CN110129290A - 金属有机框架材料固定化漆酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于材料制备技术领域，具体公开了一种金属有机框架材料固定化漆酶及其制备方法和应用；本发明采用共沉淀法先将漆酶金属铜离子共价结合，接着铜离子与均苯三甲酸(BTC)结合形成的金属有机框架材料固定化酶(Lac@HKUST‑1)，在形成材料的过程当中将漆酶包裹到材料当中，实现对酶的固定化；本发明金属有机框架材料是根据酶而长成的，也就是酶的固定化与框架材料的制备是同时进行的；一步完成材料的制备及酶的固定化，提高了酶的稳定性、耐有机溶剂，同时铜是漆酶的无机辅酶因子因此还提高了酶的活性，显著提高了降解BPA速率和效率。

Description

金属有机框架材料固定化漆酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于材料制备技术领域，具体涉及金属有机框架材料固定漆酶及其制备方法和应用。

背景技术

双酚A是一种常见的污染物，它广泛的存在于工业废水、饮用水瓶以及婴儿的奶嘴瓶。当人体摄入双酚A会导致早熟、不孕不育甚至致癌等，所以开发一种高效降解双酚A的方法迫在眉睫。漆酶是一种环境友好性酶，它广泛存在于自然界中。漆酶降解双酚A有着很多优势，例如：降解效率高、反应条件温和、产物具有环境友好性等。漆酶具有3个铜离子结合位点(T1、T2、T3)，一般结合4个铜离子。这4个铜离子分别为I型铜，Ⅱ型铜和Ⅲ型铜，分别与T1、T2和T3结合，其中I型铜在T1位点与3个氨基酸配位(包括2个组氨酸、1个半胱氨酸)，Ⅱ型铜在T2位点与2个组氨酸和1个水分子配位，Ⅲ型铜在T3位点包括2个铜离子，这2个铜离子分别与3个组氨酸配位，2个Ⅲ型铜之间通过氢氧桥配位。漆酶催化过程中，底物首先在T1位点被氧化，释放出电子被T1位的铜捕获，经半胱氨酸传递给与T2位的铜结合的组氨酸，再进一步将氧分子还原为水。在工业环境降解双酚A的过程中要求酶能够在高温和特殊溶剂的环境中稳定存在，所以对其进行固定化，在提高水解效率的同时能够实现多次利用。

金属有机骨架(MOFs)是带连接点的金属离子和有机配体通过配位结合，形成二维或者三维结构的多孔材料，在分子保护、催化和药物释放等方面有着很大的潜力。与传统的无机有机材料相比，MOFs材料具有多孔和结构多样化的特点，由于这些特点近年来MOFs材料被广泛的应用于酶的固定化。目前MOFs材料固定化酶主要包括交联、共价结合、表面吸附、包埋和共沉淀这五种方法：交联法固定化酶由于要加入交联剂，所以会出现降低酶活甚至出现失活的现象、共价结合可能影响酶的空间结构，从而影响酶的催化活性、表面吸附法结合力弱，易解吸附、包埋法要求材料的孔径大于酶的粒径，所以会出现酶渗透出材料的现象、共沉淀法工艺简单，条件温和，酶的粒径可以小于材料的孔径可以防止酶的渗透，所以选用共沉淀法固定化酶。

发明内容

本发明的目的在于利用漆酶的无机辅酶因子铜形成的铜金属有机骨架(HKUST-1)来对漆酶进行保护，来克服游离漆酶在pH稳定性、热稳定性、贮藏稳定性以及有机溶剂耐受性等方面的不足，同时无机辅酶因子铜对漆酶有激活作用可以进一步提高漆酶的活性。采用共沉淀法将漆酶引入金属铜离子和BTC形成的金属有机框架材料HKUST-1的孔道结构中，实现对酶的固定化。

