로 조절하여 사용하는 것이 고정화된 효소의 활성도과 멤브레인 필터를 이용한 고정화 효소 회수 측면에서 바람직하다.
상기한 본 발명의 효소 고정화 실리카의 제조방법은 모든 제조 단계가 상온에서 이루어지므로 기존의 졸-겔법과 비교하여 그 조건이 월등히 완화된 방법이다.
상기와 같이 양이온성 계면활성제를 사용하여 얻어진 효소가 고정된 실리카 입자들을 멤브레인 필터 등을 사용하여 완충용액으로 수차례 씻어주고 완충용액에 보관한다.
상기한 본 발명에서 제조된 효소를 고정화시킨 실리카 담체는 평균세공 부피가 0.8 ∼ 1.9 ㎤/g, 평균 세공크기가 50 ∼ 70 Å 등으로 나타나며, 상기한 값들은 pH, 계면활성제 농도, 효소 농도 등의 반응조건을 변화시키면서 원하는 범위를 선택적으로 제어 할 수 있다.
한편, 통상적으로 실리카 담체에 흡착시킬 경우에는 효소의 유출량이 20 ∼ 40 중량% 정도로 높게 나타나는 것과 비교하여(4 ℃에서 24 시간 보관 후 상층액의 효소활성도를 측정시), 본 발명에 의하여 제조된 실리카에 고정화된 실리카는 효소의 유출량이 10 중량% 미만으로 나타나 효소가 높은 비율로 고정되어 있음을 확인할 수 있다.
상기와 같이 제조되는 본 발명의 효소가 고정화된 실리카는 평균세공 부피가 0.8 ∼ 1.9 ㎤/g, 평균세공크기가 50 ∼ 70 Å 수준으로 생물 공정 산업, 식품, 수 처리, 제약, 바이오 관련 산업 등 고정화 효소를 사용하는 업계에 다양하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
시그마-알드리치사에서 구입한 TMOS(99+%)를 1M으로 만들고 TMOS(1M) 4.98ml를 비어커에 넣어 10분정도 교반해 주면서 암모니아 수용액(30 중량% 농도) 0.035 ml를 넣어 60분간 교반하여 가수분해시켰다. 시그마-알드리치사에서 구입한 트립신을 0.1 M의 인산(phosphate) 완충용액(pH 7.8)에 용해시켜 제조한 1 중량% 농도의 트립신 20 ml을 상기 가수분해된 TMOS에 넣고, 여기에 인산 완충 용액(pH 7.2)에 용해시킨 양이온성 계면활성제(벤조알코니움 클로라이드 10 ml) 1 중량%를 넣으면 30초 이내에 순간적으로 불투명한 실리카 입자 덩어리들이 생겨났다.
이를 3분정도 교반시켜준 후 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 인산 완충용액 용액(pH 7.8)으로 여러 번 세척하면서 필터하여 트립신이 고정화된 불투명한 실리카 입자를 제조 하였다.
실시예 2
시그마-알드리치사에서 구입한 TMOS(99+%)를 1M으로 만들고 TMOS(1M) 4.98ml를 비어커에 넣어 10분정도 교반해 주면서 암모니아 수용액(30 중량% 농도) 0.035 ml를 넣어 60분간 교반하여 가수분해시켰다. 시그마-알드리치사에서 구입한 트립신을 0.1 M의 인산(phosphate) 완충용액(pH 7.8)에 용해시켜 제조한 1 중량% 농도의 트립신 20 ml을 상기 가수분해 된 TMOS에 넣고, 여기에 인산 완충 용액(pH 7.2)에 용해시킨 양이온성 계면활성제(세틸트리메틸 암모늄 브로마이드 10 ml) 1중량% 를 넣으면 30초 이내에 순간적으로 불투명한 실리카 입자 덩어리들이 생겨났다.
