CN114958818A - 一种金属有机骨架材料固定化酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金属有机骨架材料固定化酶的制备方法及其应用。采用一锅合成法，将一定浓度的天冬氨酸转氨酶(ASPC)、支链氨基酸转氨酶(BCAT)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氨基酸、金属源和有机配体溶液，于室温下混合，振摇反应一段时间后，离心，所得沉淀即为金属有机骨架材料固定化酶。此步骤操作简单、原料易得、反应条件温和、绿色，有效保留了酶的优良催化活性。应用该固定化酶催化合成手性非天然氨基酸，呈现出材料稳定性高，对极端的pH、温度以及有机溶剂耐受，容易与反应液分离，且重复使用率高的优势。本发明为酶催化不对称合成关键手性化合物提供了一种绿色、高效的手段。
Description
技术领域
本发明属于生物酶催化剂和材料制备技术领域，具体涉及金属有机骨架材料固定化两种转氨酶的制备方法及其在不对称合成非天然氨基酸中的应用。
背景技术
近年来以酶为催化剂的绿色合成体系一直以来受到人们的广泛关注，已逐渐代替常规化学催化，成为有机合成中最常用的方法之一。酶催化反应一般在室温、中性、水相等温和的条件下进行，耗能少，反应产物单纯，易于分离和纯化。然而，以全细胞或者溶液形式参与催化反应的酶，存在热稳定性、pH稳定性、可重复使用性差等缺点，因此，将酶固定于一定功能材料上，即将酶分子附着或包埋在不溶于反应溶剂的固相载体上，使酶催化反应体系由均相反应体系转变为非均相反应体系，有利于催化剂的固液分离，有望实现酶的重复利用。金属有机骨架(metal organic frameworks，MOFs)材料是由金属离子和有机配体通过配位键连接而成，具有孔隙率高、比表面积大、孔径可调等优点，故成为良好的固定化酶载体，可有效改善酶对高温、极端pH、有机溶剂等恶劣条件的耐受能力，提高可重复利用性。
中国专利中已经出现将MOFs材料作为载体固定化酶，常见的固定方式主要分为物理吸附法和原位包酶法，例如专利201910593104.0、202011354356.7、201910265870.4、202010363871.5、202110312318.3等均采用物理吸附法，即先合成完整的材料，后将材料与酶溶液混合实现酶的固定，这种方法对材料的比表面积、孔径等性能有较高要求，并且材料中装载的酶易在应用过程中发生脱落使得重复使用性差，此外许多材料的制备还涉及高温条件和有机溶剂，有违可持续发展目标。原位包酶法也是常见的固定化酶方法，即在材料合成的过程中掺入酶，该方法操作简单，但要求材料的合成条件须温和而不损伤酶活性，然而专利202010557875.7的合成体系中包含有机溶剂二甲基甲酰胺，对许多天然酶不利，专利202111235409.8将固定化酶置于酸中进行刻蚀，该方法不适于不耐酸的酶，专利201811550027.2的固定化酶方法中涉及高温(80～100℃)，易使酶变性失活。综上可见，上述专利中存在固定化酶的重复使用率低，固定化酶的制备条件过于苛刻，比如涉及高温、有机溶剂、酸性条件等，这样的制备条件将不利于保持酶的原有活性，也不能满足大多数酶的固定化需求，这些问题如不解决，将会大大降低此类酶固定化方法的实际应用能力。
本发明旨在提供一种在温和的室温水相条件下，将酶与形成金属有机骨架材料的金属离子以及有机配体混合，一锅法制备金属有机骨架材料固定化酶的策略，与游离酶相比，所得固定化酶可有效提高酶的活性和稳定性，重复使用十次以上仍能有效保持游离酶近100％的活性，同时，该固定化酶方法因制备条件温和，适用于固定化任何一种蛋白酶催化剂。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种金属有机骨架材料固定化酶及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种金属有机骨架材料固定化酶的制备方法。
