CN117625572A - 一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶催化技术领域，具体涉及一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法及应用。本发明所提供的制备方法，通过利用2‑甲基咪唑和金属盐分别制备A液和B液，并将半乳糖氧化酶先与A液混合，然后加入交联剂，最后与B液混合等一系列操作制得金属有机骨架材料固定化半乳糖氧化酶，所得固定化半乳糖氧化酶稳定性好，可以回收重复使用，在使用过程中对酶损伤小，在重复使用10批次后酶活仍能够达到最初批次酶活的87%。
Description
技术领域
本发明属于酶催化技术领域，具体涉及一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法及应用。
背景技术
半乳糖氧化酶（GOase）是蛋白分子量为65~68kDa的一种铜基酶，可以氧化各种新型的寡糖、低聚和多聚糖类衍生物，并通常被用于检测半乳糖及其衍生物；根据半乳糖氧化酶开发出的M3-5型半乳糖氧化酶突变体可以选择性氧化（R）二级苄醇生成对应的醛，并能够再进行二次氧化继续氧化成酸，即，半乳糖氧化酶既具有醇氧化酶的功能又具有醛氧化酶的功能，在化学合成领域发挥着重要作用。
但是，游离的半乳糖氧化酶具有易失活、难以重复使用、与底物结合不牢靠、稳定性差的缺陷，大大限制了酶的应用。固定化半乳糖氧化酶与游离半乳糖氧化酶相比具有可重复利用、与底物结合能力强、易于产物分离等优点，在一定程度上可以提高酶的性能。
现有技术中也有固定化半乳糖氧化酶的相关披露，如有专利文献曾公开了固定化半乳糖氧化酶的方法，其并未对现有半乳糖氧化酶所存在的稳定性差、易失活、难以重复利用等缺陷给出相应的解决措施。
金属有机框架材料（MOF）是一种通过共价键（网状合成）将含金属节点(二级构建单元)与刚性有机连接体连接起来构建的一种新兴功能材料，因其是由金属中心与有机配体组成的多孔晶体结构材料，具有结构灵活、比表面积大以及孔径可调等优点，被认为是酶固定化的理想材料；若能以金属有机框架材料为载体制备固定化半乳糖氧化酶，或可解决现有技术中存在的上述问题。并且通过检索，也并未发现有将金属有机框架材料作为载体应用于制备固定化半乳糖氧化酶中的案例；但是，上述的应用是否能达到相应的技术效果，并没有相应的文献记载。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，以金属有机框架材料为载体制备固定化半乳糖氧化酶，制备方法简便易行，无需加热等操作，得到的固定化半乳糖氧化酶的稳定性好，可以回收重复使用。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，所述方法包括以下步骤：
S1：将2-甲基咪唑溶于去离子水中，调节pH至4~9，得到A液，待用；
S2：将金属盐溶于去离子水中，得到B液，待用；
S3：将半乳糖氧化酶粗酶液加入到S1中的A液中，搅拌混合均匀后加入交联剂并进行搅拌，得混合溶液，待用；
S4：向S3所得混合溶液中加入S2所得B液，静置，离心后收集沉淀并洗涤，得到金属有机骨架材料固定化半乳糖氧化酶。
其中，S1中，调节2-甲基咪唑溶液pH所用的酸为盐酸、硫酸、醋酸中的任意一种；优选为醋酸或硫酸；更优选为醋酸。
其中，S1中，将2-甲基咪唑溶液调节pH至6~8；优选为7。
其中，S2中的金属盐中金属离子为铜离子、锌离子、锰离子和铬离子中的至少一种；优选为铜离子或锰离子；更优选为铜离子。
其中，S2中的金属盐为铜离子、锌离子、锰离子和铬离子中任意一种的相对应盐；优选为铜盐；更优选为硫酸铜或氯化铜。
其中，S2中，金属盐中金属离子的摩尔浓度为0.03~0.05 mol/L；优选为0.04 mol/L。
其中，S3中所述交联剂为戊二醛、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、乙二醛、环氧氯丙烷中的任一种；优选为戊二醛。
其中，S3中所述半乳糖氧化酶粗酶液的制备方法如下为：
