CN111424005A - 一株产酪氨酸解氨酶的菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株产酪氨酸解氨酶的菌株及应用，属于生物技术领域，所述菌株分类命名为约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii，已于2020年5月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.19831。本发明提供的菌株遗传稳定性好，培养成本低，产生的酪氨酸解氨酶酶活力高，适用底物谱较宽，可直接利用该菌株直接转化合成对羟基肉桂酸及衍生物，催化合成时无需加入表面活性剂、有机溶剂等透膜剂，避免引入外源杂质，有利于提取分离操作，工业应用具有优势。

Description

一株产酪氨酸解氨酶的菌株及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一株生产酪氨酸解氨酶的菌株，以及利用该菌株生产的酪氨酸解氨酶催化制备对羟基肉桂酸及衍生物的方法。

背景技术

4-羟基肉桂酸（p-coumaric acid），又名对香豆酸，广泛存在于自然界植物当中，为白花蛇舌草、海金沙草、杜仲叶的有效成分之一，作为香料或酸化剂在食品行业广泛使用，农业上可以替代抗生素治疗畜禽病毒或细菌性疾病；同时也是合成可心定、杜鹃素、艾司洛尔等重要医药活性物质的中间体，在医药领域的应用前景也非常广阔。另外4-羟基肉桂酸的结构类似物肉桂酸、咖啡酸作为重要的芳香族有机酸，在食品、农业及医药领域广泛应用。现阶段获得对香豆酸的途径主要以化学合成和植物提取为主。化学合成面临反应时间长，高能耗、有毒副产品及环境污染的难题。植物提取则面临成本高、生产力低，生态资源环境等问题。微生物转化法将是生产4-羟基肉桂酸最具前景的替代生产方法。

酪氨酸解氨酶催化L-酪氨酸非氧化脱氨生产对羟基肉桂酸，在植物细胞中普遍存在，目前在一些微生物体内也陆续发现了酪氨酸解氨酶，如荚膜红细菌（Rhodobactercapsulatus）、球形红细菌（Rhodobacters sphaeroides）、丝孢酵母（Trichosporon cutaneum）、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等。国内外研究者利用上述菌株做了很多研究工作，Todd Vannelli等克隆到酵母菌(Trichosporoncutaneum)的TA L 基因, 在大肠杆菌中表达并纯化，纯化后的酶以比活仅为0.33U/mL。刘沛然等克隆粘红酵母酪氨酸解氨酶在大肠杆菌中的异源表达，比活1.78 U/mg，用于生产4-羟基肉桂酸，产量为196.3 mg/L。一直困扰人们的难题是酪氨酸解氨酶酶的稳定性差，对催化产物耐受性差、易失活，导致催化形成的产物浓度低，距离工业化应用尚有较大的距离。通过筛选高活性及高稳定性的新型酪氨酸解氨酶是解决以上问题的关键所在。

发明内容

本发明的目的是提供从土壤中分离得到的一株高效生产酪氨酸解氨酶的菌株，并应用该菌株产生的酪氨酸解氨酶酶法制备对羟基肉桂酸及衍生物的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一株产酪氨酸解氨酶的菌株Ytld-76，分类命名为约氏不动杆菌Acinetobacterjohnsonii，于2020年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No19831。

所述菌株是从烟台地区山坡土壤中分离得到，这是一株酪氨酸解氨酶分泌能力极高的菌株，培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以直接用于酶法制备对羟基肉桂酸。

本发明还提供利用所述菌株产生的酪氨酸解氨酶催化制备对羟基肉桂酸及衍生物的方法如下：

1、培养基配制

（1）固体保藏培养基成份及其终浓度：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；

（2）液体种子培养基成份及其终浓度：醋酸钠5-10 g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-5g/L， KH₂PO₄ 1-3g/L，MgSO₄ 0.1-1g/L，蛋白胨5-10 g/L，酵母浸粉 1-3 g/L， pH 7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；

（3）发酵培养基成份及其终浓度：醋酸钠5-10 g/L，柠檬酸钠 1-3g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-5g/L， KH₂PO₄ 1- 3g/L，MgSO₄ 0.1-1g/L，FeSO₄ 1-5mg/L，CoCl₂ 0.1-1mg/L，钼酸钠 0.1-1mg/L，豆粕水解液5-10 g/L，玉米浆 1-5 g/L，L-酪氨酸 1-5 g/L，pH 7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

