FI103806B - Menetelmä kefalosporiinijohdannaisten saattamiseksi jatkuvatoimisesti reagoimaan glutaryyli-7-aminokefalosporiinihappojohdannaisiksi - Google Patents

Menetelmä kefalosporiinijohdannaisten saattamiseksi jatkuvatoimisesti reagoimaan glutaryyli-7-aminokefalosporiinihappojohdannaisiksi Download PDF

Info

Publication number
FI103806B
FI103806B FI914149A FI914149A FI103806B FI 103806 B FI103806 B FI 103806B FI 914149 A FI914149 A FI 914149A FI 914149 A FI914149 A FI 914149A FI 103806 B FI103806 B FI 103806B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
reaction
cephalosporin
process according
group
dao
Prior art date
Application number
FI914149A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI914149A0 (fi
FI103806B1 (fi
FI914149A (fi
Inventor
Klaus Sauber
Thomas Bayer
Original Assignee
Biochemie Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biochemie Gmbh filed Critical Biochemie Gmbh
Publication of FI914149A0 publication Critical patent/FI914149A0/fi
Publication of FI914149A publication Critical patent/FI914149A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI103806B publication Critical patent/FI103806B/fi
Publication of FI103806B1 publication Critical patent/FI103806B1/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12Y104/03003—D-Amino-acid oxidase (1.4.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

, 103806
Menetelmä kefalosporiinijohdannaisten saattamiseksi jatkuva toimisesti reagoimaan glutaryyli-7-aminokefalosporiini-happojohdannaisiksi 5 Kefalosporiini C (3-asetoksimetyyli-7p-(D-5-amino- 5-karboksipentaaniamido)kef-3 -eemi-4-karboksyylihappo) voidaan hapettaa permeabilisoiduilla permeaabeleiksi tehdyillä Trigonopsis variabilis-hiivan soluilla a-ketoadi-pinyyli-7-aminokefalosporaanihapoksi ja sen jälkeen dekar-10 boksyloida oksidatiivisesti vetyperoksidilla glutaryy-li-7-aminokefalosporaanihapoksi (DOS 2 219 454) . Siinä kuvatuissa olosuhteissa tarvitaan 0,5-3 tunnin reaktio-aikoja ja saadaan 60 - 73 %:n saantoja.
D-aminohappo-oksidaasi E.C. 1.4.3.3 (seuraavassa 15 DAO:ksi nimitetty) katalysoi D-aminohappojen oksidatiivis- ta deaminaatiota vastaaviksi o-ketohapoiksi, ammoniakiksi ja vetyperoksidiksi.
Kaupallisesti saatavan sianmunuaisista peräisin olevan DAO:n ohella entsyymiä syntetisoivat bakteerit, 20 hiivat ja sienet. Näistä on Trigonopsis variabilis osoittautunut hyväksi DAO-tuottajaksi. Sen lisäksi, että tätä entsyymiä käytetään D,L-aminohappojen rasemaattien erottamiseen ja D-aminohappojen kvantitatiiviseen osoittamiseen erilaisista liuoksista, on erityisesti tuotava esiin sen 25 kyky kefalosporiini C:n oksidatiiviseen deaminaatioon.
BE-patenttijulkaisun 736 934 mukaan DAO:ta saadaan sienistä ja se täytyy mainittua kefalosporiini C:n oksi-daatiota varten vapauttaa hajottamalla.
DE-hakemusjulkaisussa 22 19 454 (US-patenttijulkai-30 su 3 801 458) kuvataan kefalosporiini C:n johdannaisten valmistus aktivoitujen Trigonopsis varialbilis CBS 4095 -solujen avulla. "Aktivoitu" tarkoittaa tässä, että hiiva-soluille suoritetaan fysikaalinen ja/tai kemiallinen käsittely siten, että solujen sisältämä DAO tulee kefalospo- 2 103806 riini C:n (CPC) oksidaatiota varten käyttökelpoiseen muotoon, mutta ei sinänsä vapaudu.
Kyseessä olevan keksinnön tehtävänä oli aikaansaada menetelmä kefalosporiinijohdannaisten vielä täydellisem-5 mäksi saattamiseksi vastaaviksi glutaryyli-7-aminokefalo-sporiinihappojohdannaisiksi, jossa menetelmässä tunnettu kefalosporiinin hajoaminen vesipitoisissa liuoksissa suureksi osaksi estetään, käytetyn DAO-pitoisen katalysaattorin stabiilisuutta parannetaan ja saavutetaan hyvä glu-10 taryyli-7-aminokefalosporiinihapon (G-7-ACS) saanto.
Nyt on keksitty menetelmä, jolla kefalosporiinijohdannaiset voidaan saattaa reagoimaan glutaryyli-7-aminoke-falosporaanihappojohdannaisiksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että reaktio suoritetaan jatkuvatoimisesti 15 DAO-pitoista katalysaattoria käyttäen ja sen jälkeen lisätään mahdollisesti vetyperoksidia.