将携带半乳糖氧化酶基因的大肠杆菌工程菌进行活化，活化后接入无菌LB液体培养基中进行培养，获得蛋白表达种子菌液；将蛋白表达种子菌液接种入无菌TB液体培养基中进行培养；待OD600=0.6-0.8时，加入终浓度为0.1 mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导培养20h，收集菌体，菌体经超声破碎离心后取上清即得半乳糖氧化酶粗酶液。
其中，S3中，半乳糖氧化酶粗酶液和A液的体积比为1:2~2:1；优选为1:1；S3中A液与半乳糖氧化酶粗酶液混合后，混合溶液中2-甲基咪唑的摩尔终浓度为0.08~0.24 mol/L，酶液的终浓度为0.5~10 mg/mL，交联剂终浓度（v/v）为0.1%~1%；优选的，混合溶液中2-甲基咪唑的摩尔终浓度为0.12~0.20 mol/L，酶液的终浓度为0.5~5 mg/mL，交联剂终浓度为0.1%~0.5%；更优选的，混合溶液中2-甲基咪唑的摩尔终浓度为0.16 mol/L，酶液的终浓度为1 mg/mL，交联剂终浓度为0.1%。
其中，S4中，S3所得混合溶液与S2所得B液混合后的溶液中2-甲基咪唑和金属盐在体系中的摩尔终浓度比为2:1~8:1；优选为1.5:1~6:1；更优选为4:1。
其中，S4中，混合溶液和B液体积比为1:2~2:1；优选为1:1。
其中，S3中，两次搅拌时间均为 2~60min；优选的，两次搅拌时间均为5~30min；更优选的，两次搅拌时间均为10min。
其中，S4中，所述静置条件为：温度4~40℃，时间为0.5~6h；优选的，静置温度为20~30℃，时间为0.5~3h；更优选的，静置温度为25℃，时间为0.5h。
其中，S4中，所述离心条件为：转速6000~12000rpm，离心时间为8~16min；优选为转速8000 rpm，离心时间为8 min。
其中，反应体系的加样顺序如下：GOase酶液加入到A液中，然后加入交联剂，最后加入B液，加样顺序决定着反应效果，经探究发现只有上述加样顺序才能实现固定化半乳糖氧化酶稳定性好、可以重复使用的效果。
本发明的第二方面，提供了一种使用上述方法制备的固定化半乳糖氧化酶在氧化醇和醛中的应用；优选的，所述应用为合成呋喃酮酸。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明所制备的固定化半乳糖氧化酶稳定性好，可以回收重复使用，在使用过程中对酶活损伤小，在重复使用10批次后酶活仍能够达到最初批次酶活的87%，说明其稳定性优异，也说明通过本发明的方法解决了现有技术中易失活、难以重复使用、稳定性差的问题；
（2）本发明提供的制备方法简便易行，只需要将两种试剂依次加入酶液中搅拌均匀后静置离心，就能得到金属有机框架固定化半乳糖氧化酶，整个过程在常温条件下进行，无需加热等操作，减少了加热等其他操作所产生的成本，具有较高的经济价值和实用价值。
附图说明
图1 为2-甲基咪唑和半乳糖氧化酶粗酶液的混合溶液中2-甲基咪唑浓度变化与酶活的关系；
图2为Cu2+浓度变化与酶活的关系；
图3为本发明中的游离半乳糖氧化酶与固定化半乳糖氧化酶的酶活比较；
图4为本发明中的固定化半乳糖氧化酶的重复批次稳定性。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
实施例1
实施例1-1 半乳糖氧化酶粗酶液的制备
将携带半乳糖氧化酶基因的大肠杆菌工程菌进行活化，活化后接入50mL无菌LB液体培养基中，卡那霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200rpm培养3h，获得蛋白表达种子菌液；将10mL蛋白表达种子菌液接种入350 mL无菌TB液体培养基中，卡那霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200rpm；待OD600=0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃，180rpm诱导培养20h，收集菌体经超声破碎后离心取上清即得半乳糖氧化酶粗酶液。