이를 3분정도 교반시켜준 후 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 인산 완충용액 용액(pH 7.8)으로 여러 번 세척하면서 필터하여 트립신이 고정화된 불투명한 실리카 입자를 제조 하였다.
실시예 3
시그마-알드리치사에서 구입한 TMOS(99+%)를 1M으로 만들고 TMOS(1M) 4.98ml 를 비어커에 넣어 10분정도 교반해 주면서 암모니아 수용액(30 중량% 농도) 0.035 ml를 넣어 60분간 교반하여 가수분해시켰다. 시그마-알드리치사에서 구입한 트립신을 0.1 M의 인산(phosphate) 완충용액(pH 7.8)에 용해시켜 제조한 1 중량% 농도의 트립신 20 ml을 상기 가수분해 된 TMOS에 넣고, 여기에 인산 완충 용액(pH 7.2)에 용해시킨 양이온성 계면활성제(세틸트리메틸 암모늄 클로라이드 10 ml) 1중량% 를 넣으면 30초 이내에 순간적으로 불투명한 실리카 입자 덩어리들이 생겨났다.
이를 3분정도 교반시켜준 후 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 인산 완충용액 용액(pH 7.8)으로 여러 번 세척하면서 필터하여 트립신이 고정화된 불투명한 실리카 입자를 제조 하였다.
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비교예 1
시그마-알드리치사에서 구입한 TMOS(99+%)를 1 M으로 만들고 TMOS(1M) 4.98 ml를 비어커에 넣어 10분정도 교반해 주면서 염산(35 %) 0.04 ml를 넣어 60분간 교반하여 가수분해시켰다. 시그마-알드리치사에서 구입한 트립신을 0.1 M의 인산(phosphate) 완충용액(pH 7.8)에 용해시켜 제조한 1 중량% 농도의 트립신 20 ml을 상기 가수분해된 TMOS에 넣고, 여기에 인산 완충 용액(pH 7.2)에 용해시킨 양이온성 계면활성제(벤조알코니움 클로라이드 10 ml) 1중량% 를 넣으면 30초 이내에 순간적으로 불투명한 실리카 입자 덩어리들이 생겨났다.
이를 3분정도 교반시켜준 후 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 인산 완충용액 용액(pH 7.8)으로 여러 번 세척하면서 필터하여 트립신이 고정화된 불투명한 실리카 입자를 제조 하였다.
비교예 2
시그마-알드리치사에서 구입한 TMOS(99+%)를 1M으로 만들고 TMOS(1M) 4.98 ml를 비어커에 넣어 10분정도 교반해 주면서 염산 수용액(35 중량% 농도) 0.04 ml 를 넣어 60분간 교반하여 가수분해시켰다.
여기에 인산 완충 용액(pH 7.2)에 용해시킨 양이온성 계면활성제(벤조알코니움 클로라이드 10 ml) 1중량% 를 넣으면 30초 이내에 순간적으로 불투명한 실리카 입자 덩어리들이 생겨났다.
이를 교반하면서 3 분 후 시그마-알드리치사에서 구입한 트립신을 0.1 M의 인산(phosphate) 완충용액(pH 7.8)에 용해시켜 제조한 1 중량% 농도의 트립신 20 ml을 상기 불투명한 실리카 입자에 넣고 3 분 동안 더 교반한 후 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 인산 완충용액 용액(pH 7.8)으로 여러 번 세척하면서 필터하여 트립신이 고정화된 불투명한 실리카 입자를 제조 하였다.
실험예 1 : 효소가 고정화된 실리카의 특성 측정
상기 실시예 1과 비교예 1에 의하여 제조된 효소 고정화 실리카를 다음 제시된 방법으로 표면적, 세공부피 및 세공크기를 측정하였으며, 그 결과를 다음 표 1에 나타내었다.
1) 표면적: BET 표면적은 ASAP2400(N2사용)를 사용하여 측정하였다.
2) 세공부피: BJH 세공부피는 ASAP2400(N2사용)를 사용하여 측정하였다.