所述制备方法为：
S1：将天冬氨酸转氨酶和支链氨基酸转氨酶溶于PBS缓冲液，搅拌均匀后加入有机配体和金属源溶液，获得合成反应体系；优选的，S1还包括加入PVP和/或氨基酸；
S2：将合成反应体系搅拌反应，分离获得产物；
S3：用洗涤剂洗涤，得到金属有机骨架材料固定化酶。
进一步的，S1中所述天冬氨酸转氨酶和支链氨基酸转氨酶质量比为10:1～1:100，所述天冬氨酸转氨酶和支链氨基酸转氨酶在合成反应体系中的总浓度为1～20mg/ml。
进一步的，S1中所述氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、半胱氨酸；所述氨基酸在合成反应体系中的终浓度为0～15mM；优选的，所述氨基酸在合成反应体系中的终浓度为2.2～12.7mM；进一步优选的，所述氨基酸在合成反应体系中的终浓度为10.6mM。
进一步的，S1中所述PVP在合成反应体系中的终浓度为0～12.5mg/ml；优选的，所述PVP在合成反应体系中的终浓度为4.3～11.6mg/ml；进一步优选的，所述PVP在合成反应体系中的终浓度为4.3mg/ml。
进一步的，S1中所述有机配体选自对苯二甲酸钠盐、均苯三甲酸钠盐或2-氨基对苯二甲酸钠盐。
进一步的，S1中所述金属源选自钙、锌、钴、镍的盐，溶剂为超纯水；金属源在合成反应体系中的终浓度为5～100mM；所述金属源和有机配体的摩尔比为1:1～1:100。
进一步的，S2中所述搅拌反应温度为4℃或室温，搅拌反应时间为15min～4h；所述分离为离心分离，优选的，所述离心分离的转速为6000～12000rpm。
进一步的，S3中所述洗涤剂或溶剂选自超纯水或PBS缓冲液。
本发明的第二个目的是提供采用上述金属有机骨架材料固定化酶的制备方法制备得到的金属有机骨架材料固定化酶。
本发明的第三个目的是提供所述金属有机骨架材料固定化酶在不对称合成非天然氨基酸中的应用。
进一步的，所述应用为将金属有机骨架材料固定化酶均匀分散于底物溶液中，所述底物溶液包含氨基酸、酮酸、辅酶，获得混合物，将所述混合物振荡孵育，分离获得所述非天然氨基酸。
进一步的，孵育温度为37℃，振荡转速为100～200rpm，孵育时间为2～48h。
有益效果：
(1)本发明将双酶联用和金属有机骨架材料固定化酶相结合，可实现非天然氨基酸的高效催化合成以及固定化酶的简单快速回收。
(2)本发明采用钠盐配体，解决了部分配体在水相体系中溶解性差导致与金属源结合效率低的问题，成钠盐后的配体能够以PBS缓冲液为溶剂，使固定化酶的环境pH更温和。此外，钠盐配体与金属源在常温下便可反应，结合速率快，对酶损伤小，有利于保持其活性。
(3)本发明还凭借PVP和氨基酸协助酶在金属有机骨架材料中的封装，达到增强酶活性的目的。
(4)本发明在室温条件下，以天冬氨酸转氨酶(ASPC)和支链氨基酸转氨酶(BCAT)为固定化对象，与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氨基酸、金属源和有机配体的溶液进行共沉淀，制备金属有机骨架材料固定化酶，所得固定化酶复合材料稳定性高，能耐高温和有机溶剂，具有高重复使用率，利用该固定化酶实现了手性非天然氨基酸的高效合成。该方法目前尚未见报道。
附图说明
图1是实施例1所制得A&B@NH2Co-MOF-1复合材料的扫描电镜图。
图2是实施例1所制得A&B@NH2Co-MOF-1复合材料的透射电镜图。