Yllättäen voitiin jatkuvatoimista menetelmätapaa käyttäen saavuttaa oleellinen parannus katalysaatttorin hyväksikäytössä verrattuna panosprosessiin. Lisäksi DAO-20 pitoisen katalysaattorin säilyvyys substraattia jatkuvasti lisättäessä parani selvästi verrattuna panosprosessiin. Myös CPC:n viipymäaikaa reaktioastioissa voitiin pienentää .
Keksintö koskee täten menetelmää kefalospiriinijoh-25 dannaisten saattamiseksi reagoimaan vastaaviksi glutaryy- li-7-aminokefalosporaanihappojohdannaisiksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että reaktio suoritetaan jatkuvatoimisena DAO-pitoisen katalysaattorin läsnä ollessa ja sen jälkeen lisätään mahdollisesti vetyperoksidia.
30 Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää kaikkia kefalosporiinijohdannaisia, kunhan niissä on D-5-amino-5-karboksipentaaniaminoryhmä kefalosporiinirenkaan paikassa 7. Edullisesti saatetaan reagoimaan kefalosporiini johdannaisia, joilla on kaava II,
COOH
3 103806 H2N-CH- (CH2)3CONH-1 j (11)
j— N^^CH2X
5 COOH
jossa X on asetaattiryhmä, nukleofiiliryhmä, 10 heterosyklinen ryhmä, hydroksiryhmä tai vety,
sekä niiden suoloja yhdisteiksi joilla on kaava I
g 15 R-(ch2)3conh-1—< > J—uy^CH2x
COOH
20 jossa X:llö on edellä mainittu merkitys, R tarkoittaa karboksiryhmää tai ketokarboksiryhmäö sekä niiden suoloiksi.
25 Kaavan II mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää sekä suhteellisen epäpuhtaassa muodossa että esipuhdistetussa muodossa.
Nukleofiiliillä tarkoitetaan esimerkiksi yhdisteitä, kuten pyridiini tai tertiaariset amiinit. Heterosyk-30 Iillä tarkoitetaan yhdisteitä, kuten esimerkiksi tiatso- lyylijohdannaiset, pyrimidiinit, 5,6-dihydrosyklopentaani-' [b]pyridiini, tienyyli, pyridyyli, pyridatsinyyli, tiatso- linyyli, pyratsinyyli, indolinyyli tai indatsolyyli. Kaavan I tai II mukaisten yhdisteiden suoloja ovat esimerkik-35 si sinkin suolat, ammoniumsuolat tai alkali- tai maa-alka- ·· « · 4 103806 limetallien, kuten natriumin, kaliumin, kalsiumin tai magnesiumin suolat. Käsitteellä "DAO-pitoinen katalysaattori" ymmärretään immobilisoituja D-aminohappo-oksidaaseja, puh-distamatonta entsyymiä, permeabilisoituja tai aktivoituja 5 DAO-pitoisia soluja, karkeasti hajotettuina, DAO-pitoisia soluja tai erotettua, puhdistettua DAO:ta. Aktivointi tai permeabilisointi tapahtuu US-patentissa 3 801 458 kuvatulla tavalla tai tunnettujen fysikaalisten tai kemiallisten menetelmien mukaisesti.
10 D-aminohappo-oksidaasia (DAO) voidaan saada lukui sista organismeista, esimerkiksi mikro-organismeista, kasveista, sienistä tai eläinten elimistä, kuten sian munuaisista. Keksinnön mukaisessa menetelmässä on Trigonopsik-sesta valmistettu DAO osoittautunut erityisen sopivaksi. 15 Erityisesti Trigonopsis variabilis CBS 4095:stä peräisin olevaa DAO:ta voidaan käyttää menetelmässä.
DAO: n valmistus Trigonopsis variabiliksesta tapahtuu fermentaation avulla esimerkiksi US-patentissa 3 801 458 kuvatulla tavalla. Solujen kasvatus tapahtuu 20 kompleksisessa elatusaineessa, joka sisältää glukoosia, hiivauutetta, kaliumfosfaattia, muita suoloja ja hivenaineita, sekä metioniinia tai alaniinia typen lähteenä.
DAO voidaan immobilisoida puhtaana entsyyminä, eristettynä raakauutteena, solu-uutteena, grob aufges-25 chlossenen solujen muodossa tai yhdessä muiden entsyymien kanssa. Trigonopsis variabilis -solut voidaan rikkoa esimerkiksi viljelyn jälkeen käyttäen kemiallisia tai fysikaalisia menetelmiä (US-patentti 3 801 458) ja immobilisoida sitten käyttäen tunnettuja menetelmiä.Immobilisointi 30 voi tapahtua esimerkiksi liittämällä polysakkarideihin, kuten esimerkiksi alginaattiin, agariin, kitosaaniin tai karrageeniin, tai liittämällä polymeereihin, kuten akryy-lipolymeeriin, esimerkiksi polyakryyliamideihin tai poly-amiineihin. Ristisidoksia sisältävä polyamiini on edulli-35 sesti di- tai polyaldehydin, kuten glutaraldehydin, kanssa • 5 103806 ristisidottu inertti proteiini, kuten esimerkiksi albumiini tai gelatiini. Samoin voidaan käyttää polysakkarideja, kuten kitiiniä tai kitosaania, jotka on ristisidottu di-tai polyaldehydin tai polyfosfaatin kanssa.
