CN111019933A - 一种固定化漆酶及制备方法及在抗生素降解中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定化漆酶及制备方法及在抗生素降解中的应用，制备方法为：将漆酶加到含有铜离子的溶液中混匀，再加入均苯三甲酸溶液，混匀，离心除去上清液，经洗涤液清洗后，真空干燥即得。本发明操作简单，能将酶包覆在载体内部，有机框架结构为酶提供了外壳保护，避免了在使用过程中因摩擦、剪切力等外部因素对酶结构造成的破坏。本发明不但避免了酶活降低，还大幅提高了酶活(该固定化方法所得到的固定化漆酶的酶活是等量游离漆酶活性的1.5～30倍)。本发明固定化漆酶对四环素、氨苄青霉素、四环素类衍生物和氨苄青霉素的衍生类等抗生素具高效催化降解能力，在极短时间即可达到接近完全降解的效果，且重复利用性好，不产生二次污染。

Description

一种固定化漆酶及制备方法及在抗生素降解中的应用
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种固定化漆酶及制备方法及在抗生素降解中的应用。
背景技术
抗生素(antibiotics)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的对病原微生物具有抑制或杀灭作用的一类化学物质。近年来，抗生素被广泛应用于医药、畜牧、种植业以及水产养殖等领域。由于抗生素的过量使用以及不能被完全代谢原因，造成大量抗生素进入环境，对水体及土壤等造成污染。进入土壤及水体中的抗生素不仅会通过生态系统的循环富集于动植物体内，还会促进耐药病原菌的繁殖甚至诱导超级细菌的产生，最终给人类带来严重危害。由于β-内酰胺类、四环类、大环内酯类抗生素的需求量最大，对环境造成的影响尤为突出。因此，对这几种抗生素的降解能有效缓解土壤及水体中的抗生素压力，使得土壤及水体中微生物得以正常发育繁殖，有助于维持生态系统的稳定性。到目前为止，已经有许多方法用于抗生素的去除，包括过滤、物理吸附、化学氧化、微生物降解、生物酶催化降解等。在所有的抗生素去除方法中，生物酶降解法可以被认为是一种对环境最友好的方法。
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，由于其催化底物广，漆酶被广泛应用于食品、造纸、药物合成、生物检测等领域。相较于真菌来源漆酶存在发酵周期长、分离纯化困难以及生产成本高等问题，细菌来源的枯草芽孢杆菌漆酶由于具有pH耐受性强、底物范围更广、更耐高温等优点，更适合在工业生产中进行应用。近年来漆酶在环境修复方面的应用日益引起人们的关注。但是，由于游离漆酶稳定性差、不可回收等缺点，加剧了处理成本的投入，使得漆酶在实际应用中受到限制。固定化技术的使用实现了酶的重复利用，在一定程度上降低了利用成本。但是，常规的固定化技术存在固定化效率低、酶活损失大、不稳定等缺陷。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种固定化漆酶。
本发明的第二个目的是提供一种固定化漆酶的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种固定化漆酶在抗生素降解中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种固定化漆酶的制备方法，包括如下步骤：
按比例，将2U漆酶加入到1～200mL浓度为0.5～10mM含有铜离子的溶液中混匀，再加入0.1～200mL浓度为0.5～50mM均苯三甲酸溶液，混匀，离心除去上清液，经洗涤液清洗后，真空干燥得固定化漆酶粉末。
含有铜离子的溶液优选为乙酸铜溶液、氯化铜溶液或硫酸铜溶液。
含有铜离子的溶液的溶剂为水、pH＝4.5～7.0的柠檬酸缓冲液、pH＝4.5～7.0的醋酸缓冲液和pH＝4.5～7.0的甘氨酸缓冲液中至少一种。
均苯三甲酸溶液的溶剂优选：二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙腈、pH＝7.0～9.5的Tris-HCl缓冲液、pH＝8.6～10.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和pH＝9.2～10.8的碳酸-碳酸钠缓冲液中的至少一种。
洗涤液为水、pH＝4.5～7.0的柠檬酸缓冲液、pH＝4.5～5.8的醋酸缓冲液和pH＝4.5～5.9的邻苯二甲酸-氢氧化钠缓冲液中至少一种。
上述制备方法制备的固定化漆酶。
上述固定化漆酶在抗生素降解中的应用。
本发明的优点：