图3是实施例1所制得A&B@NH2Co-MOF-1复合材料与游离酶经不同有机溶剂处理后的催化活性比较图。
图4是实施例1所制得A&B@NH2Co-MOF-1复合材料重复使用性的结果图。
图5是实施例1所制得A&B@NH2Co-MOF-1复合材料与游离酶经不同温度处理后的催化活性比较图。
具体实施方式
以下是本发明内容的具体实施例，用于说明本发明的技术方案和特点，旨在辅助于本领域技术人员理解本发明内容并据以实施，但本发明技术方案的实现并不限于此，凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都属于本发明的保护范围。
本发明所述：
ASPC：天冬氨酸转氨酶；
BCAT：支链氨基酸转氨酶；
PVP：聚乙烯吡咯烷酮；
Na-BDC-NH2：2-氨基对苯二甲酸钠盐；
A&B：天冬氨酸转氨酶和支链氨基酸转氨酶；
mM：mmol/L。
实施例1
S1：天冬氨酸转氨酶、支链氨基酸转氨酶分别溶于PBS缓冲液，获得浓度为3mg/ml的天冬氨酸转氨酶溶液(ASPC溶液)和浓度为3mg/ml的支链氨基酸转氨酶溶液(BCAT溶液)，将120μl上述浓度为3mg/ml的ASPC溶液和120μl上述浓度为3mg/ml的BCAT溶液混合均匀，再加入20μl浓度为0.1mg/μl的PVP的PBS溶液，混合均匀，接着加入10μl浓度为500mM的天冬氨酸的PBS溶液，混合均匀，最后加入100μl 0.25M的Na-BDC-NH2的PBS溶液和100μl 0.25M的Co(NO3)2的水溶液，获得合成反应体系。
S2：室温下以200rpm的振荡速度搅拌15min，反应结束以10000rpm离心5min，获得产物。
S3：产物用PBS洗涤数次，获得的金属有机骨架材料固定化酶产物，记为A&B@NH2Co-MOF-1。
采用A&B@NH2Co-MOF-1不对称合成非天然氨基酸，具体操作为：
将获得的A&B@NH2Co-MOF-1加入到含有天冬氨酸和谷氨酸、三甲基丙酮酸和磷酸吡哆醛的底物溶液中，溶剂为PBS缓冲液，得到混合物；所述A&B@NH2Co-MOF-1用量为0.8mg，底物溶液体积为400μl，天冬氨酸在底物溶液中的浓度为120mM，谷氨酸在底物溶液中的浓度为20mM，三甲基丙酮酸在底物溶液中的浓度为100mM，磷酸吡哆醛在底物溶液中的浓度为0.005％；将混合物置于恒温振荡培养箱中，于37℃、200rpm下振荡孵育12h，反应结束后离心收集反应液，通过高效液相色谱法测定非天然氨基酸L-叔亮氨酸的产率为79.7％。
实施例2
S1：天冬氨酸转氨酶、支链氨基酸转氨酶分别溶于PBS缓冲液，获得浓度为3mg/ml的天冬氨酸转氨酶溶液和浓度为3mg/ml的支链氨基酸转氨酶溶液，将220μl上述浓度为3mg/ml的ASPC溶液、22μl上述浓度为3mg/ml的BCAT溶液混合均匀，再加入20μl浓度为0.2mg/μl的PVP的PBS溶液，混合均匀，接着加入10μl浓度为600mM的天冬氨酸的PBS溶液，混合均匀，最后加入100μl 0.25M的Na-BDC-NH2的PBS溶液和100μl 0.25M的Co(NO3)2的水溶液，获得合成反应体系。
S2：室温下以150rpm的振荡速度搅拌15min，反应结束以6000rpm离心10min，获得产物。
S3：产物用PBS洗涤数次，获得的金属有机骨架材料固定化酶产物记为A&B@NH2Co-MOF-2。
采用A&B@NH2Co-MOF-2不对称合成非天然氨基酸，具体操作为：
将获得的A&B@NH2Co-MOF-2加入到含有天冬氨酸和谷氨酸、三甲基丙酮酸和磷酸吡哆醛的底物溶液中，得到混合物，溶剂为PBS缓冲液；所述A&B@NH2Co-MOF-2用量为0.8mg，底物溶液体积为400μl，溶剂为PBS缓冲液，天冬氨酸在底物溶液中的浓度为120mM，谷氨酸在底物溶液中的浓度为20mM，三甲基丙酮酸在底物溶液中的浓度为100mM，磷酸吡哆醛在底物溶液中的浓度为0.005％；将混合物置于恒温振荡培养箱中，于37℃、150rpm下振荡孵育12h，反应结束后离心收集反应液，通过高效液相色谱法测定非天然氨基酸L-叔亮氨酸的产率为59.3％。
实施例3
S1：天冬氨酸转氨酶、支链氨基酸转氨酶分别溶于PBS缓冲液，获得浓度为3mg/ml的天冬氨酸转氨酶溶液和浓度为3mg/ml的支链氨基酸转氨酶溶液，将2μl上述浓度为3mg/ml的ASPC溶液、200上述μl浓度为3mg/ml的BCAT溶液混合均匀，再加入20μl浓度为0.25mg/μl的PVP的PBS溶液，混合均匀，接着加入10μl浓度为200mM的谷氨酸的PBS溶液，混合均匀，最后加入100μl 0.5M的Na-BDC-NH2的PBS溶液和100μl 0.25M的Co(NO3)2的水溶液，获得合成反应体系。
S2：室温下以200rpm的振荡速度搅拌30min，反应结束以10000rpm离心5min，获得产物。
S3：产物用PBS洗涤数次，获得的金属有机骨架材料固定化酶产物记为A&B@NH2Co-MOF-3。
采用A&B@NH2Co-MOF-3不对称合成非天然氨基酸，具体操作为：
将获得的A&B@NH2Co-MOF-3加入到含有天冬氨酸和谷氨酸、三甲基丙酮酸和磷酸吡哆醛的底物溶液中，溶剂为PBS缓冲液，得到混合物；所述A&B@NH2Co-MOF-3用量为1mg，底物溶液体积为400μl，溶剂为PBS缓冲液，天冬氨酸在底物溶液中的浓度为120mM，谷氨酸在底物溶液中的浓度为20mM，三甲基丙酮酸在底物溶液中的浓度为100mM，磷酸吡哆醛在底物溶液中的浓度为0.005％；将混合物置于恒温振荡培养箱中，于37℃、170rpm下振荡孵育12h，反应结束后离心收集反应液，通过高效液相色谱法测定非天然氨基酸L-叔亮氨酸的产率为53.0％。
实施例4
S1：天冬氨酸转氨酶、支链氨基酸转氨酶分别溶于PBS缓冲液，获得浓度为3mg/ml的天冬氨酸转氨酶溶液和浓度为3mg/ml的支链氨基酸转氨酶溶液，将120μl上述浓度为3mg/ml的ASPC溶液和120μl上述浓度为3mg/ml的BCAT溶液混合均匀，再加入20μl浓度为0.25mg/μl的PVP的PBS溶液，最后加入100μl 0.25M的Na-BDC-NH2的PBS溶液和100μl 0.25M的Ni(NO3)2的PBS溶液，获得合成反应体系。
S2：室温下以200rpm的振荡速度搅拌1h，反应结束以9000rpm离心4min，获得产物。
S3：产物用PBS洗涤数次，获得的金属有机骨架材料固定化酶产物记为A&B@NH2Ni-MOF。
采用A&B@NH2Ni-MOF不对称合成非天然氨基酸，具体操作为：
将获得的A&B@NH2Ni-MOF加入到含有天冬氨酸和谷氨酸、三甲基丙酮酸和磷酸吡哆醛的底物溶液中，溶剂为PBS缓冲液，得到混合物；所述A&B@NH2Ni-MOF用量为1.1mg，底物溶液体积为400μl，溶剂为PBS缓冲液，天冬氨酸在底物溶液中的浓度为120mM，谷氨酸在底物溶液中的浓度为20mM，三甲基丙酮酸在底物溶液中的浓度为100mM，磷酸吡哆醛在底物溶液中的浓度为0.005％；将混合物置于恒温振荡培养箱中，于37℃、150rpm下振荡孵育12h，反应结束后离心收集反应液，通过高效液相色谱法测定非天然氨基酸L-叔亮氨酸的产率为46.5％。
实施例5
S1：天冬氨酸转氨酶、支链氨基酸转氨酶分别溶于PBS缓冲液，获得浓度为3mg/ml的天冬氨酸转氨酶溶液和浓度为3mg/ml的支链氨基酸转氨酶溶液，将120μl上述浓度为3mg/ml的ASPC溶液和120μl上述浓度为3mg/ml的BCAT溶液混合均匀，加入100μl 0.25M对苯二甲酸钠盐的水溶液的和100μl 0.25M的CaCl2的水溶液，获得合成反应体系。
S2：室温下以200rpm的振荡速度搅拌15min，反应结束以12000rpm离心3min，获得产物。
S3：产物用超纯水洗涤数次，获得的金属有机骨架材料固定化酶产物记为A&B@Ca-MOF。
采用A&B@Ca-MOF不对称合成非天然氨基酸，具体操作为：
将获得的A&B@Ca-MOF加入到含有天冬氨酸和谷氨酸、三甲基丙酮酸和磷酸吡哆醛的底物溶液中，溶剂为PBS缓冲液，得到混合物；所述A&B@Ca-MOF用量为1.2mg，底物溶液体积为400μl，溶剂为PBS缓冲液，天冬氨酸在底物溶液中的浓度为120mM，谷氨酸在底物溶液中的浓度为20mM，三甲基丙酮酸在底物溶液中的浓度为100mM，磷酸吡哆醛在底物溶液中的浓度为0.005％；将混合物置于恒温振荡培养箱中，于37℃、200rpm下振荡孵育2h，反应结束后离心收集反应液，通过高效液相色谱法测定非天然氨基酸L-叔亮氨酸的产率为26.0％。
实施例6
S1：天冬氨酸转氨酶、支链氨基酸转氨酶分别溶于PBS缓冲液，获得浓度为3mg/ml的天冬氨酸转氨酶溶液和浓度为3mg/ml的支链氨基酸转氨酶溶液，将22μl上述浓度为3mg/ml的ASPC溶液和220μl上述浓度为3mg/ml的BCAT溶液混合均匀，再加入10μl浓度为100mM的丙氨酸的PBS溶液，混合均匀，最后加入100μl 0.25M的Na-BDC-NH2的PBS溶液和100μl0.05M的Co(NO3)2的水溶液，获得合成反应体系。
S2：室温下以200rpm的振荡速度搅拌2h，反应结束以10000rpm离心5min，获得产物。
S3：产物用PBS洗涤数次，获得的金属有机骨架材料固定化酶产物记为A&B@NH2Co-MOF-4。
采用A&B@NH2Co-MOF-4不对称合成非天然氨基酸，具体操作为：
将获得的A&B@NH2Co-MOF-4加入到含有天冬氨酸和谷氨酸、三甲基丙酮酸和磷酸吡哆醛的底物溶液中，溶剂为PBS缓冲液，得到混合物；所述A&B@NH2Co-MOF-1用量为1.2mg，底物溶液体积为400μl，溶剂为PBS缓冲液，天冬氨酸在底物溶液中的浓度为120mM，谷氨酸在底物溶液中的浓度为20mM，三甲基丙酮酸在底物溶液中的浓度为100mM，磷酸吡哆醛在底物溶液中的浓度为0.005％；将混合物置于恒温振荡培养箱中，于37℃、200rpm下振荡孵育24h，反应结束后离心收集反应液，通过高效液相色谱法测定非天然氨基酸L-叔亮氨酸的产率为37.9％。
实施例7
S1：天冬氨酸转氨酶、支链氨基酸转氨酶分别溶于PBS缓冲液，获得浓度为3mg/ml的天冬氨酸转氨酶溶液和浓度为3mg/ml的支链氨基酸转氨酶溶液，将40μl上述浓度为3mg/ml的ASPC溶液和200μl上述浓度为3mg/ml的BCAT溶液混合均匀，再加入20μl浓度为0.15mg/μl的PVP的PBS溶液，混合均匀，接着加入10μl浓度为300mM的半胱氨酸的PBS溶液，混合均匀，最后加入100μl 1.25M的均苯三甲酸钠盐的PBS溶液和100μl 0.25M的Zn(NO3)2的水溶液，获得合成反应体系。
S2：4℃下以200rpm的振荡速度搅拌4h，反应结束以8000rpm离心5min，获得产物。
S3：产物用PBS洗涤数次，获得的金属有机骨架材料固定化酶产物记为A&B@Zn-MOF。
采用A&B@Zn-MOF不对称合成非天然氨基酸，具体操作为：
将获得的A&B@Zn-MOF加入到含有天冬氨酸和谷氨酸、三甲基丙酮酸和磷酸吡哆醛的底物溶液中，溶剂为PBS缓冲液，得到混合物；所述A&B@Zn-MOF用量为1.5mg，底物溶液体积为400μl，溶剂为PBS缓冲液，天冬氨酸在底物溶液中的浓度为120mM，谷氨酸在底物溶液中的浓度为20mM，三甲基丙酮酸在底物溶液中的浓度为100mM，磷酸吡哆醛在底物溶液中的浓度为0.005％；将混合物置于恒温振荡培养箱中，于37℃、200rpm下振荡孵育12h，反应结束后离心收集反应液，通过高效液相色谱法测定非天然氨基酸L-叔亮氨酸的产率为22.8％。
测试实施例：
取上述实施例1中合成的A&B@NH2Co-MOF-1复合材料进行如下测试实验。
测试实施例1：扫描电镜表征
图1是本发明合成的A&B@NH2Co-MOF-1复合材料的扫描电镜图，如图所示，该材料由许多不规则片状结构组成，整体呈花朵形状。
测试实施例2：透射电镜表征
图2是本发明合成的A&B@NH2Co-MOF-1复合材料的透射电镜图，如图所示，该材料整体呈团簇花状。
测试实施例3：有机溶剂耐受性试验
图3是本发明合成的A&B@NH2Co-MOF-1复合材料与游离酶A&B经不同有机溶剂处理后的催化活性比较图，将酶量相等的A&B@NH2Co-MOF-1和A&B分散于含有20％的甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、乙腈(MeCN)、四氢呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或40％的N，N-二甲亚砜(DMSO)的PBS缓冲液中，37℃振荡孵育1h后，加入含有天冬氨酸、谷氨酸、三甲基丙酮酸、磷酸吡哆醛的底物溶液中，得到混合物；底物溶液体积为400μl，溶剂为PBS缓冲液，天冬氨酸在底物溶液中的浓度为120mM，谷氨酸在底物溶液中的浓度为20mM，三甲基丙酮酸在底物溶液中的浓度为100mM，磷酸吡哆醛在底物溶液中的浓度为0.005％；将混合物置于恒温振荡培养箱中，于37℃、200rpm下振荡孵育24h，反应结束后离心收集反应液，通过高效液相色谱法测定游离酶和固定化酶的相对活性。如图所示，相比于游离酶，该固定化酶复合材料对有机溶剂具有更高的耐受性，相对活性至少是游离酶的3倍。测试实施例4：重复使用性试验
图4是本发明合成的A&B@NH2Co-MOF-1复合材料重复使用性的结果图。试验方法为将5mg固定化酶材料分散于含有天冬氨酸、谷氨酸、三甲基丙酮酸、磷酸吡哆醛的底物溶液中，得到混合物；底物溶液体积为400μl，溶剂为PBS缓冲液，天冬氨酸在底物溶液中的浓度为120mM，谷氨酸在底物溶液中的浓度为20mM，三甲基丙酮酸在底物溶液中的浓度为100mM，磷酸吡哆醛在底物溶液中的浓度为0.005％；将混合物置于恒温振荡培养箱中，于37℃、200rpm下振荡孵育12h，反应结束后离心收集反应液，固体材料用PBS缓冲液洗涤后再次加入400μl底物溶液，重复上述操作。通过高效液相色谱法测定非天然氨基酸L-叔亮氨酸的产率。如图所示，该材料使用10次未出现明显的活性降低，直至第15次活性仍保留初始活性的80％左右。测试实施例5：高温耐受性试验
图5是本发明合成的A&B@NH2Co-MOF-1复合材料与游离酶A&B在不同温度条件下处理后的催化活性比较图，将酶量相等的A&B@NH2Co-MOF-1和A&B分散于180μl PBS缓冲液中，置于37、50、60、70、80℃中水浴2h，随后加入220μl含有天冬氨酸、谷氨酸、三甲基丙酮酸、磷酸吡哆醛的底物溶液中，得到混合物；混合物体积为400μl，溶剂为PBS缓冲液，天冬氨酸在底物溶液中的浓度为120mM，谷氨酸在底物溶液中的浓度为20mM，三甲基丙酮酸在底物溶液中的浓度为100mM，磷酸吡哆醛在底物溶液中的浓度为0.005％；将混合物置于恒温振荡培养箱中，于37℃、200rpm下振荡孵育48h，反应结束后离心收集反应液，通过高效液相色谱法测定游离酶和固定化酶的相对活性。如图所示，相比于游离酶，该固定化酶复合材料对高温具有更高的耐受性，游离酶在高温60、70、80℃下大量失活，相同条件下该固定化酶复合材料的活性是游离酶的5倍以上。
Claims (12)
1.一种金属有机骨架材料固定化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
S1：将天冬氨酸转氨酶和支链氨基酸转氨酶溶于PBS缓冲液，搅拌均匀后加入有机配体和金属源溶液，获得合成反应体系；优选的，S1还包括加入PVP和/或氨基酸；
S2：将合成反应体系搅拌反应，分离获得产物；
S3：用洗涤剂洗涤产物，得到金属有机骨架材料固定化酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中所述天冬氨酸转氨酶和支链氨基酸转氨酶质量比为10:1～1:100，所述天冬氨酸转氨酶和支链氨基酸转氨酶在合成反应体系中的总浓度为1～20mg/ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中所述氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、半胱氨酸；所述氨基酸在合成反应体系中的终浓度为0～15mM；优选的，所述氨基酸在合成反应体系中的终浓度为2.2～12.7mM；进一步优选的，所述氨基酸在合成反应体系中的终浓度为10.6mM。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中所述PVP在合成反应体系中的终浓度为0～12.5mg/ml；优选的，所述PVP在合成反应体系中的终浓度为4.3～11.6mg/ml；进一步优选的，所述PVP在合成反应体系中的终浓度为4.3mg/ml。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中所述有机配体选自苯二甲酸钠盐、均苯三甲酸钠盐或2-氨基对苯二甲酸钠盐，溶剂为PBS缓冲液或超纯水。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中所述金属源选自钙、锌、钴、镍的盐，溶剂为超纯水；金属源在合成反应体系中的终浓度为5～100mM；所述金属源和有机配体的摩尔比为1:1～1:100。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中所述搅拌反应温度为4℃或室温，搅拌反应时间为15min～4h；所述分离为离心分离，优选的，所述离心分离的转速为6000～12000rpm。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中所述洗涤剂或溶剂选自超纯水或PBS缓冲液。
9.一种金属有机骨架材料固定化酶，其特征在于，所述金属有机骨架材料固定化酶是采用权利要求1所述制备方法制备得到的。
10.权利要求9所述的金属有机骨架材料固定化酶在不对称合成非天然氨基酸中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，将金属有机骨架材料固定化酶均匀分散于底物溶液中，所述底物溶液包含氨基酸、酮酸、辅酶，获得混合物，将所述混合物振荡孵育，分离获得所述非天然氨基酸。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述孵育温度为37℃，振荡转速为100～200rpm，孵育时间为2～48h。
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