5 DAO:ta sisältävien puhdistettujen, osittain puhdis tettujen tai puhdistamattomien solu-uutteiden immobilisoi-miseksi tulevat kysymykseen esimerkiksi kantajaan sidotut immobilisointimenetelmät. DAO voidaan liittää esimerkiksi kovalentisella sidoksella katalyysille tarpeettoman lysii-10 niryhmän välityksellä polymeeriseen kantajaan. Toinen mahdollisuus on DAO:n adsorptio kantajaan sekä sitä seuraava ristisitominen esimerkiksi glutardialdehydillä.
Entsyymikantajina tulevat kysymykseen polymeeriset, huokoiset kantajat, kuten selluloosat, esim. DEAE- tai CM-15 selluloosat, Sepharoosit, kuten esim. BrCN- tai divinyyli-sulfoniaktivoidut Sepharoosit, amino- tai hydroksyyliryh-miä sisältävät modifioidut polyakryyliamidigeelit tai erilaiset orgaaniset akryyliamidin, metakrylaattien tai met-akryyliamidin ja maleiinihappoanhydridin kopolymerisaatit. 20 Edelleen entsyymikantajina voidaan käyttää myös glysidyy-limetakrylaatin, allyyliglysidyylieetterin, metyleenibis-metyyliakryyliamidin ja metakryyliamidin kopolymeereja, kuten esimerkiksi *Eupergit.
Edullisia entsyymikantajia ovat polyvinyyliesterei-25 hin ja polyvinyylialkoholeihin pohjautuvat DE-hakemusjulkaisun 3 344 912 mukaiset ristisidotut polymeerit. Liittä-misreaktio DAO:n ja entsyymikantajan välillä tapahtuu tunnetulla tavalla, suunnilleen, kuten on kuvattu julkaisussa DE 2 215 687. Enimmäkseen reaktio tapahtuu huoneenlämpöti-30 lassa tai +40 °C:ssa tai sen alapuolella olevissa lämpötiloissa, erityisesti lämpötiloissa, jotka ovat +10 °C:n alapuolella, edullisesti 0 - 5 °C:ssa.
Liittämisreaktio tapahtuu edullisesti ympäristössä, jonka pH on neutraali, esimerkiksi pH-arvoissa 5 - 9. 35 Yleensä ei ole myöskään välttämätöntä käyttää vahvasti 6 103806 happamia tai aikalisiä olosuhteita, koska makrohuokoiset helmipolymerisaatit reagoivat nopeasti DAO:n kanssa myös jo neutraalialueella. Tällöin muodostuva sidos on riittävän stabiili pitkää säilytystä varten ja sillä on korkea 5 toimintastabiilisuus.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä edetään parhaiten siten, että DAO-pitoisella katalysaattorilla täytetään yksi, kaksi tai useampia reaktioastioita, jotka on liitetty toisiinsa ja johdetaan substraattia jatkuvasti reaktioas-10 tian tai reaktioastioiden läpi. Astiat ovat inerttiä materiaalia, joka ei reagoi substraattien ja tuotteiden kanssa. Astiat ovat esim. sekoitusastioita, kuplituskolonneja tai silmukkareaktoreita ja ne voivat olla ympäröityjä jäähdytys/lämmitysvaipalla. Astioissa on sisään- ja ulos-15 tuloaukot substraatti- ja tuotevirralle ja ne on siten järjestetty, että reaktioastiassa voidaan saada aikaan hyvä sekoitus. Astiat voivat olla varustettuja lisäaukolla hapelle tai happipitoiselle kaasuseokselle, esim. ilmalle, 02:lla rikastetulle ilmalle tai happea sisältäville typpi/ 20 happiseoksille. Mahdollisesti reaktioliuosta voidaan sekoittaa sekoittajan avulla. Reaktioastiat varustetaan vastaavalla pidätysjärjestelmällä, kuten esim. sintterillä, membraanilla tai suodatinseulalla, jonka läpäisevyys valitaan siten, että DAO-pitoisen katalysaattorin poisvirtaa-25 minen pitkälle estetään. Reaktioastiat on varustettu myös vastaavilla aukoilla, jotta käyttämättömän kaasun poistaminen on mahdollista. Reaktioastioissa on lisäksi mitta-paikkoja reaktion kulun seuraamista varten, esim. pH-arvon tai happiosapaineen mittaamista varten.