本发明利用一步法在水溶液中直接实现了漆酶的固定化。相较于先合成固定化载体，后将酶经过修饰进行酶固定化的方法，本发明合成过程操作步骤简单，能将酶包覆在载体内部，有机框架结构为酶提供了外壳保护，避免了在使用过程中因摩擦、剪切力等外部因素对酶结构造成的破坏。另外，一般的固定化过程都会导致酶活损失，本发明的方法不但避免了酶活降低，还大幅提高了酶活(该固定化方法所得到的固定化漆酶的酶活是等量游离漆酶活性的1.5～30倍)。另外，本发明中的固定化漆酶对四环素、氨苄青霉素、四环素类衍生物和氨苄青霉素的衍生类抗生素具高效催化降解能力，在极短的时间即可达到接近完全降解的效果，且重复利用性好，不产生二次污染，实现对不同类抗生素的有效去除。
附图说明
图1为游离漆酶(Laccase)和固定化漆酶(Laccase@Cu-BTC)在不同温度下的相对酶活性能图。
图2为Laccase和Laccase@Cu-BTC在不同pH下的相对酶活性能图。
图3为等量Laccase和Laccase@Cu-BTC对四环素(Tetracycline)在相同时间内(30分钟)的降解效果图a),以及等量Laccase和Laccase@Cu-BTC对Tetracycline(100μg/mL)降解效果时程曲线图b)。
图4为Laccase@Cu-BTC对Tetracycline降解的操作稳定性图。
图5为Tetracycline经Laccase与Laccase@Cu-BTC降解前后对大肠杆菌(E.coli)a)与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)b)的抑菌效果图。1为Tetracycline(10μg/mL)，2为Tetracycline(10μg/mL)经Laccase处理30分钟后的液体，3为Tetracycline(10μg/mL)经固定化载体(Cu-BTC)处理30分钟后的样本，4为Tetracycline(10μg/mL)经Laccase@Cu-BTC处理30分钟后的样本。
图6为不同浓度Tetracycline经Laccase与Laccase@Cu-BTC降解前后对E.coli a)与B.subtilis)b)的毒性作用。其中带方块的线条、带圆形的线条与带三角形状的线条分别代表Tetracycline、Tetracycline经Laccase处理120分钟的样本、Tetracycline经Laccase@Cu-BTC处理30分钟的样本。
图7为等量Laccase和Laccase@Cu-BTC对氨苄青霉素(Ampicillin)在相同时间内(30分钟)的降解效果图a),以及等量Laccase和Laccase@Cu-BTC对Ampicillin(100μg/mL)降解效果时程曲线图b)。
图8为Laccase@Cu-BTC对Ampicillin降解的操作稳定性图。
图9为Ampicillin经Laccase与Laccase@Cu-BTC降解前后对E.coli a)与B.subtilis b)的抑菌效果图。1为Ampicillin(10μg/mL)，2为Ampicillin(10μg/mL)经Laccase处理30分钟后的液体，3为Ampicillin(10μg/mL)经Cu-BTC处理30分钟后的样本，4为Ampicillin(10μg/mL)经Laccase@Cu-BTC处理30分钟后的样本。
图10为不同浓度Ampicillin经Laccase与Laccase@Cu-BTC降解前后对E.coli a)与B.subtilis b)的毒性作用。其中带方块的线条、带圆形的线条与带三角形状的线条分别代表Ampicillin、Ampicillin经Laccase处理120分钟的样本、Ampicillin经Laccase@Cu-BTC处理30分钟的样本。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，但并不因此而限制本发明的保护范围。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
漆酶基因(SEQ ID NO:1)的来源为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；所述漆酶基因的GenBank号为：JN043511.1；所述漆酶的酶活通过测定漆酶对ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)的氧化速率计算得到；所述漆酶是指漆酶含有枯草芽孢杆菌漆酶基因的菌，并通过发酵所得到的菌体、含有枯草芽孢杆菌漆酶的粗酶液、经过纯化手段获取到的漆酶酶液及粉末；所述漆酶酶活测定的条件如下：将漆酶加入到ABTS溶液中(0.5mM，pH＝5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液)，在30℃条件下孵育3min，利用分光光度计测定420nm处的吸光值(以相同的醋酸-醋酸钠缓冲液作为空白对照)。漆酶酶活计算公式如下：