3) 세공크기: BJH 세공크기는 ASAP2400(N2사용)를 사용하여 측정하였다.
구분 평균표면적(㎡/g) 평균세공부피(㎤/g) 평균세공크기(Å)
실시예 1 437± 5 0.92± 0.05 66± 0.5
비교예 1 1208± 5 1.59± 0.05 56± 0.5
실험예 2 : 효소가 고정화된 실리카에서의 효소 유출율 측정
본 실험은 효소가 고정화된 실리카에서의 효소 유출율을 측정하기 위하여 실시된 것으로, 측정하고자 하는 실리카를 4 ℃ 와 상온(20 ℃)의 인산 완충용액(pH 7.8)에 각각 보관하면서 시간에 따른 효소의 유출량을 확인하였다.
실시예 1(효소 담지량 1중량%) 에 의하여 제조된 효소가 고정화된 실리카를 4 ℃ 와 상온(20 ℃)의 인산 완충용액(pH 7.8)에 넣고 약하게 교반시키면서 제시된 보관시간 마다 상층액을 채취하여 효소 유출량을 측정하여 유출율을 구했으며, 그 결과는 다음 표 2에 나타내었다.
구분 효소의 유출율 (mg / ml)
0일 2일 3일 4일 7일 15일
4℃보관 실시예 1 0.09 0.11 0.12 0.13 0.15 0.17
20℃보관 실시예 1 0.09 0.17 0.19 0.21 0.24 0.27
본 발명의 실시예 1의 경우에는 보관 초기 2 일까지는 효소의 유출이 약간 증가하였지만 3일 이후부터는 효소의 유출이 거의 일어나지 않아 효소가 실리카 담체에 안정적으로 고정되어 있음을 확인할 수 있으며, 또한 보관기간이 15일의 경우에도 효소의 유출율이 낮아 효소가 거의 유출되지 않음을 확인할 수 있다. 효소의 유출량을 측정한 결과 대분의 효소가 완충용액으로 유출되지 않고 실리카 담체에 고정되어 있음을 확인할 수 있어 본 발명의 효소가 고정화된 실리카는 장기간 사용이 가능함을 확인할 수 있다.
상기한 결과로부터 본 발명의 효소가 고정화된 실리카는 효소가 높은 고정화율로 실리카 담체에 고정되며, 내구성이 우수하여 효소의 유출이 거의 일어나지 않는 우수한 특성을 가진다고 판단된다.
실험예 3 : 효소가 고정화된 실리카의 상대적인 효소 활성도 측정
상기 실시예 1 ∼ 3 및 비교예 1, 2에 의하여 제조된 효소가 고정화된 실리카에 고정된 효소의 활성도는 BAPNA(N-benzoyl-DL-Arginine-4-nitro-anilide)를 기질로 하여 효소 반응시킨 후 증류수로 희석한 다음 자외선/가시광선 분광기(uv/vis Spectrophotometer)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 상대적인 효소활성도를 결정하였다. 그 결과를 다음 표 3에 나타내었다.
구분 상대적인 효소 활성도(%)
실시예 1 100
실시예 2 103
실시예 3 92
비교예 1 45
비교예 2 24
상기 표 3에 의하면, 본 발명으로 제조된 효소가 고정화된 실리카의 경우 효소의 실활이 적어 그 활성도가 높게 유지됨을 확인할 수 있다.
실험예 4 : 효소가 고정화된 실리카의 효소 활성도 측정
상기 실시예 1과 비교예 1에 의하여 효소를 고정화 시 1 중량% 농도로 20 ml에 용해된 효소의 효소활성도를 측정하여 표 4에 나타내었다.