30 Substraattiliuos pumpataan ensimmäiseen reaktioas- tiaan. Tässä tapahtuu DAO:n katalysoima kefalosporiinijohdannaisten reaktio hapen kanssa vastaavaksi a-ketoadipi-nyyli-7-aminokefalosporiinijohdannaiseksi, ammoniakiksi ja vetyperoksidiksi. Muodostuneet tuotteet ja vielä reagoi-35 mattomat kefalosporiinijohdannaiset pumpataan seuraavaan 7 103806 reaktioastiaan. Tätä menetelmätapaa toistetaan, kunnes kefalosporiinijohdannaiset ovat pitkälti reagoineet. Edelleen tapahtuu reaktioastioissa muodostuneen vetyperoksidin j a a-ketoadipinyyli-7-aminokefalosporaanihappoj ohdannai-5 sen (KA-7-ACS) välillä oksidatiivinen dekarboksylaatio glutaryyli-7-aminokefalosporaanihapoksi. Mikäli reaktio KA-7-ACS:ksi ei ole täydellinen, voidaan seuraavaksi järjestetyssä reaktioastiassa annostella vetyperoksidia kontrolloidusti siten, että reaktio menee lähes täydellisesti 10 G-7-ACS:ksi. Vetyperoksidia lisäämällä muutetaan redoxpo-tentiaalia reaktioastiassa. Jatkuvassa käytössä voidaan täydelliseen reaktioon tarvittava vetyperoksidipitoisuus mitata redoxelektrodin avulla ja pitää vakiona lisäämällä vetyperoksidia vastaavan kontrollilaitteiston kautta. Tätä 15 menetelmätapaa käyttäen vältetään yliannostus, joka muutoin voi johtaa sivureaktioihin, kuten esimerkiksi rikin hapettumiseen.
Kefalosporiinijohdannaisten lisääminen reaktioseok-seen voi tapahtua kiinteässä muodossa tai liuoksena vedes-20 sä mahdollisesti yhdessä lisäpuskurikomponenttien kanssa. Kefalosporiinijohdannaisten konsentraatio voi vaihdella laajoissa rajoissa, esimerkiksi välillä 0,001 ja l M, edullisesti välillä 0,01 ja 0,1 M. Lisätty happimäärä voi olla välillä 1 ja 500 litraa 02:ta tuntia ja litraa reak-25 tioliuoksen tilavuutta kohti, edullisesti 10 - 100 litraa 02:ta tuntia ja litraa reaktioliuoksen tilavuutta kohti. Käytetty DAO:n konsentraatio on välillä 10 ja 5 000 yksikköä (U) litraa kohti reaktioliuoksen tilavuutta. DAO-pi-toista katalysaattoria käytetään välillä 0,1 ja 95 paino-30 prosenttia, edullisesti 0,5 - 50 %, erityisesti 1 - 20 %.
On edullista käyttää pH-arvoa väliltä 5-9, edullisesti väliltä 6,0 - 8,5. On sitä pätsi tarkoituksenmukaista suorittaa reaktio lämpötila-alueella 4-65 °C, erityisesti 10 - 50 °C:ssa. Edullinen menettelytapa riippuu 103806 kulloinkin käytetystä DAO-pitoisesta katalysaattorista ja voidaan määrittää helposti yksinkertaisilla esikokeilla.
Reaktioliuoksen viipymäaika astiassa voi olla välillä 5 min ja 800 minuuttia, edullisesti 20 - 120 minuut-5 tia. Menetelmä voidaan suorittaa steriileissä tai epäste-riileissä olosuhteissa.
Reaktiotuotteet voidaan muuttaa puhdistuksen jälkeen tai myös puhdistamattomassa muodossa käyttäen tunnettua kemiallista tai entsymaattista reaktiota 7-aminokefa-10 losporaanihapoksi (7-ACS). 7-ACS on lähtösubstraatti monille semisynteettisille antibiooteille.
Seuraavassa keksintöä valaistaan lähemmin esimerkkeihin perustuen. Prosenttitiedot perustuvat painoon. Esimerkki 1
15 Esiviljelmänä viljellään Trigonopsis variabilis CBS
4095:tä seuraavassa elatusliuoksessa: glukoosia 20 g/1 (autoklavoitu erikseen) D,L-metioniinia 4 g/1 (autoklavoitu erikseen) 2 0 KH2P04: ää 2 g/1 K2HP04:ää 0,2 g/1
MgS04 x 7H20: ta 0,5 g/1
CaCl2 x 6H20:ta 0,1 g/1
NaCl:a 0,1 g/1 25 hivenaineliuosta 10 ml vitamiiniliuosta 1 ml (lisätty autoklavoinnin jäl keen) pH 6,0 30 vitamiiniliuos: ’ biotiinia 20 mg/1 tiamiinia 100 mg/1 liuotettu etanoliin (50-prosenttinen) 9 103806 hivenaineliuos: boorihappoa 5 g/1
MnCl2 x 4H20:ta 2 g/1
CuCl2 x 3H20:ta 2 g/1 5 ZnS04 x 7H20:ta 1 g/i
FeClj x 6H20:ta 3,4 g/1 liuotettuna kahdesti tislattuun veteen 1-prosenttisena silrrosteena toimii NaCl-huuhde vinoputkesta OD578nB ollessa 18. Esiviljelyaika on 24 tuntia 10 30 °C:ssa ja 190 rpm:ssä.