Figure BDA0002306498530000031
N：酶液稀释倍数
V1：漆酶酶活测定反应体系的终体积
V2：反应添加的酶液体积
Δ420：T时间内反应液在420nm吸光度的增加值
36000：420nm处ABTS氧化态的摩尔吸光系数(L/mol·cm)
T:反应时间
L：比色皿直径(cm)
实施例1
一种固定化漆酶的制备方法，包括如下步骤：
将2U漆酶加入到1mL浓度为10mM乙酸铜溶液中(该溶液的溶剂为pH＝5.5的柠檬酸缓冲液)混匀，再加入0.1mL浓度为50mM均苯三甲酸的二甲基亚砜溶液，混匀5min后，经1000转/min离心10min除去上清液，用水重悬洗涤3次后，经真空干燥得固定化漆酶(Laccase@Cu-BTC)。
对干燥后的固体进行称重，固体质量为20mg，固定化载体的酶载量为20mg/g，酶活为13U，在等量酶量的情况下，固定化漆酶的酶活比游离酶酶活提高了6.5倍。
关于游离漆酶与固定化漆酶的酶活性能测定研究及漆酶固载率的计算：
取两份2μg的漆酶，一份直接测定酶活；另一份加入到1mL浓度为10mM乙酸铜溶液中(该溶液的溶剂为50mM,pH＝5.5的柠檬酸缓冲液)混匀，再加入0.1mL浓度为50mM均苯三甲酸的二甲基亚砜溶液，混匀5min后，经1000转/min离心10min取出上清液，沉淀经醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5,50mM)洗涤3次。沉淀用于酶活测定，上清液用考马斯亮蓝法测蛋白含量。
酶活测定体系如下:将游离酶或固定化漆酶置于1mL浓度为1mM的ABTS溶液(pH4.5,浓度为50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液)中，37℃，250转/min晃动2min,然后通过测定420nm处吸光度变化来计算酶活(ε420＝36,000M-1 cm-1)。
关于游离漆酶和固定化漆酶在不同温度和pH条件下的相对酶活性能测定研究：
游离漆酶和固定化漆酶在不同温度条件下的相对酶活性能测定研究：取等量(按蛋白量计算)的漆酶与固定化漆酶分别置于温度为30，40，50，60，70，80，90℃、浓度为0.1mMABTS的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(50mM，pH＝4.5)中孵育两分钟，测定420nm处吸光度变化来计算酶活(ε420＝36,000M-1 cm-1)。分别以漆酶与固定化漆酶的最高活性作为分母，其他温度条件下的酶活作为分子，作出相对酶活曲线。
游离漆酶和固定化漆酶在不同pH条件下的相对酶活性能测定研究：将等量(按蛋白量计算)的漆酶与固定化漆酶分别置于pH分别为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5,7.0，7.5并含有0.1mM ABTS的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(50mM，pH＝4.5)中，在30℃下孵育两分钟，测定420nm处吸光度变化来计算酶活(ε420＝36,000M-1 cm-1)。分别以漆酶与固定化漆酶的最高活性作为分母，其他pH条件下的酶活作为分子，作出相对酶活曲线。
图1为游离漆酶(Laccase)和固定化漆酶(Laccase@Cu-BTC)在不同温度下的相对酶活性能图。
图2为Laccase和Laccase@Cu-BTC在不同pH下的相对酶活性能图。由图可知，Laccase的最高酶活位于60℃条件下，而Laccase@Cu-BTC的最高酶活位于80℃，Laccase@Cu-BTC在pH＝4.0时仍然具有很高的酶活。说明相对于Laccase，Laccase@Cu-BTC的温度适应性更广且更加耐受酸性条件。
实施例2
一种固定化漆酶的制备方法，包括如下步骤：
将2U漆酶加入到200mL浓度为0.5mM的氯化铜溶液(该溶液的溶剂pH＝5.0的醋酸缓冲液)中混匀，再加入200mL浓度为0.5mM的均苯三甲酸的乙醇溶液，混匀5min，经1000转/min离心10min除去上清液，用pH＝5.5的柠檬酸缓冲液重悬洗涤3次后，经真空干燥后得到固定化漆酶(Laccase@Cu-BTC)。
对干燥后的固体进行称重，固体质量为30.5mg，固定化载体的酶载量为13.1mg/g，总酶活为32U，在等量酶量的情况下，固定化漆酶的酶活比游离酶酶活提高了16倍。
实施例3
一种提高漆酶活性的固定化方法，包括以下步骤：
将2U漆酶加入到150mL浓度为5mM的硫酸铜溶液中(该溶液的溶剂为pH＝5.5的甘氨酸缓冲液)中混匀，再加入10mL浓度为15mM均苯三甲酸溶液(该溶液的溶剂为pH＝7.8的Tris-HCl缓冲液)，混匀5min后，经1000转/min离心10min除去上清液，固体用pH＝5.5的醋酸缓冲液重悬洗涤3次后，经真空干燥后得到固定化漆酶(Laccase@Cu-BTC)。