为达到上述技术目的，本发明采取的技术方案如下：

本发利用共沉淀法将漆酶引入金属铜离子和BTC形成的金属有机框架材料HKUST-1的孔道结构中，实现对酶的固定化，所述固定化漆酶为花状结构且表面光滑，尺寸在1μm左右。

本发明还提供一种金属有机框架材料固定化漆酶的制备方法，具体步骤如下：

称取漆酶，用聚乙烯吡咯烷酮溶液混匀后，加入一水乙酸铜溶液混溶，再加入均苯三甲酸(BTC)溶液，充分混溶；在恒温水浴锅中静置培养，反应完毕后离心，反复清洗后的产物在4℃冰箱中保存备用，得到金属有机框架材料固定化漆酶，记为Lac@HKUST-1。

所述漆酶、聚乙烯吡咯烷酮溶液、一水乙酸铜溶液和均苯三甲酸溶液的用量为1mg：20μL：240μL：240μL，所述反应体系中漆酶的最终浓度为2mg/mL。

所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的浓度为7.2mg/mL,所述一水乙酸铜溶液中铜离子的浓度为62.5-100mM；所述对均苯三甲酸BTC溶液的浓度为6.25-25mM。

进一步的，所述一水乙酸铜溶液中铜离子的浓度为87.5mM；所述对均苯三甲酸(BTC)溶液的浓度为25mM。

所述一水乙酸铜溶液和均苯三甲酸(BTC)溶液的溶剂均为NaAc-HAc缓冲溶液；所述NaAc-HAc缓冲溶液的pH为4.5-7.0，缓冲溶液的浓度为0.2mM。

进一步的，所述NaAc-HAc缓冲溶液的pH为6.5。

所述静置培养的温度为25-35℃，时间为2-12h。

进一步的，所述静置培养的温度为30℃，时间为8h。

本发明还提供金属有机框架材料固定化漆酶(Lac@HKUST-1)降解双酚A(BPA)的应用。

本发明具有如下优点：

1、目前，固定化酶的方法大都是先合成材料，再对酶进行固定化，对酶活的损失较大，同时固载量也较低；而本发明创新的选择了有机酸(均苯三甲酸)和金属盐(一水醋酸铜)，且在酶的最优条件下合成的。本发明中，金属有机框架材料是根据酶而长成的，也就是说酶的固定化与框架材料的制备是同时进行的。

本发明在MOFs形成的过程中同时引入漆酶，实现了固定化；一步完成避免了金属有机框架孔道过小，酶无法进入材料；或者材料孔道过大，无法起固定作用的缺陷。提高了酶的稳定性、有机溶剂耐受性和酶活等，显著提高循环利用率，同时提高了漆酶降解BPA的效率。

2、本发明中将漆酶溶液与PVP混匀后，再依次与一水乙酸铜和BTC混匀，在常温水相温和条件下成功制备出固定化酶Lac@HKUST-1，与游离酶活相比，固定化酶活力提高50％左右。

3、本发明通过调整Cu²⁺、BTC以及酶的量从而最大程度地得到固定化酶，并且优化了固定化条件，当选择pH为6.5的缓冲溶液溶解Cu²⁺和BTC，酶浓度为2mg/mL，固定化时间为8h时，酶的固载量及保留活力达到最佳值，分别为326.8mg/g和156.7％。

4、本发明对固定化酶Lac@HKUST-1的酶学性质进行了考察，其在稳定性等方面有着明显的提高。HKUST-1材料的三维孔道结构为漆酶提供了刚性屏蔽环境从而有效地减小外界不利环境对酶活力的影响，提高了其热稳定性、贮藏稳定性、重复利用稳定性及有机溶剂耐受性等特性。同时漆酶的无机辅酶因子Cu对漆酶有激活作用，大大的提高了漆酶的活性。