Fermentaatio suoritetaan seuraavissa olosuhteissa: Elatusliuos:
Elatusliuos vastaa esiviljelmässä käytettyä, kuitenkin seuraaviin määriin lisättynä: 15 glukoosia 30 g/1 D,L-metioniinia 6 g/1 "Desmophenia 0,1 % (tarpeen mukaan)
Fermentaatio-olosuhteet: 20 siirroste 2,5 - 5 %
lämpötila 28 °C
fermentaatioaika 50 - 60 h DA0:n määritystä varten jäädytetään 0,4 g soluja, mitä seuraa sulattaminen happamassa pH:ssa, esimerkiksi 25 noin pH 3 - 4:ssä; jäädyttäminen voidaan suorittaa alle 4 -10 °C:n lämpötilassa, esim. noin -20°C:ssa. Jäädyttämisen tulisi kestää riittävän kauan, jotta se aiheuttaisi DA0:n vapautumisen soluista, esim. vähintään 1 tunti -20 °C:ssa.
Aktiivisuus määritetään fotometrisesti seuraavia 30 testitarpeita käyttäen: ίο 103806
Liuokset: 1) puskuri 100 mM KPP; pH 7,3; ilmalla kylläs tetty 2) o-fenyylidiamiini 0,02 % H20:ssa 5 3) peroksidaasi 1 mg/ml puskurissa 4) entsyymi optimaalinen: 0,5 - 1,0 yksikköä/ml 5) substraatti 150 mM Na-CPC (100 %) puskurissa
Testin suorittaminen: 10 = 405 nm (maksimi)
= 4020 l/mol*cm = 30 °C
Tilavuudet: Loppukonsentraat iot:
15 1) 2,00 ml 83 mM
2) 0,50 ml 0,0034 % 3) 0,10 ml 0,034 mg/ml 4) 0,05 ml odotetaan 2 min
20 5) 0,03 ml 12,25 mM
2,95 ml
Tuloksen laskeminen: 25 yksiköt = ΔΕ * laimennus * kokonaistilavuus ml min * e * d * näytteen tilavuus
Edellä mainituissa olosuhteissa saavutetaan fer-menttorissa 200 U/l entsyymiaktiivisuus.
3 0 Esimerkki 2
Heterogeenisesti ristisitovan helmikopolymeroinnin suorittamiseksi dispergoitiin liuos, jossa oli 80 g vinyy-liasetaattia, 20 g divinyylietyleenivirtsa-ainetta, 1 g atsoisobutyronitriiliä ja 200 g n-heptanolia liuokseen, 35 jossa oli 0,175 g NaH2P04:ää, 3 g Na2HP04:ää ja 5 g polyvi- 11 103806 nyylipyrrolidonia 500 ml:ssa vettä ja polymeroitiin. Neljän tunnin kuluttua poistettiin liuotin vesihöyrytislauk-sella ja tuote erotettiin. Saanto oli 77,7 g täysin pyöreää ja kirkasta helmipolymeeriä. Keskimääräinen partikke-5 Iin läpimitta oli noin 30 mm (sekoitusnopeus 460 rpm).
Tuotteen ravistustilavuus oli 1,55 ml/g. Saippuoidun tuotteen ravistustilavuus oli 1,54 ml/g, se turposi vedessä 5 ml:ksi/g.
20 g:n hydrolysoitua helmipolymeeriä annettiin tur-10 vota 200 ml:ssa epikloorihydriiniä 24 tuntia huoneenlämpö-tilassa. Sen jälkeen nostettiin lämpötila hitaasti sekoittaen 113 - 115 °C:seen ja pidettiin siinä 4 tuntia.