2、菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒温培养箱30℃培养24～48h；

3、液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，纱布封口，于20-35℃，150～200r/min摇床振荡培养24～48h，得液体种子；

4、液体发酵：按5～10%接种量向发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～50%，pH7.0～7.5，温度26～37℃，通气培养24～48h，得到酪氨酸解氨酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体细胞；

5、全细胞催化L-酪氨酸（或衍生物）制备对羟基肉桂酸（或衍生物）：将10-30g的L-酪氨酸（或衍生物）加入500mL水中，氢氧化钠调pH至8.5～10.0，搅拌均匀，加入离心1L发酵液收集的菌体，并加水定容1L，温度30～50℃，维持转速在50～100 r/min，反应4～20h。

本发明还提供所述约氏不动杆菌Ytld-76在催化L-酪氨酸生产对羟基肉桂酸中的应用。

本发明还提供所述约氏不动杆菌Ytld-76在催化L-苯丙氨酸生产肉桂酸中的应用。

本发明还提供所述约氏不动杆菌Ytld-76在催化L-多巴生产3,4-二羟基肉桂酸中的应用。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1、本发明提供的约氏不动杆菌Ytld-76，不同于以往的酪氨酸解氨酶产生菌种，尚未有该菌株产酪氨酸解氨酶的报道，拓宽了产酪氨酸解氨酶的菌种渠道；

2、本发明所提供的约氏不动杆菌Ytld-76遗传稳定性好，培养基成分简单原料成本低，产生的酪氨酸解氨酶稳定性好，能够耐受高浓度产物，对羟基肉桂酸浓度可达26.5g/L，且可作用的底物谱较宽，可直接利用该菌株发酵液直接转化生产对羟基肉桂酸及衍生物，工业应用具有优势。

3、约氏不动杆菌Ytld-76具有良好的细胞膜通透性，有利于底物透过，催化合成肉桂酸衍生物无需加入表面活性剂、有机溶剂等透膜剂，避免引入外源杂质，有利于提取分离操作。

附图说明

图1为约氏不动杆菌Ytld-76基于16S rRNA序列的系统发育树。

具体实施方式

为阐明对本项发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。

实施例1：约氏不动杆菌菌株分类

1）菌种特性

在保藏培养基上菌落呈乳白色，近圆形、表面光滑湿润、有光泽、边缘整齐；通过显微镜观察，菌体呈杆状，不能运动，革兰氏阴性；生理生化指标如表1所示。

表1 菌株Ytld-76生理生化特征

项目	Ytld-76	项目	Ytld-76
				氧化酶	-	VP 试验	-
淀粉	-	触酶试验	+
				硝酸盐还原	-	柠檬酸利用	+
脲酶	-	明胶水解	-

2）菌株鉴定

经DNA提取、PCR扩增和测序获得的16S rRNA 基因序列长度为1446 bp，在GenBank上进行BLAST比对并绘制系统进化树（图1），得出该菌株与Acinetobacter johnsoniiATCC17909（HE651920）碱基相似性达98.2%，结合生理生化指标，将Ytld-76菌株鉴定为约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)。16S rRNA序列信息如下：

gggcgtggcggcagctacacatgcagtcgagcggggaagtagtagcttgctacactgacctagcggcggacgggtgagtaatgcttaggaatctgcctattagtgggggacaacattccgaaaggaatgctaataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggatcttcggaccttgcgctaatagatgagcctaagtcagattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatccgccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttttggttgtaaagcactttaagcgaggaggaggctaccgagattaataccctgggatagtggacgttactcgcagaataagcaccgggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcgagcgttaatcggatttactgggcgtaaagcgtgcgtaggcggctttttaagtcggatgtgaaatccctgagcttaacttaggaattgcattcgatactgggaagctagagtatgggagaggatggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccatctggcctaatactgacgctgaggtacgaaagcatggggagcaaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctactagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatagtaagaactttccagagatggattggtgcctttcgggaacttacatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttttccttatttgccagcgggttaagccgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgctacctagcgataggatgctaatctcaaaaagccgatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggaatttgttgcaccagaagtaggtagtctaaccgcaaggaggacgctaccacggtgcccatgggc

3）约氏不动杆菌Ytld-76酪氨酸解氨酶底物特异性

考察了约氏不动杆菌Ytld-76酪氨酸解氨酶的底物特异性。由表2中可见，酪氨酸解氨酶能够较好地催化L-酪氨酸及结构类似物为芳香族不饱和有机酸，具有较宽的底物谱，对D-酪氨酸及结构类似物不能催化。