附图说明

图1为Lac@HKUST-1的合成原理图。

图2为游离漆酶(a)、固定化酶Lac@HKUST-1(b)及金属-有机框架材料(HKUST-1)(c)的红外光谱图。

图3为HKUST-1(a)和Lac@HKUST-1(b)的SEM图。

图4为Lac@HKUST-1的TEM图。

图5为缓冲溶液的pH对酶的固定化效果的影响结果图。

图6为漆酶添加量对酶的固定化效果的影响结果图。

图7为固定化时间对酶的固定化效果的影响结果图。

图8为pH对游离漆酶及其固定化酶Lac@HKUST-1催化反应活性的影响结果图。

图9为温度对游离漆酶及其固定化酶Lac@HKUST-1催化反应活性的影响结果图。

图10为游离漆酶及其固定化酶Lac@HKUST-1的Lineweaver-Burk曲线图。

图11为游离漆酶及其固定化酶Lac@HKUST-1的pH稳定性验证的结果图。

图12为游离漆酶及其固定化酶Lac@HKUST-1的热稳定性验证的结果图。

图13为有机溶剂对游离漆酶及其固定化酶Lac@HKUST-1酶活力的影响结果图。

图14为游离漆酶及其固定化酶Lac@HKUST-1的贮藏稳定性验证的结果图。

图15为固定化酶Lac@HKUST-1的重复利用稳定性的图。

图16固定化酶Lac@HKUST-1降解BPA受BPA浓度的影响。

图17pH对固定化酶Lac@HKUST-1降解BPA的影响。

图18温度对固定化酶Lac@HKUST-1降解BPA的影响。

图19时间对固定化酶Lac@HKUST-1降解BPA的影响。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

对本发明得到的固定化酶通过以下的方式对其性质进行验证：

(1)酶的固载量测定：

取6个EP管进行编号，用去离子水将250μg/mL的标准BSA溶液稀释至0-250μg/mL的溶液，运用蛋白质试剂盒测定蛋白质含量。先用去离子水将250μg/mL的标准BSA溶液稀释至0-250μg/mL不等浓度的标准溶液。再将试剂盒中的溶液A和溶液B按照50:1的比例配置显色反应所需的工作液。

取20μL配置好的标准溶液加入400μL工作液，摇匀，60℃水浴反应30min后用流水迅速冷却，10min内在紫外分光光度计562nm波长处测定其吸光度值，以x轴为吸光度值，y轴为蛋白浓度，绘制蛋白标准曲线，其线性回归方程为：y＝0.0033x,R²＝0.997。

分别取20μL去离子水、漆酶溶液和离心后的一次及二次上清液加入到4个编好号的EP管中，分别加400μL工作液混合均匀后60℃下反应30min，4℃冷却后测吸光度值，根据蛋白标准曲线的线性回归方程可以求出蛋白浓度，进一步可以求出漆酶的固载量。

(2)漆酶活力的测定：

采用比色法进行酶活力测量，以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物，催化水解所得产物为ABTS⁺，其在420nm处有特征吸收峰，可直接进行比色测定。

0.8M氟化钠(NaF)溶液配制：称取1.68g氟化钠固体于烧杯中，用适量的去离子水充分氟化钠溶解后定容至50mL。

1mM ABTS溶液的配制：称取8.8mgABTS溶液8mlNaAc-HAc缓冲溶液(pH4)。

游离酶活力：取450μLABTS的NaAc-HAc缓冲溶液(200mM,pH 4.0)于1.5mL EP管中充分混合后，40℃水浴预热10min，加入50μL一定浓度的漆酶溶液，摇匀后40℃水浴反应6min，反应完毕后立即加入500μL的NaF溶液，摇匀后测定吸光度。

(3)酶活力的计算

漆酶活力的定义：漆酶在pH 4.0，40℃反应条件下，1min分解ABTS所需的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。

ΔA＝反应前后吸光度的变化,V＝比色皿中液体的体积(L),ε＝消光系数,L＝比色皿内径直径(cm)，t＝反应时间(min).