对干燥后的固体进行称重，固体质量为60.5mg，固定化载体的酶载量为6.7mg/g，总酶活为60U，在等量酶量的情况下，固定化漆酶的酶活比游离酶酶活提高了30倍。
实验证明，用水、pH＝4.5柠檬酸缓冲液、pH＝7.0柠檬酸缓冲液、pH＝4.5醋酸缓冲液、pH＝7.0醋酸缓冲液、pH＝4.5甘氨酸缓冲液、pH＝7.0的甘氨酸缓冲液、体积比为1：1的pH＝4.5柠檬酸缓冲液和pH＝4.5甘氨酸缓冲液的混合液替代本实施例的pH＝5.5的甘氨酸缓冲液作为硫酸铜溶液的溶剂，其它同本实施例，分别制备出相应的固定化漆酶。
实验证明，用甲醇、乙腈、pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液、pH＝9.5的Tris-HCl缓冲液、pH＝8.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、pH＝10.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、pH＝9.2的碳酸-碳酸钠缓冲液、pH＝10.8的碳酸-碳酸钠缓冲液替代本实施例的pH＝7.8的Tris-HCl缓冲液作为均苯三甲酸溶液的溶剂，其它同本实施例，分别制备出相应的固定化漆酶。
实验证明，用pH＝4.5的柠檬酸缓冲液、pH＝7.0的柠檬酸缓冲液、pH＝4.5醋酸缓冲液、pH＝5.8的醋酸缓冲液、pH＝4.5的邻苯二甲酸氢氧化钠缓冲液、pH＝5.9的邻苯二甲酸氢氧化钠缓冲液、体积比为1：1的pH＝4.5的柠檬酸缓冲液和pH＝4.5的醋酸缓冲液的混合液替代本实施例中的pH＝5.5的醋酸缓冲液作为洗涤液，其它同本实施例，分别制备出相应的固定化漆酶。
实施例4
实施例1制备的固定化漆酶在催化四环素降解中的应用，包括以下步骤：
取实施例1制备的10mg的固定化漆酶置于1mL水中超声分散5min,加入到10mL、100μg/mL四环素的水混悬液中,在水浴摇床中37℃，150转/min，30分钟即可完成四环素的降解。
游离漆酶和固定化漆酶对四环素降解效果随时间变化的关系的研究：
将4U的游离漆酶以及4U游离漆酶经固定化后获得的固定化漆酶分别置于2mL、含有100μg/mL四环素的水中孵育，在孵育开始后5，10，20，30，40，50，60，90，120min后取样进行液相检测。并以100μg/mL的四环素的水混悬液作为对照。四环素的检测是通过液相色谱进行，检测条件：安捷伦液相色谱，C18反相检测柱(25cm)，30℃，流动相为水/乙腈；检测波长357nm；流速1mL/min；流动相条件：0～3min,水/乙腈(v/v)＝85/15；3～10min,水/乙腈＝85/15-60/40；10～13min,水/乙腈(v/v)＝85/15。
固定化漆酶降解四环素过程中操作稳定性测定的研究：
将20mg的固定化漆酶置于100μg/mL四环素的水中，37℃下孵育30分钟，然后离心取出上清液并将沉淀中加入新的100μg/mL四环素的水混悬液中，再次37℃下孵育30分钟，离心去上清，重复5次。上清经液相色谱检测，检测方法同游离漆酶和固定化漆酶对四环素降解效果随时间变化的关系的研究中四环素的检测。
图3为等量Laccase和Laccase@Cu-BTC对四环素(Tetracycline)在相同时间内(30分钟)的降解效果图a),以及等量Laccase和Laccase@Cu-BTC对Tetracycline(100μg/mL)降解效果时程曲线图b)。由图可知，相对于Laccase，Laccase@Cu-BTC对Tetracycline的降解速率更快(Laccase完全降解100μg/mL的Tetracycline所需要的时间大于120分钟而等量Laccase@Cu-BTC只需要三十分钟)，降解更彻底。
图4为Laccase@Cu-BTC对Tetracycline降解的操作稳定性图。并且重复利用6次的降解率仍达80％以上，具有非常好的操作重复利用性。
游离漆酶和固定化漆酶对四环素的抗生素活性去除的研究：
游离漆酶和固定化漆酶对四环素降解前后的抑菌活性：将大肠杆菌(BL21(DE3))种子液和枯草芽孢杆菌(CICC20613)种子液分别置于2管LB液体培养基中进行活化，37℃，220转/min培养8h,然后分别取活化好的大肠杆菌液体和枯草芽孢杆菌液体100μL，分别涂布于两个无抗性的LB平板后，静置5min。每个平板放置4个牛津杯，并在牛津杯中分别加入50μL浓度为100μg/mL的四环素、100μg/mL的四环素经游离漆酶处理120分钟后的样品、100μg/mL的四环素经Cu-BTC(固定化漆酶的载体)处理30分钟后的样品、100μg/mL的四环素经固定化漆酶降解30分钟后的样品。将平板置于37℃培养箱中进行过夜培养。
Cu-BTC的制备：
将1mL浓度为10mM乙酸铜溶液(该溶液的溶剂为pH＝5.5的柠檬酸缓冲液)，与0.1mL浓度为50mM均苯三甲酸的二甲基亚砜溶液，混匀5min后，经1000转/min离心10min除去上清液，用水重悬洗涤3次后，经真空干燥得Cu-BTC。
不同浓度四环素经游离漆酶和固定化漆酶降解前后对细菌的毒性作用：
将大肠杆菌种子液置于LB液体培养基中进行活化，37℃，220转/min培养8h,然后取活化好的大肠杆菌液体5μL，接种于新的盛有5mL的LB培养基的无菌小试管中，接种40管。每12管接种大肠杆菌的小试管为一组，共4组(剩下不够12支的作为对照组)。在第一组的12支小试管中分别加入不同浓度的四环素，在第二组的12支小试管中分别加入不同浓度的四环素经游离酶降解120分钟的样品，在第三组的12支小试管中分别加入不同浓度四环素的经固定化漆酶降解30分钟的样品，第四组的4支小试管作为对照组。37℃，220转/min培养8h,通过测定600nm处的吸光度来计算大肠杆菌的菌体密度，并于空白对照组进行比较，计算出抑菌率。此实验重复三次取平均值。
将枯草芽孢杆菌种子液置于LB液体培养基中进行活化，37℃，220转/min培养8h,然后取活化好的枯草芽孢杆菌液体5μL，接种于新的盛有5mL的LB培养基的无菌小试管中，接种40管。每12管接种枯草芽孢杆菌的小试管为一组，共4组(剩下不够12支的作为对照组)。在第一组的12支小试管中分别加入不同浓度的四环素，在第二组的12支小试管中分别加入不同浓度的四环素经游离酶降解120分钟的样品，在第三组的12支小试管中分别加入不同浓度四环素的经固定化漆酶降解30分钟的样品，第四组的4支小试管作为对照组。37℃，220转/min培养8h,通过测定600nm处的吸光度来计算枯草芽孢杆菌的菌体密度，并于空白对照组进行比较，计算出抑菌率。此实验重复三次取平均值。
图5为Tetracycline经Laccase与Laccase@Cu-BTC降解前后对大肠杆菌(E.coli)a)与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)b)的抑菌效果图。1为Tetracycline(10μg/mL)，2为Tetracycline(10μg/mL)经Laccase处理30分钟后的液体，3为Tetracycline(10μg/mL)经固定化载体(Cu-BTC)处理30分钟后的样本，4为Tetracycline(10μg/mL)经Laccase@Cu-BTC处理30分钟后的样本。
图6为不同浓度Tetracycline经Laccase与Laccase@Cu-BTC降解前后对E.coli a)与B.subtilis)b)的毒性作用。其中带方块的线条、带圆形的线条与带三角形状的线条分别代表Tetracycline、Tetracycline经Laccase处理120分钟的样本、Tetracycline经Laccase@Cu-BTC处理30分钟的样本。
由图5可知，Tetracycline对E.coli与B.subtilis具有非常明显的抑菌效果；在Tetracycline溶液中加入Cu-BTC并不会引起Tetracycline的降解，说明固定化的载体本身(Cu-BTC)对Tetracycline没有降解作用；只有加入Laccase或者Laccase@Cu-BTC才会对Tetracycline起到有效的降解作用，并且降解后的产物失去了抗生素活性。
由图6可知，Tetracycline经Laccase或者Laccase@Cu-BTC降解后的产物对E.coli以及B.subtilis的生长的抑制作用大大降低(只有在高浓度下才会显示出轻微的抑制效果)。Tetracycline经Laccase或者Laccase@Cu-BTC催化后得到的降解产物在100μg/mL的浓度下E.coli的生长率超过60％，B.subtilis的生长率超过80％。说明利用Laccase@Cu-BTC对Tetracycline进行降解可以去除Tetracycline的抗生素活性，并且可以大大降低抗生素对微生物生长的干扰作用；相比于等量Tetracycline，利用Laccase@Cu-BTC对Tetracycline进行降解后得到的产物的生态毒性大幅减轻。
实施例5
实施例2制备的固定化漆酶在催化四环素降解中的应用，包括以下步骤：
取实施例2制备的10mg的固定化漆酶置于1mL水中，超声分散5min,然后将上述混悬液加入到10mL含有100μg/mL四环素的水混悬液中,在水浴摇床中37℃，150转/min，30分钟即可完成四环素的降解。
实施例6
实施例1制备的固定化漆酶在催化氨苄青霉素降解中的应用，包括以下步骤：
将实施例1制备的10mg的固定化漆酶置于1mL水中，超声分散5min,然后将上述混悬液加入到10mL100μg/mL氨苄青霉素的水混悬液中,在水浴摇床中37℃，150转/min，30分钟即可完成氨苄青霉素的降解。
关于游离漆酶和固定化漆酶对氨苄青霉素降解性能的研究：
游离漆酶和固定化漆酶对氨苄青霉素降解效果的研究：将2U的游离漆酶以及2U游离漆酶经固定化后获得的固定化漆酶(0.08mg)分别置于1mL含有100μg/mL氨苄青霉素的水中孵育30min后进行液相检测。并以100μg/mL的氨苄青霉素的水混悬液作为对照。检测条件：安捷伦液相色谱，C18反相检测柱(25cm)，30℃，流动相为水/乙腈；检测波长357nm；流速1mL/min；液相条件：安捷伦液相色谱，C18反相检测柱(25cm)，30℃，流动相为水/乙腈；检测波长262nm；流速1mL/min；流动相条件：水/乙腈(v/v)＝70/30。
游离漆酶和固定化漆酶对氨苄青霉素降解效果随时间变化的关系：将4U的游离漆酶以4U游离漆酶经固定化后获得的固定化漆酶分别置于2mL含有100μg/mL氨苄青霉素的水中(50mM,pH 6.5)孵育，在孵育开始后5，10，20，30，40，50，60，90，120min后取样进行液相检测。并以100μg/mL的氨苄青霉素素作为对照。液相检测条件同游离漆酶和固定化漆酶对氨苄青霉素降解效果中氨苄青霉素的检测。
固定化漆酶降解氨苄青霉素过程中操作稳定性测定：将20mg的固定化漆酶置于含有100μg/mL氨苄青霉素的水中，37℃下孵育1小时，然后离心取出上清液并将沉淀中加入新的含有100μg/mL氨苄青霉素的水中，再次37℃下孵育30分钟，离心去上清，重复5次。上清经液相色谱检测，液相检测条件同游离漆酶和固定化漆酶对氨苄青霉素降解效果中氨苄青霉素的检测。
图7为等量Laccase和Laccase@Cu-BTC对氨苄青霉素(Ampicillin)在相同时间内(30分钟)的降解效果图a),以及等量Laccase和Laccase@Cu-BTC对Ampicillin(100μg/mL)降解效果时程曲线图b)。由图可知，相对于Laccase，Laccase@Cu-BTC对Ampicillin的降解速率更快(Laccase降解100μg/mL的Ampicillin需要120分钟，而Laccase@Cu-BTC只需要30分钟)，并且利用Laccase@Cu-BTC对Ampicillin的降解更为彻底。图8为Laccase@Cu-BTC对Ampicillin降解的操作稳定性图。Laccase@Cu-BTC重复利用6次对Ampicillin的降解率仍达80％以上，具有非常好的操作重复利用性。
关于游离漆酶和固定化漆酶对氨苄青霉素活性降解的研究：
游离漆酶和固定化漆酶对氨苄青霉素降解前后的抑菌活性：将大肠杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液分别置于2管LB液体培养基中进行活化，37℃，220转/min培养8h,然后分别取活化好的大肠杆菌液体和枯草芽孢杆菌液体100μL，分别涂布于两个无抗性的LB平板后，静置5min。每个平板放置4个牛津杯，并在牛津杯中分别加入50μL浓度为50μg/mL的氨苄青霉素、50μg/mL的氨苄青霉素经游离漆酶处理120分钟后的样品、50μg/mL的氨苄青霉素经Cu-BTC处理30分钟后的样品、50μg/mL的氨苄青霉素经固定化漆酶降解30分钟后的样品。将平板置于37℃培养箱中进行过夜培养。
不同浓度氨苄青霉素经游离漆酶和固定化漆酶降解前后对细菌的毒性作用：将大肠杆菌种子液种子液置于LB液体培养基中进行活化，37℃，220转/min培养8h,然后取活化好的大肠杆菌液体5μL，接种于新的盛有5mL的LB培养基的无菌小试管中，接种40管。每12管接种大肠杆菌的小试管为一组，共4组(剩下不够12支的作为对照组)。在第一组的12支小试管中分别加入不同浓度的氨苄青霉素，在第二组的12支小试管中分别加入不同浓度的氨苄青霉素经游离酶降解120分钟的样品，在第三组的12支小试管中分别加入不同浓度氨苄青霉素的经固定化漆酶降解30分钟的样品，第四组的4支小试管作为对照组。37℃，220转/min培养8h,通过测定600nm处的吸光度来计算大肠杆菌的菌体密度，并于空白对照组进行比较，计算出抑菌率。此实验重复三次取平均值。
将枯草芽孢杆菌种子液置于LB液体培养基中进行活化，37℃，220转/min培养8h,然后取活化好的枯草芽孢杆菌液体5μL，接种于新的盛有5mL的LB培养基的无菌小试管中，接种40管。每12管接种枯草芽孢杆菌的小试管为一组，共4组(剩下不够12支的作为对照组)。在第一组的12支小试管中分别加入不同浓度的氨苄青霉素水混悬液，在第二组的12支小试管中分别加入不同浓度的氨苄青霉素经游离酶降解120分钟的样品，在第三组的12支小试管中分别加入不同浓度氨苄青霉素的经固定化漆酶降解30分钟的样品，第四组的4支小试管作为对照组。37℃，220转/min培养8h,通过测定600nm处的吸光度来计算枯草芽孢杆菌的菌体密度，并于空白对照组进行比较，计算出抑菌率。此实验重复三次取平均值。
图9为Ampicillin经Laccase与Laccase@Cu-BTC降解前后对E.coli a)与B.subtilis b)的抑菌效果图。1为Ampicillin(10μg/mL)，2为Ampicillin(10μg/mL)经Laccase处理30分钟后的液体，3为Ampicillin(10μg/mL)经Cu-BTC处理30分钟后的样本，4为Ampicillin(10μg/mL)经Laccase@Cu-BTC处理30分钟后的样本。图10为不同浓度Ampicillin经Laccase与Laccase@Cu-BTC降解前后对E.coli a)与B.subtilis b)的毒性作用。其中带方块的线条、带圆形的线条与带三角形状的线条分别代表Ampicillin、Ampicillin经Laccase处理120分钟的样本、Ampicillin经Laccase@Cu-BTC处理30分钟的样本。由图可知，氨苄青霉素对E.coli与B.subtilis具有非常明显的抑菌效果；在Ampicillin溶液中加入Cu-BTC并不会引起Ampicillin的降解，说明用于酶固定化的载体并不能对Ampicillin产生降解作用；只有加入Laccase或者Laccase@Cu-BTC才会对Ampicillin起到有效的降解作用，并且降解后的产物失去了抗生素活性，对E.coli以及B.subtilis的生长的抑制作用消失(只有高浓度条件下才会出现轻微抑制现象)。在Ampicillin浓度为100μg/mL的条件下，经Laccase或者Laccase@Cu-BTC催化后，E.coli的生长率超过80％，B.subtilis的生长率超过90％。说明利用B.subtilis对Ampicillin进行降解可以去除Ampicillin的抗生素活性，并且可以大大降低抗生素对微生物生长的干扰作用；相比于等量Ampicillin，利用Laccase@Cu-BTC对Ampicillin进行降解后得到的产物的生态毒性大幅减轻。
实施例7
实施例3制备的固定化漆酶在催化氨苄青霉素降解中的应用，包括以下步骤：
将实施例2制备的10mg的固定化漆酶置于1mL水中，超声分散5min,然后将上述混悬液加入到10mL含有100μg/mL氨苄青霉素的甘氨酸缓冲液中(酸性环境，50mM,pH＝6.8),在水浴摇床中37℃，150转/min，30分钟即可完成氨苄青霉素的去除。
实施例8
实施例3制备的固定化漆酶在催化四环素与氨苄青霉素混合溶液降解中的应用，包括以下步骤：
将实施例2制备的10mg的固定化漆酶置于1mL水中，超声分散5min,然后将上述混悬液加入到10mL含有50μg/mL四环素以及50μg/mL氨苄青霉素的水混悬液中,在水浴摇床摇床中37℃，150转/min，30分钟即可完成氨苄青霉素的去除。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的任何改进和变动，这些改进和变动也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种固定化漆酶及制备方法及在抗生素降解中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1542
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
atgacacttg aaaaatttgt ggatgctctc ccaatcccag atacactaaa gccggtacag 60
cagtcaaaag atagcacata ctacgaagta accatggagg aatgctacca tcagcttcac 120
cgcgatctcc ctccaacccg cttgtggggc tataacggtt tattccccgg tcccaccatt 180
aaggccaaaa gaaatgaaaa cgtttatgtg aaatggatga ataaccttcc ttcagagcat 240
tttcttccga ttgatcacac cattcatcac agtgacagcc agcatgccga acccgaggtg 300
aaaaccgtcg ttcatttaca cggcggcgtc actccagatg acagcgacgg ttatcctgag 360
gcctggtttt ctaaagactt tgaacaaaca ggcccttatt ttaaacgaga ggtttaccat 420
tatccaaatc agcagcgcgg agctatttta tggtatcacg atcatgctat ggcgctcacg 480
aggctgaatg tgtatgccgg gctcatcggt gcttatatca tccatgaacc aaaggaaaaa 540
cgtctaaagc tcccatcagg tgaatacgat gtgccgcttt tgatcacgga ccgtacgatt 600
aatgaagatg gctctttatt ttatccgagc ggaccggaaa acccttcacc gtcactgcca 660
aatccgtcaa tcgttccagc cttttgcgga gatacaattc tcgtcaacgg gaaggcatgg 720
ccatacatgg aggtcgaacc gagaaaatac cgtttccgcg tcatcaatgc ctctaatacg 780
agaacatata acctgtcact tgataatggc ggagaattta tccagatcgg ttctgacggc 840
ggacttttgc cgcgctccgt caagctaaac tctttcagta tcgcgccagc tgagcgcttt 900
gatatcctca ttgacttcgc cgcgtttgaa ggacaatcga ttattttagc aaacagcgag 960
ggctgcggcg gcgacgttaa tccggaaaca gacgcaaaca tcatgcaatt cagagtcaca 1020
aaaccgttag cccaaaaaga cgaaagcaga aagccaaaat acctggcatc ttacccttcg 1080
gtacagcatg aaagaataca aaacctccga acattgaagc tggcaggcac tcaagaccaa 1140
tacggcagac ccgtccttct tcttaacaac aaacgctggc acgatcctgt cactgaagca 1200
ccgaaagtcg gttctaccga aatatggtcg attatcaacc cgactcgcgg aacacatccg 1260
atccatcttc atttggtctc cttccgtgta ttggaccggc gcccatttga tacagcccgt 1320
tttgaagagc gcggagaact ggcctacacc ggacccgccg ttccgccgcc accaagtgaa 1380
aaaggctgga aagacacggt tcagtcccac gccggtgaag tcctgagaat cgccgtaaca 1440
ttcgggccat acactgggcg gtacgtatgg cattgccaca ttcttgagca tgaagactat 1500
gacatgatga gaccgatgga tataactgat ccccataaat ag 1542

Claims (7)

1.一种固定化漆酶的制备方法，其特征是包括如下步骤：
按比例，将2U漆酶加入到1～200mL浓度为0.5～10mM含有铜离子的溶液中混匀，再加入0.1～200mL浓度为0.5～50mM均苯三甲酸溶液，混匀，离心除去上清液，经洗涤液清洗后，真空干燥得固定化漆酶粉末。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述含有铜离子的溶液为乙酸铜溶液、氯化铜溶液或硫酸铜溶液。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是所述含有铜离子的溶液的溶剂为水、pH＝4.5～7.0的柠檬酸缓冲液、pH＝4.5～7.0的醋酸缓冲液和pH＝4.5～7.0的甘氨酸缓冲液中至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述均苯三甲酸溶液的溶剂为二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙腈、pH＝7.0～9.5的Tris-HCl缓冲液、pH＝8.6～10.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和pH＝9.2～10.8的碳酸-碳酸钠缓冲液中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述洗涤液为水、pH＝4.5～7.0的柠檬酸缓冲液、pH＝4.5～5.8的醋酸缓冲液和pH＝4.5～5.9的邻苯二甲酸-氢氧化钠缓冲液中至少一种。
6.权利要求1-5之一的制备方法制备的固定化漆酶。
7.权利要求6的固定化漆酶在抗生素降解中的应用。
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