表2 底物特异性

底物	相对酶活（%）
		L-酪氨酸	100
L-苯丙氨酸	28.2
		L-多巴	13.5
D-酪氨酸	0
		3-氟-L-酪氨酸	5.7
D-苯丙氨酸	0
		D-多巴	0

4）遗传稳定性

采用划线法将约氏不动杆菌Ytld-76在固体培养基上连续传代50次，测定菌体形态、生长速度及转化L-酪氨酸的速度和转化率，与原代菌株无明显差异，遗传稳定性良好。

实施例2 菌株培养与对羟基肉桂酸合成

1）菌株活化：挑取菌种至固体保藏培养基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0，划线接种于恒温培养箱30℃培养48h；

2）液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，八层纱布封口，于30℃， 200r/min摇床振荡培养24 h，得液体种子；所述的液体种子培养基组分及其终浓度：醋酸钠5 g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L， KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.1g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉 1 g/L， pH 7.0；

3）液体发酵：按5%接种量在发酵培养基中接入液体种子，所述发酵培养基的成分及终浓度为醋酸钠10 g/L，柠檬酸钠 1g/L，(NH₄)₂SO₄ 2 g/L， KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，FeSO₄1mg/L，CoCl₂ 0.1mg/L，钼酸钠 0.1mg/L，豆粕水解液10 g/L，玉米浆 5 g/L和L-酪氨酸 2g/L，转速200～700r/min，溶氧控制20%左右，pH7.0，温度30℃，通气培养36h，得到酪氨酸解氨酶的发酵液，酶活达到298U/L，8000r/min离心20min收集菌体；

4）催化制备对羟基肉桂酸：将10g的L-酪氨酸加入约500mL水中，氢氧化钠调pH至9.0，搅拌均匀，加入离心1L发酵液收集的菌体，并加水定容1L，温度30℃，维持转速在50 r/min，反应4h。HPLC测定对羟基肉桂酸含量为8.9g/L，对酪氨酸摩尔转化率为98.2%。液相色谱条件为：C18 反相柱（5 μm, 250 mm×4.6mm），柱温25℃；检测波长：277nm；流动相：甲醇：水（含0.2% 乙酸）=（50:50, V/V）流速：1mL/min。

实施例3催化L-酪氨酸生产对羟基肉桂酸

1）菌株活化：挑取菌种至固体保藏培养基，划线接种于恒温培养箱30℃培养48h；所述固体保藏培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0；

2）液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，八层纱布封口，于30℃， 200r/min摇床振荡培养24 h，得液体种子；所述液体种子培养基组分：醋酸钠 8 g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L， KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄ 0.5g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉 2 g/L， pH 7.0，

3）液体发酵：按5%接种量向组成成分为醋酸钠10 g/L，柠檬酸钠 3g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L， KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄ 1g/L，FeSO₄ 3mg/L，CoCl₂ 0.3mg/L，钼酸钠 0.3 mg/L，豆粕水解液5g/L，玉米浆 5 g/L，L-酪氨酸 5 g/L的发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制30%左右，pH7.0，温度30℃，通气培养42h，得到酪氨酸解氨酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体；

4）催化制备对羟基肉桂酸：将30g的L-酪氨酸加入约500mL水中，氢氧化钠调pH至10.0，搅拌均匀，加入离心1L发酵液收集的菌体，并加水定容1L，温度40℃，维持转速在50 r/min，反应16h。HPLC测定对羟基肉桂酸含量为26.5g/L，对酪氨酸摩尔转化率为97.4%。液相色谱条件同实施例2。

实施例4 催化制备肉桂酸

菌种活化、液体种子制备及酪氨酸解氨酶液体发酵同实施例3。将10g的L-苯丙氨酸加入约500mL水中，氢氧化钠调pH至9.5，搅拌均匀，加入离心1L发酵液收集的菌体，并加水定容1L，温度40℃，维持转速在50 r/min，反应6h。HPLC测定肉桂酸含量为8.8g/L，对苯丙氨酸摩尔转化率为98.1%。液相色谱条件同实施例2。

实施例5 催化制备3,4-二羟基肉桂酸

菌种活化、液体种子制备及酪氨酸解氨酶液体发酵同实施例3。将10g的L-多巴加入约500mL水中，氢氧化钠调pH至8.5，搅拌均匀，加入离心1L发酵液收集的菌体，并加水定容1L，温度40℃，维持转速在50 r/min，反应10h。HPLC测定肉桂酸含量为9.0g/L，对苯丙氨酸摩尔转化率为98.5%。液相色谱条件同实施例2。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 一株产酪氨酸解氨酶的菌株及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1446