(4)固定化酶Lac@HKUST-1催化水解应用

固定化酶Lac@HKUST-1降解双酚A(BPA)：

取一定量的固定化酶到4ml离心管中，并加入1ml 200mg/ml的BPA溶液，混合后，置于40℃振荡培养箱中振荡反应12h，水解率计算公式如下：

固定化酶Lac@HKUST-1的回收利用：

固定化酶Lac@HKUST-1催化水解反应结束后，对其进行回收利用。将反应后的混合液取出，4℃下离心，得到的沉淀为固定化酶Lac@HKUST-1，将得到的固定化酶Lac@HKUST-1用NaAc-HAc缓冲溶液洗3次，接着加入BPA溶液进行下一次水解反应，从而得到循环次数所对应的水解率。

实施例1：金属有机框架材料(HKUST-1)及其固定化酶Lac@HKUST-1的制备

称取1mg的漆酶，用20μL的聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP，7.2mg/mL)溶液混匀后，将其与62.5mM的一水乙酸铜溶液混溶，再加入25mM的BTC溶液，充分混溶。在30℃恒温振荡培养箱中静置培养8h，反应完毕后在4℃下离心，反复清洗3次后的产物在4℃冰箱中保存备用，同时得到金属有机框架材料(HKUST-1)及其固定化酶Lac@HKUST-1。

实施例2：金属有机框架材料(HKUST-1)及其固定化酶Lac@HKUST-1的表征

(1)傅里叶变换红外光谱图(FTIR)分析

采用傅里叶变换红外光谱仪对游离漆酶、金属有机框架材料HKUST-1及其固定化酶Lac@HKUST-1三种样品的分子结构进行检测。首先将KBr在90℃烘箱中隔夜干燥，处理好的样品和KBr以1:100当量混匀，研磨后压片。以单独的KBr薄片为空白，分别测定这三种样品的红外光谱图，测得这三种样品的红外光谱图，如图2所示。

通过考察红外光谱图中特征基团吸收峰的位置及其不同程度的位移情况来确定成功合成了金属有机框架材料HKUST-1及固定化酶Lac@HKUST-1。如图2(b)和图2(c)所示，铜的吸收峰在442cm^-1附近，其配位作用引起羧酸在1618.73cm^-1、1554.77cm^-1、1452.12cm^-1和1372.22cm^-1处出现强烈的振动峰，证明形成了金属有机框架材料(HKUST-1)。图2(a)中，在1029.93cm^-1处形成一个振动峰，这是漆酶的一个特征峰，同时在图2(b)中1035.87cm^-1也形成一个振动峰，而图2(c)在此附近没有明显吸收峰，所以可以证明漆酶已经固定到了材料当中。图2(a)中，漆酶中的甲基和亚甲基在2929.84cm^-1处形成一个振动峰，图2(b)在此附近2928.54cm^-1处也出现了一个振动峰，由此可知漆酶在金属有机框架形成过程中被引入孔道内，成功固定化在HKUST-1中。

(2)扫描电镜(SEM)分析

用无水乙醇将合成好的金属有机框架材料HKUST-1及固定化酶Lac@HKUST-1重新分散，取10μL样品滴加在硅片上，然后再60℃的烘箱干燥3min，用JSM-6010PLUS/LA型扫描电子显微镜(日本)观察其形貌并拍照，结果如图3所示。

图3(a)和(b)分别是金属有机框架材料HKUST-1及其固定化酶Lac@HKUST-1的SEM图。通过对比发现，单纯的材料其形貌如针状，尺寸均在1-2μm左右，然而固定化材料其形貌是纳米级的花状材料，尺寸大约在500-1000nm左右。表明由于漆酶的引入使得单纯材料和固定化酶的形貌有着很大的区别，也可以证明漆酶已经固定在材料上。