Jäähdyttämisen jälkeen suodatettiin imusuodatti-men läpi ja sekapolymeeriä sekoitettiin useampaan kertaan 15 kulloinkin 1 tunnin ajan asetonissa. Asetonista kostea sekapolymeeri kuivattiin vakiopainoon vakuumikaapissa 50 °C:ssa. Epoksidiekvivalentti oli 244 [mitattuna Axenin mukaan: Acta Chem. Scan. B 29 (1975) nro 4],
Esimerkki 3 20 100 mg:aan esimerkin 2 mukaisesti valmistettua kan tajaa lisättiin 500 ml DAO-pitoista liuosta (20 U/ml). Entsyymiliuoksen pH:n säätämiseksi arvoon 7,8 lisättiin 1 molaarista kaliumfosfaattipuskuria. Entsyymin kiinnittämisen kesto kantajaan oli 72 tuntia 25 °C:ssa. Sen jälkeen 25 poistettiin DAO, joka ei ollut sitoutunut kantajaan kova-lenttisesti, imusuodattamalla lasisintterin läpi ja jäännös pestiin useampaan kertaan 1 molaarisella natriumklori-diliuoksella ja sitten puskuriliuoksella. Imusuodatuskos-tean materiaalin saanto oli 324 mg. Aktiivisuus mitattiin 30 esimerkissä 1 annetulla tavalla ja se antoi kostealle tuotteelle arvon 18 U/g·
Esimerkki 4
Trigonopsis variabilis CBS 4095 -soluja kasvatetaan esimerkissä 1 annettuissa olosuhteissa ja permeabilisoi-35 daan jäädyttämällä ja sulattamalla. Sen jälkeen sekoite- 12 103806 taan 1 g kosteaa solumassaa 10 ml:n kanssa 1-prosenttista vesipitoista kitosaaniliuosta ja immobilisoidaan lisäämällä seos tipoittain 2-prosenttiseen vesipitoiseen natrium-pöly f osfaattiliuokseen (pH 8,0; 25 °C). Saadaan DAO-aktii-5 visuus, joka on 2,5 U/g kosteaa katalysaattorimassaa.
Esimerkki 5 A. Entsymaattinen reaktio reaktioastiassa DAO immobilisoidaan, kuten esimerkissä 3 on kuvattu ja inkuboidaan kefalosporiini C:n kanssa 1,5 l:n lasias-10 tiassa, joka on varustettu sekoittajalla ja kaksoisvaipal-la. Reaktioparametrit olivat seuraavat:
työskentelytilavuus 1 1 lämpötila 25 °C
15 DAO-konsentraatio 4 % immobilisaattia (esimerkki 3) 720 U/l happea 50 1/h pH-arvo 7,0
kefalosporiini C 30 mM
20 sekoittajan kierrosnopeus 300 rpm reaktioaika 110 min 110 minuutin kuluttua oli 85 % käytetystä kefalo- 25 sporiini C:stä reagoinut. Reaktioliuos erotettiin immobi- lisoidusta DAOrsta ja entsyymi varustettiin tuoreella substraattiliuoksella. 32 tunnin kuluttua oli vähemmän kuin 50 % reaktiosta tapahtunut.
B. Entsymaattinen reaktio kahdessa peräkkäin toi- 30 siinsa liitetyssä reaktioastiassa DAO immobilisoidaan esimerkissä 3 kuvatulla tavalla ja pannaan kahteen 1 l:n lasiastiaan, jotka on varustettu kaksoisvaipalla ja sekoittajalla. Kefalosporiiniliuosta pumpattiin jatkuvasti ensimmäiseen reaktioastiaan ja joh 13 103806 dettiin sieltä toiseen reaktioastiaan. Reaktioparametrit olivat seuraavat: työskentelytilavuus/astia 0,5 1
5 lämpötila 25 °C
DAO-konsentraatio 4 % immobilisaattia (esim. 3) 720 U/l happea 30 1/h pH-arvo 7,0
10 kefalosporiini C 30 mM
sekoittajan kierrosluku 300 rpm viipymäaika/astia 50 min kokonaisviipymäaika 100 min 15 100 minuutin kuluttua oli 85 % käytetystä kefalo sporiini C:stä reagoinut. Katalysaattorin vaihto oli tarpeen vasta 48 tunnin kuluttua, koska silloin vähemmän kuin 85 % kefalosporiinista reagoi.
Taulukossa 1 on esitetty menetelmän A vertailu kek-20 sinnön mukaiseen menetelmään B.