<212> DNA

<213> 约氏不动杆菌Ytld-76(Acinetobacter johnsonii)

<400> 1

gggcgtggcg gcagctacac atgcagtcga gcggggaagt agtagcttgc tacactgacc 60

tagcggcgga cgggtgagta atgcttagga atctgcctat tagtggggga caacattccg 120

aaaggaatgc taataccgca tacgccctac gggggaaagc aggggatctt cggaccttgc 180

gctaatagat gagcctaagt cagattagct agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga 240

cgatctgtag cgggtctgag aggatgatcc gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300

tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gaaagcctga tccagccatg 360

ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttttggttgt aaagcacttt aagcgaggag gaggctaccg 420

agattaatac cctgggatag tggacgttac tcgcagaata agcaccgggc taactctgtg 480

ccagcagccg cggtaataca gagggtgcga gcgttaatcg gatttactgg gcgtaaagcg 540

tgcgtaggcg gctttttaag tcggatgtga aatccctgag cttaacttag gaattgcatt 600

cgatactggg aagctagagt atgggagagg atggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat 660

gcgtagagat ctggaggaat accgatggcg aaggcagcca tctggcctaa tactgacgct 720

gaggtacgaa agcatgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac 780

gatgtctact agccgttggg gcctttgagg ctttagtggc gcagctaacg cgataagtag 840

accgcctggg gagtacggtc gcaagactaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca 900

agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg gtcttgacat 960

agtaagaact ttccagagat ggattggtgc ctttcgggaa cttacataca ggtgctgcat 1020

ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080

ttccttattt gccagcgggt taagccggga actttaagga tactgccagt gacaaactgg 1140

aggaaggcgg ggacgacgtc aagtcatcat ggcccttacg accagggcta cacacgtgct 1200

acaatggtcg gtacaaaggg ttgctaccta gcgataggat gctaatctca aaaagccgat 1260

cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg 1320

gatcagaatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1380

ggaatttgtt gcaccagaag taggtagtct aaccgcaagg aggacgctac cacggtgccc 1440

atgggc 1446

Claims (5)

1.一株产酪氨酸解氨酶的菌株，分类命名为约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年5月15日，保藏编号为：CGMCC No.19831。

2.利用权利要求1所述菌株产生的酪氨酸解氨酶催化制备对羟基肉桂酸及衍生物的方法如下：

1）培养基配制

（1）固体保藏培养基成份及其终浓度：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；

（2）液体种子培养基成份及其终浓度：醋酸钠5-10 g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-5g/L， KH₂PO₄ 1-3g/L，MgSO₄ 0.1-1g/L，蛋白胨5-10 g/L，酵母浸粉 1-3 g/L， pH 7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；

（3）发酵培养基成份及其终浓度：醋酸钠5-10 g/L，柠檬酸钠 1-3g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-5g/L， KH₂PO₄ 1- 3g/L，MgSO₄ 0.1-1g/L，FeSO₄ 1-5mg/L，CoCl₂ 0.1-1mg/L，钼酸钠 0.1-1mg/L，豆粕水解液5-10 g/L，玉米浆 1-5 g/L，L-酪氨酸 1-5 g/L，pH 7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；

2）菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒温培养箱30℃培养24～48h；

3）液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，纱布封口，于20-35℃，150～200r/min摇床振荡培养24～48h，得液体种子；

4）液体发酵：按5～10%接种量向发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～50%，pH7.0～7.5，温度26～37℃，通气培养24～48h，得到酪氨酸解氨酶的发酵液，8000r/min离心20min收集菌体细胞；

5）全细胞催化L-酪氨酸或衍生物制备对羟基肉桂酸或衍生物：将10-30g的L-酪氨酸或衍生物加入500mL水中，氢氧化钠调pH至8.5～10.0，搅拌均匀，加入离心1L发酵液收集的菌体，并加水定容1L，温度30～50℃，维持转速在50～100 r/min，反应4～20h。

3.权利要求1所述菌株在催化L-酪氨酸生产对羟基肉桂酸中的应用。

4.权利要求1所述菌株在催化L-苯丙氨酸生产肉桂酸中的应用。

5.权利要求1所述菌株在催化L-多巴生产3,4-二羟基肉桂酸中的应用。

Images