(3)透射电镜(TEM)分析

用无水乙醇将合成好的固定化酶Lac@HKUST-1重新分散，取10μL样品滴加在铜网上，然后用透射电镜进行观察。图4(a)和(b)是固定化酶Lac@HKUST-1的TEM图，通过观察发现，他的尺寸大约在1微米左右，其形貌为花状结构。图中的阴影部分应该就是漆酶，从而可以证明酶固定到了材料当中。

实施例3：漆酶的固定化条件优化

(1)金属离子及有机酸浓度对固定化的影响

固定化酶Lac@HKUST-1的合成前提是能够形成金属有机框架材料HKUST-1，通过正交实验法，得出Lac@HKUST-1保留酶活力和酶的固载量所对应的一水乙酸铜和均苯三甲酸BTC的浓度，如表1和表2所示，BTC的浓度为6.25mM时，随着乙酸铜浓度的增加，Lac@HKUST-1的固载量和保留酶活力略有升高，这是因为酸的浓度偏低时，产生的Lac@HKUST-1的量较少，游离酶被引入到骨架孔道中较少。继续增加BTC浓度,使其浓度为12.5mM，HKUST-1的量明显增加，其中当Cu⁺浓度达到75mM时出现了最大固载率为54％。当BTC浓度为25mM时，固载量和保留酶活力均出现大幅度提高，当Cu²⁺浓度达到87.5mM时，Lac@HKUST-1出现最大相对酶活力为150.1％，这是由于Cu²⁺增多，促进了骨架的形成，并且铜是漆酶的无机辅酶因子所以对酶活有很大的提升。因此，本发明选择的Cu²⁺和BTC的浓度分别为25-62.6mM和6.25-18.75mM，优先选择的Cu²⁺和BTC的浓度分别为87.5mM和25mM。

表1.不同浓度Cu²⁺和BTC对固定化酶保留酶活力影响

表2.不同浓度Cu²⁺和BTC对酶的固载率影响

(2)缓冲溶液pH对固定化的影响

HKUST-1的合成受pH的影响也很大，在不同的pH的环境中，合成的HKUST-1的形貌也有所差异，从而也会影响固定化酶的酶活。所以选择一定pH的NaAc-HAc缓冲溶液溶解一水乙酸铜和BTC，这样反应体系的pH较为稳定，有利于HKUST-1的合成，同时酶也不容易失活。如图5所示，当溶液pH为4.5时，Lac@HKUST-1的固载量仅有69mg/g，相对应的保留酶活为16.1％。这是因为在此缓冲液所形成的反应液下，骨架的形成较为缓慢，且固定化酶的产量较少。而且酶长时间浸泡在酸性环境中，对酶活有很大的影响。材料形成所需的反应体系随着缓冲溶液pH的升高而更加适宜，使用pH 6.5的缓冲溶液溶解的原料进行固定化反应，产物Lac@HKUST-1的固载量和相对酶活力皆达到最佳，分别为147.5mg/g和156.7％。所以本发明采用pH为4.5-7.0，优选pH为6.5的NaAc-HAc缓冲溶液溶解一水乙酸铜和BTC进行酶的固定化。

(3)酶的添加量对固定化的影响

本实验考查了漆酶的添加量对骨架HKUST-1生成的影响，得到的固定化酶的固载效率和相对酶活力如图6所示。当加入0.5mg/mL酶时，由于漆酶的添加量过低导致固定化酶Lac@HKUST-1的产物量较少，Lac@HKUST-1的固载率为42.3％，相对酶活力为135.7％。固定化酶Lac@HKUST-1的产量随着酶浓度的升高而增多，当漆酶的浓度为2mg/mL时，固载率最高达到59.1％，保留酶活力为153.1％。由于HKUST-1孔道引入酶的能力有限，增加酶量，虽然固载量有些许提高，固载率却下降明显。而且随着酶浓度的增大，可能还会出现攒聚的现象，导致固定化酶的相对酶活降低。所以本发明优选0.5-8mg/mL的加酶量进行酶的固定化，优选的，采用2mg/mL的加酶量进行酶的固定化。

(4)固定化时间的影响

虽然Lac@HKUST-1骨架生长很快，但是要让它形貌工整，酶活性能较好，还需另其多长上一段时间。所以本发明对Lac@HKUST-1的固载量和相对酶活力随固定化时间变化进行研究，如图7所示。实验中，我们取了反应2-12h的固定化酶对其进行固载量和活性检测。通过检测发现，反应6h时固定化酶的固载量最高为177mg/g，但相对酶活一般。当反应8h时，固定化酶的相对酶活达到最高为153％，固载量交6h的低一点为156.3mg/g。继续延长时间，发现固定化酶的固载量和相对酶活都明显降低，可能是因为固定化酶长时间浸泡在溶液中导致部分材料坍塌，以及部分酶出现了失活的现象。因此，本发明选取的固定化时间为2-12h，优先的，固定化时间为8h。

实施例4：固定化酶Lac@HKUST-1的酶学性质

(1)游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1的最适催化反应pH值

pH是影响酶活的一个重要因素，酶的构象易受pH变化而产生重大改变，从而引起酶活力损失；同时一些底物的溶解状态和pH变化也紧密相关。如图8所示，游离酶和固定化酶的最佳反应pH都为4.0。从图中可以明显看出固定化酶的酶活高于游离酶，这是因为固定化材料中含有铜，铜作为漆酶的无机辅酶因子，对漆酶的酶活有着很大的提升。

(2)游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1的最适催化反应温度

温度是影响酶催化反应活性的另一个重要因素。因此，本发明探究了游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1在不同温度体系下的催化反应活性。如图9所示，游离漆酶的最佳反应温度为50℃，固定化酶的最佳反应温度为60℃，比游离酶高出10℃，从而可以证明金属有机骨架HKUST-1对漆酶具有一定的保护作用。

(3)游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1的动力学常数

本实施例配制0-0.36mg·ml^-1浓度不等的底物ABTS，测定游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1的酶活，利用Lineweaver-Burk法得到图10，进一步可以求出其两者的K_m值及V_m。

表3.游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1的动力学常数表

Kinetic parameter	Free Lac	Lac@HKUST-1
			Km(g·L<sup>-1</sup>)	0.0251	0.0189
Vm(g·L<sup>-1</sup>·min<sup>-1</sup>)	0.1706	0.4635
			Kcat(min<sup>-1</sup>)	0.853	2.3175
Kcat/Km	33.984	122.619

如表3所示，游离酶的K_m值为0.0251g·L^-1，固定化酶的K_m值稍小，为0.0189g·L^-1。可见，漆酶经金属有机骨架HKUST-1固定化后，其与底物活性催化中心接触更加容易，即亲和力增强，所以K_m值变小。同时同对漆酶有激活作用，所以固定化酶Lac@HKUST-1的最大反应速度高于游离漆酶。

(4)游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1的pH稳定性

本实施例考察游离漆酶及其固定化酶Lac@HKUST-1在pH 4.0-7.0体系下培养0.5h后，在最佳反应pH下检测其酶活力保留情况。如图11所示，游离酶在pH6.5的环境下最稳定，固定化酶在pH5.5的情况下最稳定。与之前的图8对比可以发现，漆酶与ABTS反应由于受pH的限制，使得当pH大于6时漆酶与ABTS的反应急剧削弱，而并非是因为漆酶失活而导致漆酶与ABTS的反应减弱。

(5)游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1的热稳定性

通常酶促反应以及固定化酶的合成需要的时间较长，并且为了提高催化速率，反应需要在较高温度下进行，这对酶的热稳定性提出了很高的要求。虽然高温下可以提高酶的酶解速率，但是很容易引起酶的不可逆失活，从而失去了高酶解速率的意义。本实施例将游离漆酶及其固定化酶Lac@HKUST-1在30-70℃下培养0.5h后，测其相对酶活力。如图12所示，游离酶和固定化酶在40℃的条件下酶活最为稳定。在40-60℃范围内，固定化酶活力损失较少，游离酶损失近50％，当温度升致70℃时，游离酶完全失活，固定化酶仍保留游离酶最佳酶活的50％左右。由此可知，固定化酶的热稳定性得到显著增强，这说明HKUST-1孔道网络可为包埋于其中的酶分子提供稳定的刚性屏蔽空间，从而减小了高温引起酶变性失活。

(6)游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1对有机溶剂的耐受性

通常情况下，酶分子在水溶液或者缓冲溶液里进行酶促反应，然而，在实际的应用当中则要求漆酶能够在特殊溶剂(例如有机溶剂)中降解污染物。由于酶分子大多数是亲水性的，其表面的水化层容易遭受有机溶剂的破坏，导致酶活性有所损失，甚至完全失活。本实验将游离漆酶和固定化酶Lac@HKUST-1在甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜、乙腈以及N,N-二甲基甲酰胺有机溶剂-水混溶体系(V_有机溶剂：V_水＝3:7)中培养0.5h。通过测量其保留酶活，分析其对有机溶剂的耐受性。如图13所示，游离酶受乙腈的影响较为严重，仅剩25.8％的相对酶活，而固定化酶所保留的酶活力较游离酶高出32.7％；在其他有机溶剂-水混溶体系下，固定化酶的相对酶活力比游离酶高出近30％-40％甚至更多。这主要归功于HKUST-1孔道结构成功地对接近酶分子活性中心的有机溶剂形成了屏障，从而有效地减少了有机溶剂对酶分子水化层的破坏，同时Cu对漆酶有激活作用，使得固定化酶的酶活高于游离酶。

(7)游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1对金属离子的耐受性

金属离子对酶活力有一定的影响，本实施例将游离漆酶及Lac@HKUST-1在浓度为6.25mM的Mg²⁺，K⁺，Mn²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Na⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Ni⁺，Li⁺等金属离子溶液中培养30min，测其相对酶活力，将不加金属离子的游离酶设为100％。如表4所示，Cu²⁺和Na⁺对漆酶具有明显的刺激作用，而Fe²⁺，K⁺，Mn²⁺，Co²⁺和Ni⁺对酶有较强的抑制作用，其它如Mg²⁺，Zn²⁺，Li⁺对酶活力没有太大影响。基于以上实验分析，我们选用漆酶的无机辅酶因子Cu²⁺来形成金属有机骨架来对漆酶进行保护。同时实验中发现固定化酶Lac@HKUST-1对酶活力的保护比游离酶强，应该是HKUST-1骨架对酶分子起到了一定的保护作用。

表4.不同金属离子对游离漆酶及其固定化酶Lac@HKUST-1酶活力的影响

(8)游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1的贮藏稳定性

酶的贮藏稳定性问题是酶在工业化应用中必须面对的问题。本实施例将游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1保存在4℃的冰箱中。如图14所示，游离酶酶活在第9天后开始出现大幅下降，21天后相对酶活仅有50％左右，30天后，酶活仅剩6％。相比而言固定化酶的酶活较为稳定，酶活下降的速度较小且较为平缓，30天后，仍保留超过70％的相对酶活。这是由于材料HKUST-1提供了刚性屏蔽环境同时也限制了酶的构象使其没有发生变性，在很大程度上降低了酶活的损失。

(9)固定化酶Lac@HKUST-1的重复利用稳定性

重复利用稳定性作为衡量酶的固定化是否成功的一个重要参考标准。如图15所示，排除实验中离心等一系列破坏酶活力因素，在重复使用10次后，相对酶活力仍高达78.9％，说明固定化酶具有很强的操作稳定性。

实施例5：游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1降解BPA的应用测试

漆酶酶活的检测以及其对BPA的降解过程中，由于底物的不同所以最佳反应条件也会不一样，所以在降解BPA时我们要对其最佳反应条件另做分析。为了漆酶降解BPA的效率和反应速率，我们在降解体系中加入了介质ABTS。

(1)BPA浓度对游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1降解BPA的影响

如图16所示，我们分别做了7组浓度为25-400mg/L的对照实验。从图中我们可以发现，当BPA浓度低于100mg/L时游离酶的降解效果高于固定化酶，当BPA的浓度高于100mg/L时游离酶的降解效果开始下降，固定化酶的降解效果仍继续提高，当BPA的浓度达到400mg/L时游离酶的降解效果达到50％左右，固定化酶高达90％并且仍未出现下降趋势。接下来的实验中选用BPA的浓度均均为200mg/L。

(2)pH值对游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1降解BPA的影响

将固定化酶和游离酶分别置于pH不同的反应体系中反应12h，如图17所示，游离酶和固定化酶的最佳反应pH都为6.5。从图中我们可以看出，固定化酶降解BPA的效率和反应速率均高于游离酶。固定化酶的最高降解率可达到99％

(3)温度对游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1降解BPA的影响

将固定化酶和游离酶分别置于温度不同的反应体系中反应12h，如图18所示，游离酶的最佳反应温度都为40℃，当温度高于30℃时固定化酶的降解BPA的效率均高于98％，在50℃时，降解率更是高达100％。从图中我们可以看出，材料HKUST-1对酶具有一定的保护作用，同时对酶的活性有极大的提高。

(4)时间对游离漆酶及固定化酶Lac@HKUST-1降解BPA的影响

将固定化酶和游离酶分别置于最优降解条件下反应1-24h，如图19所示，在0-12h之间游离酶降解效果迅速增加，当降解时间高于12h后，降解效果开始稳定，最高降解率约为70.4％。固定化酶在0-4小时之间降解效果迅速增加，当时间高于4h后降解效果趋于平缓，最高降解率为100％。

Claims (7)

1.金属有机框架材料固定化漆酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

称取漆酶，用聚乙烯吡咯烷酮溶液混匀后，加入一水乙酸铜溶液混溶，再加入均苯三甲酸BTC溶液，充分混溶；在恒温水浴锅中25-35℃下静置培养2-12h，反应完毕后离心，反复清洗后的产物在冰箱中冷藏保存备用，得到金属有机框架材料固定化漆酶，记为Lac@HKUST-1；

所述一水乙酸铜溶液中铜离子的浓度为62.5-100mM；所述对均苯三甲酸BTC溶液的浓度为6.25-25mM。

2.根据权利要求1所述的金属有机框架材料固定化漆酶的制备方法，其特征在于，所述漆酶、聚乙烯吡咯烷酮溶液、一水乙酸铜溶液和均苯三甲酸溶液的用量为1mg：20μL：240μL：240μL，所述反应体系中漆酶的最终浓度为2mg/mL。

3.根据权利要求1所述的金属有机框架材料固定化漆酶的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的浓度为7.2mg/mL；所述一水乙酸铜溶液中铜离子的浓度为87.5mM；所述对均苯三甲酸(BTC)溶液的浓度为25mM。

4.根据权利要求1所述的金属有机框架材料固定化漆酶的制备方法，其特征在于，所述一水乙酸铜溶液和均苯三甲酸(BTC)溶液的溶剂均为NaAc-HAc缓冲溶液；所述NaAc-HAc缓冲溶液的pH为4.5-7.0，缓冲溶液的浓度为0.2mM。

5.根据权利要求4所述的金属有机框架材料固定化漆酶的制备方法，其特征在于，所述NaAc-HAc缓冲溶液的pH为6.5。

6.根据权利要求1所述的金属有机框架材料固定化漆酶的制备方法，其特征在于，所述静置培养的温度为30℃，时间为8h；冷藏保存的温度为4℃。

7.将权利要求1～6任一项所述制备方法制得的金属有机框架材料固定化漆酶用于降解BPA的用途。