LB（Luria-Bertani）液体培养基：称取NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L和酵母粉5g/L溶于1L蒸馏水中，121°C灭菌 20 min；
TB（Terrific-Broth）液体培养基：在1L蒸馏水中溶解12g胰蛋白胨、24g YEASTEXTRACT（酵母提取物）、4mL丙三醇、16g K2HPO4·3H2O和2.3g KH2PO4，不调节pH值，121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例1-2 制备固定化半乳糖氧化酶
配置5mL摩尔浓度为320mM的2-甲基咪唑溶液，并将pH值调至7；将1mg/mL 的半乳糖氧化酶粗酶液5mL加入至配置好的2-甲基咪唑溶液中，搅拌10分钟使其混合均匀，使得混合后2-甲基咪唑摩尔浓度为160mM；然后，将准备好的戊二醛溶液加入至2-甲基咪唑和粗酶液的混合液中，使戊二醛终浓度比为0.1%，v/v；搅拌10分钟，充分混匀。最后，加入10mL摩尔浓度为40mM的硫酸铜溶液，静置30分钟，离心，收集沉淀并洗涤，即得固定化半乳糖氧化酶。
实施例2 2-甲基咪唑浓度的探究
分别配置5mL不同摩尔浓度的2-甲基咪唑溶液，并将pH值调至7；将5mL的1mg/mL半乳糖氧化酶粗酶液加入至配置好的2-甲基咪唑溶液中，搅拌10分钟使其混合均匀，使得混合后2-甲基咪唑摩尔浓度分别为80、120、160、200、240mM；将准备好的戊二醛溶液加入至2-甲基咪唑和粗酶液混合液中，使戊二醛终浓度比为0.1%，v/v；搅拌10分钟，充分混匀。最后，加入10mL摩尔浓度为40mM的硫酸铜溶液，静置30分钟，离心，收集沉淀并洗涤，配置完成后测定2-甲基咪唑和半乳糖氧化酶粗酶液的混合溶液中不同2-甲基咪唑浓度下固定化酶的相对活性，结果如图1和表1所示。
表1 2-甲基咪唑和半乳糖氧化酶粗酶液的混合溶液中不同2-甲基咪唑浓度下固定化酶的相对活性
| 2-甲基咪唑浓度/mM | 固定化酶相对活性 |
| 80 | 91.74% |
| 120 | 96.80% |
| 160 | 100.00% |
| 200 | 95.64% |
| 240 | 93.31% |
实施例3 金属离子浓度的探究
配置5mL摩尔浓度为320mM的2-甲基咪唑溶液，并将pH值调至7；将5mL的1mg/mL半乳糖氧化酶粗酶液加入至配置好的2-甲基咪唑溶液中，搅拌10分钟使其混合均匀，使得混合后2-甲基咪唑摩尔浓度为160mM；然后，将准备好的戊二醛溶液加入至2-甲基咪唑和粗酶液混合液中，使戊二醛终浓度比为0.1%，v/v；搅拌10分钟，充分混匀。最后，加入10mL摩尔浓度分别为20、30、40、50和60mM的硫酸铜溶液，静置30分钟，离心，收集沉淀并洗涤，配置完成后测定Cu2+浓度变化与酶活的关系，结果如图2和表2所示。
表2 Cu2+浓度变化与酶活的关系
| Cu2+浓度 | 固定化酶相对活性 |
| 20 | 80.74% |
| 30 | 92.80% |
| 40 | 100.00% |
| 50 | 98.64% |
| 60 | 96.31% |
实施例4 固定化半乳糖氧化酶合成呋喃酮酸
（1）设置反应体系为20mL，向pH7.0的PB缓冲液中加入固定化半乳糖氧化酶或半乳糖氧化酶粗酶液；
（2）向（1）所得溶液中加入过氧化氢酶、辣根过氧化物酶和Cu2+混合均匀，待用；
（3）向（2）所得溶液中加入终浓度为10 mM的底物2-呋喃基羟基甲基酮，放入摇床中200rpm、25℃，反应30min；
（4）到达反应时间后，取样终止反应，采用HPLC监测样品中各物质浓度。
试验例 检测固定化半乳糖氧化酶相对酶活和重复批次稳定性
反应体系参照实施例2，使用半乳糖氧化酶进行合成呋喃酮酸反应，并将所用的半乳糖氧化酶重复使用10个批次，记录每个批次的酶活。具体原理为：
氧化酶会把2-呋喃基羟基甲基酮先氧化为呋喃酮醛，之后在氧化为呋喃酮酸，这两步都会消耗氧气，统合终产物呋喃酮酸和中间产物呋喃酮醛，计算消耗的氧气浓度，来计算酶活。酶活定义1U为在25℃下，每分钟消耗1μmol氧气所需的酶量。
图3和表3为固定化半乳糖氧化酶与游离的半乳糖氧化酶粗酶液酶活比较，可以看出半乳糖氧化酶在固定化之后，酶活几乎没有损失。
表3 游离半乳糖氧化酶与固定化半乳糖氧化酶的酶活比较
图4和表4为记录10个批次的固定化半乳糖氧化酶酶活变化，可以看出，在使用10次后固定化半乳糖氧化酶的活性还保持在87%；因此，该固定化半乳糖氧化酶具有良好的重复批次稳定性。
表4 固定化半乳糖氧化酶的重复批次稳定性
Claims (10)
1.一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：将2-甲基咪唑溶于去离子水中，调节pH至4~9，得到A液，待用；
S2：将金属盐溶于去离子水中，得到B液，待用；
S3：将半乳糖氧化酶粗酶液加入到S1中的A液中，搅拌使之混合均匀，然后加入交联剂，再次搅拌，得混合溶液，待用；
S4：向S3所得混合溶液中加入S2所得B液，静置，离心后收集沉淀并洗涤，得到金属有机骨架材料固定化半乳糖氧化酶。
2.如权利要求1所述的一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，其特征在于，S2中，所述金属盐中的金属离子选自铜离子、锌离子、锰离子和铬离子中的至少一种。
3.如权利要求1所述的一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，其特征在于，S2中，所述金属盐中金属离子的摩尔浓度为0.03~0.05 mol/L。
4.如权利要求1所述的一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，其特征在于，S3中所述半乳糖氧化酶粗酶液的制备方法如下为：
将携带半乳糖氧化酶基因的大肠杆菌工程菌进行活化，活化后接入无菌LB液体培养基中进行培养，获得蛋白表达种子菌液；将蛋白表达种子菌液接种入无菌TB液体培养基中进行培养；待OD600=0.6~0.8时，加入终浓度为0.1 mM的IPTG诱导培养20h，收集菌体，菌体经超声破碎离心后取上清即得半乳糖氧化酶粗酶液。
5.如权利要求1所述的一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，其特征在于，S3中，所述交联剂选自戊二醛、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、乙二醛、环氧氯丙烷中的任意一种。
6.如权利要求1所述的一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，其特征在于，S3中，半乳糖氧化酶粗酶液和A液的体积比为1:2~2:1。
7.如权利要求1所述的一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，其特征在于，S3中，A液与半乳糖氧化酶粗酶液混合后，混合溶液中2-甲基咪唑的摩尔终浓度为0.08~0.24 mol/L，半乳糖氧化酶粗酶液的终浓度为0.5~10 mg/mL，交联剂的终浓度为0.1~1%，v/v；两次搅拌时间均为 2~60min。
8.如权利要求1所述的一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，其特征在于，S4中，S3所得混合溶液与S2所得B液混合后的溶液中2-甲基咪唑和金属盐中的金属离子在体系中的摩尔终浓度比为2:1~8:1。
9.如权利要求1所述的一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法，其特征在于，S4中，所述静置条件为：温度4~40℃，时间为0.5~6h；所述离心条件为：转速6000~12000rpm，离心时间为8~16min。
10.由权利要求1-9任一项所述制备固定化半乳糖氧化酶的方法制得的固定化半乳糖氧化酶在氧化醇和醛中的应用。
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