Taulukko 1
menetelmä keksinnön mukainen menetelmä A B
saanto 1,0 1,0 25 katalysaattorin kulutus 1,0 1,5 reaktioaika 1,0 0,9 tila-aika-saanto 1,0 1,1 »

Claims (9)

14 103806
1. Menetelmä kefalosporiinijohdannaisten, joilla on D-5-amino-5-karboksipentaaniamidoryhmä kefalosporiiniren- 5 kaan asemassa 7, saattamiseksi reagoimaan vastaaviksi glu-taryyli-7-aminokefalosporaanihappojohdannaisiksi, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan jatkuvana D-aminohappo-oksidaasipitoisen (E.C.1.4.3.3.) katalysaattorin läsnä ollessa ja sen jälkeen lisätään mahdollisesti 10 vetyperoksidia.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktioliuos johdetaan sekoi-tuskattilakaskadin kautta.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että käytetään sienistä peräisin olevaa D-aminohappo-oksidaasia.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kefalosporiinijohdannaiset, joilla on kaava II 20 COOH S H2N-CH- (CH2)3CONH-1-{ | (II) Ij— Νγ^ΟΗ2Χ COOH 25 jossa X tarkoittaa asetaattiryhmää, nukleo f i i1i ryhmää, heterosykliä, hydroksiryhmää tai 30 vetyä, sekä niiden suoloja, saatetaan reagoimaan yhdisteiksi, joilla on kaava I R- (CH?) -jCONH-1 fV-·»*'
35. I COOH 15 103806 jossa X:llä on edellä mainittu merkitys, R on karboksiryhmä tai ketokarboksiryhmä, sekä niiden suoloiksi.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me- 5 netelmä, tunnettu siitä, että D-aminohappo-oksi- daasi immobilisoidaan polysakkaridien kanssa.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me- 5 netelmä, tunnettu siitä, että D-aminohappo-oksi- daasi immobilisoidaan polysakkaridien kanssa.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään alginaattia, kar-rageenia tai kitosaania.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään alginaattia, kar-rageenia tai kitosaania.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään entsyy- mikantajaa, joka on polyvinyyliesterin ja polyvinyylialko-holin tai glysidyylimetakrylaatin, allyyliglysidyylieette-rin, metyyliakryyliamidin ja metyleenibismetakryyliamidin 15 kopolymerisaattia.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että käytetään entsyy-mikantajaa, joka on polyvinyyliesterin ja polyvinyylialko-holin tai glysidyylimetakrylaatin, allyyliglysidyylieette-rin, metyyliakryyliamidin ja metyleenibismetakryyliamidin 15 kopolymerisaattia.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään aktivoituja tai permeabilisoituja D-aminohappo-oksidaasia sisäl täviä soluja.
8. Jonkin patentivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään aktivoi tuja tai permeabilisoituja D-aminohappo-oksidaasia sisältäviä soluja.
9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vetyperoksidin li säys tapahtuu jatkuvana. 15 103806 jossa X:llä on edellä mainittu merkitys, R on karboksiryhmä tai ketokarboksiryhmä, sekä niiden suoloiksi.
9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vetyperoksidin li säys tapahtuu jatkuvana. 1C 103806 16
FI914149A 1990-09-05 1991-09-03 Menetelmä kefalosporiinijohdannaisten saattamiseksi jatkuvatoimisesti reagoimaan glutaryyli-7-aminokefalosporiinihappojohdannaisiksi FI103806B1 (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4028119A DE4028119C1 (fi) 1990-09-05 1990-09-05
DE4028119 1990-09-05

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI914149A0 FI914149A0 (fi) 1991-09-03
FI914149A FI914149A (fi) 1992-03-06
FI103806B true FI103806B (fi) 1999-09-30
FI103806B1 FI103806B1 (fi) 1999-09-30

Family

ID=6413630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI914149A FI103806B1 (fi) 1990-09-05 1991-09-03 Menetelmä kefalosporiinijohdannaisten saattamiseksi jatkuvatoimisesti reagoimaan glutaryyli-7-aminokefalosporiinihappojohdannaisiksi

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5284754A (fi)
EP (1) EP0474211B1 (fi)
JP (1) JP3117092B2 (fi)
KR (1) KR920006509A (fi)
AT (1) ATE133204T1 (fi)
AU (1) AU646285B2 (fi)
CA (1) CA2050615A1 (fi)
DE (2) DE4028119C1 (fi)
DK (1) DK0474211T3 (fi)
ES (1) ES2083495T3 (fi)
FI (1) FI103806B1 (fi)
GR (1) GR3018713T3 (fi)
IE (1) IE70755B1 (fi)
IL (1) IL99382A (fi)
NO (1) NO180594C (fi)
NZ (1) NZ239651A (fi)
PT (1) PT98863B (fi)
ZA (1) ZA917004B (fi)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW198064B (fi) * 1990-12-24 1993-01-11 Hoechst Ag
IT1247964B (it) * 1991-06-03 1995-01-05 Ministero Dell Uni E Della Processo per la preparazione enzimatica di derivati cefalosporanici
CA2100987C (en) * 1992-07-27 1999-06-15 Kaoru Furuya A transformant capable of producing d-amino acid oxidase
ES2097080B1 (es) * 1993-03-08 1997-11-16 Asahi Chemical Ind Procedimiento para la conversion de cefalosporina c en acido glutaril-7-aminocefalosporanico.