즉, 양이온성 계면활성제를 첨가하여 효소를 고정화 시킨 후 효소고정화 실리카입자를 침전시켜 상층액에 남아있는 미고정화 효소를 측정하였다. 실험방법은 상층액 10 ㎕를 채취하여 BAPNA(N-benzoyl-DL-Arginine-4-nitro-anilide)를 기질로 사용하여 효소 반응시킨 후 증류수로 희석한 다음 자외선/가시광선 분광기(uv/vis Spectrophotometer)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
구분 상층액 효소활성도
실시예 1 0.008
비교예 1 0.063
(미고정화 효소) 1중량%, 10㎕ 0.113
실험예 5: 효소가 고정화된 실리카 입자의 전자 현미경 사진 확인
상기 실시예 1, 2 및 비교예 1, 2에 의하여 제조된 효소 고정화 실리카 입자의 구조를 전자 현미경 사진으로 확인하였으며, 그 결과는 첨부도면 도 1 ∼ 4에 각각 나타내었다. 상기 도면에 의하면 본 발명의 효소가 고정화된 실리카의 전자현미경 사진을 확인할 수 있다.
실험예 6: 효소가 고정화된 실리카 입자의 원소 분석
상기 실시예 1에 의하여 제조된 효소 고정화 실리카 입자를 건조 후 EDS(energy dispersive spectroscopy)로 원소를 분석한 후 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이 보여주는 것처럼 대부분 Si, C, O 로 구성되어있음을 알 수 있으며, Na는 효소를 고정화하는 과정에서 사용된 인산 완충용액의 Na 인 것으로 판단된다.
또한, Si의 해당 피크와 C 의 해당 피크의 면적을 비교한 본 발명의 효소가 고정화된 실리카의 경우 높은 정도의 효소가 실리카 담체에 고정되었음을 확인할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 효소의 재사용 뿐 만 아니라 효소 존재 하에서 순간적으로 겔화하기 때문에 유기용매나 시약에 의한 실활을 최소한으로 유지할 수 있으며, 반응 조건을 조절하여 효소 고정화 실리카의 표면적, 세공크기 및 세공부피를 선택적으로 조절할 수 있다.
또한 본 발명에 의하면 효소의 고정화율이 95 % 이상으로 나타나 효소가 실리카 입자에 안정적으로 고정되었음을 확인할 수 있으며, 실리케이트를 암모니아로 가수분해 시켰을 경우 염산으로 가수분해 시켰을 때 보다 효소가 고정화된 실리카의 평균세공 크기가 상대적으로 커서 기질과의 반응이 좀더 쉽게 할 수 있다. 또한 효소가 실리카입자 내부에 안정적으로 고정화 되어있기 때문에 장시간 보관에도 효소가 유출되지 않음을 알 수 있다.
이러한 본 발명에 의하여 제조된 효소 고정화 실리카는 평균세공 크기가 50 ∼ 70Å ㎚ 수준으로 생물 공정 산업, 식품, 수 처리, 제약, 바이오 관련 산업 등 고정화 효소를 사용하는 업계에 및 국내 효소 고정화 기술 발전에 일조할 수 있는 효과를 나타낸다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 1) 실리케이트 전구체를 가수분해하여 실리카 졸 용액을 얻는 단계와,
    2) 상기 실리카 졸 용액에 효소를 혼합하는 단계 및
    3) 상기 2)단계에서 얻어진 혼합용액에 상기 실리카 졸의 음(-)이온과 화학적으로 결합할 수 있는 양(+)이온을 가지는 양이온성 계면활성제를 혼합하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 효소가 고정화된 실리카의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 가수분해는 pH 9 ∼ 12 범위의 염기성조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 3급 암모늄을 양(+)이온으로 하는 양이온성 계면활성제인 것을 특징으로 제조방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 벤조알코늄 클로라이드(benzoalkonium chloride), 미리스탈코늄 클로라이드(miristalkonium chloride), 세틸피리디늄 클로라이드(Cetylpyridinium chloride), 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(cetyltrimethyl ammonium bromide) 및 세틸트리메틸 암모늄 클로라이드(cetyltrimethyl ammonium chloride) 중에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 효소가 고정화된 실리카의 제조방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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