US5597704A (en) * 1995-05-01 1997-01-28 Food Industry Research And Development Institute Bioconversion of cephalosporin C to glutaryl-7-aminocephalosporanic acid
US6051411A (en) * 1996-09-20 2000-04-18 National Research Council Of Canada Microorganisms immobilized in chitosan crosslinked with lignosulphonate for purification of waste water
CN1174096C (zh) * 1997-09-09 2004-11-03 生物化学有限公司 来自具有酶活性的微生物的球形颗粒,其制备方法及应用
EP1375649B1 (en) * 2002-06-19 2012-03-07 Evonik Degussa GmbH D-amino acid oxidase from Arthrobacter protophormiae
KR100650207B1 (ko) * 2005-07-29 2006-11-27 종근당바이오 주식회사 글루타릴 7-아미노-3-비닐-세팔로스포란산 유도체와 이의 제조방법

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1272769A (en) * 1968-08-02 1972-05-03 Glaxo Lab Ltd Improvements in or relating to cephalosporin derivatives
GB1385685A (en) * 1971-04-21 1975-02-26 Glaxo Lab Ltd Cephalosporin derivatives
DE2215687C3 (de) * 1972-03-30 1980-12-11 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Neue wasserunlösliche Proteinpräparate
US4579818A (en) * 1983-06-27 1986-04-01 Queen's University At Kingston Biosynthesis of unnatural cephalosporins
DE3344912A1 (de) * 1983-12-13 1985-06-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Vernetzte polymerisate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung
ATE123533T1 (de) * 1989-04-04 1995-06-15 Biopure Corp Enzymatisches verfahren zur herstellung von 7- aminocephalosporansäure.
DK0409521T3 (da) * 1989-07-19 1996-02-05 Lilly Co Eli Forbedret enzymatisk oxidation af Ceph C til glutaryl-7-aminocephalosporansyre

Also Published As

Publication number Publication date
DE59107275D1 (de) 1996-02-29
PT98863A (pt) 1992-07-31
PT98863B (pt) 1999-02-26
IL99382A (en) 1995-03-30
NO180594C (no) 1997-05-14
DE4028119C1 (fi) 1991-12-05
ZA917004B (en) 1992-04-29
EP0474211B1 (de) 1996-01-17
NO913475L (no) 1992-03-06
IE70755B1 (en) 1996-12-30
AU8356691A (en) 1992-03-12
ES2083495T3 (es) 1996-04-16
CA2050615A1 (en) 1992-03-06
US5284754A (en) 1994-02-08
FI914149A0 (fi) 1991-09-03
JP3117092B2 (ja) 2000-12-11
NO913475D0 (no) 1991-09-04
FI103806B1 (fi) 1999-09-30
EP0474211A2 (de) 1992-03-11
ATE133204T1 (de) 1996-02-15
NZ239651A (en) 1994-01-26
AU646285B2 (en) 1994-02-17
NO180594B (no) 1997-02-03
JPH04229190A (ja) 1992-08-18
EP0474211A3 (en) 1992-08-12
IL99382A0 (en) 1992-08-18
IE913116A1 (en) 1992-03-11
FI914149A (fi) 1992-03-06
DK0474211T3 (da) 1996-05-20
GR3018713T3 (en) 1996-04-30
KR920006509A (ko) 1992-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4486549A (en) Process for preparing an amino group-containing polyacrylonitrile polymer
Chibata et al. Use of immobilized cells
US4326031A (en) Process for the continuous enzymatic change of water soluble α-ketocarboxylic acids into the corresponding α-hydroxycarboxylic acids
ABBOTT Immobilized cells
CA1153965A (en) Immobilization of biocatalysts
CN112662656B (zh) 酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法
FI103806B (fi) Menetelmä kefalosporiinijohdannaisten saattamiseksi jatkuvatoimisesti reagoimaan glutaryyli-7-aminokefalosporiinihappojohdannaisiksi
US3706633A (en) Preparation of water-insoluble enzyme derivatives
Harbron et al. Two-liquid phase biocatalysis: epoxidation of 1, 7-octadiene by Pseudomonas putida
CN112662658A (zh) 固定化重组大肠杆菌利用l-苯丙氨酸生产l-苯丙酮酸
CA1215336A (en) Immobilization of catalytically active microorganisms in agar gel fibers
Kennedy et al. Immobilisation of biocatalysts by metal-link/chelation processes
CA1284464C (en) D(-)-mandelate dehydrogenase produced microbiologically, a process for its production and application thereof
CA1298800C (en) Immobilized enzyme preparation and its use
US5599702A (en) D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis immobilized on porous copolymer beads
EP0032987A1 (en) Thermophilic aspartase, processes for producing, culture used, and L-aspartic acid preparation process using the same
JPS5974984A (ja) 固定化酵素もしくは固定化微生物の製造方法
US3860486A (en) Insolubilizing enzymes with polystyrene derivatives
Powell Immobilized biocatalyst technology
JPH0155879B2 (fi)
JPH03247293A (ja) 吸水性高分子量物質の製造法
US20240182884A1 (en) Enzyme Immobilization Carrier and Preparation Method thereof, Immobilized Enzyme and Preparation Method thereof
CN117625572A (zh) 一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法及应用
JP2588707B2 (ja) サルコシン・オキシダーゼの製造法
RU2420581C1 (ru) Способ получения биокатализатора, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот