CN115417507B

CN115417507B - 一种高效降解兽药抗生素残留的漆酶及其应用

Info

Publication number: CN115417507B
Application number: CN202210737434.4A
Authority: CN
Inventors: 沐万孟; 徐炜; 欧阳斌斌; 张文立
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-06-21
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2042-06-21
Also published as: CN115417507A

Abstract

本发明公开了一种高效降解兽药抗生素残留的漆酶及其应用，属于环境生物技术领域。本发明筛选到一种来源于Lysinibacillus fusiformis的漆酶，相比现有的技术，本发明筛选到的漆酶能够耐受80℃的高温，具有在更高温度下长时间稳定降解抗生素，良好的耐热性和优异的降解效率等能力。能够在短时间内降解大量抗生素，并且生产成本低，所用设备少，有助于工业上对兽药抗生素残留的控制。

Description

一种高效降解兽药抗生素残留的漆酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种高效降解兽药抗生素残留的漆酶及其应用，具体涉及设计编码漆酶的1569bp的核苷酸序列和它对应的氨基酸序列，以及应用漆酶降解磺胺类和四环素类抗生素，属于环境生物技术领域。

背景技术

磺胺类抗生素是一类人为合成、性质稳定的广谱抗菌药物，包括含有对位氨基苯磺酰胺基本结构的磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、甲氧嘧啶等多种药物。四环素类抗生素是一类由放线菌产生的一类广谱抗菌药物，包括含有并四苯基本结构的金霉素，土霉素，四环素等多种药物。磺胺类药物的化学结构与PABA类似，其抗菌机理主要是能与PABA竞争二氢叶酸合成酶，影响了二氢叶酸的合成，从而影响病原菌DNA的合成，起到抗菌效果。四环素类抗生素抗菌机制主要是通过特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰－tRNA在该位上的联结，从而抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。这些优良的抗菌性能使得抗生素被广泛使用于现代化、集群化的养殖业，畜牧业中。

由于兽药抗生素的过度长期使用，导致了水产品、畜禽产品以及环境中大量的兽药残留的抗生素。长期食用兽药残留超标的食品，人体内将蓄积到一定浓度兽药抗生素，最终对人体产生多种急、慢性中毒，如：磺胺类药物能破坏人体造血机能，红霉素等大环内酯类抗生素引起急性肝损伤和听觉障碍。同时，长期使用兽药，以及流入环境中的兽药残留将会导致抗生素耐药基因的传播，诱导出现耐药性菌株，从而对现代医学造成严重的危害。

绿色生物酶法控制环境中残留的兽药抗生素，因其高效的降解率，对环境的友好性而吸引了广泛的的关注。迄今为止，已报道多种氧化还原酶能够有效降解抗生素，如：漆酶、锰过氧化物酶、辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶等，其降解机制通常为氧化还原反应，通过产生大量自由基如羟自由基等来氧化还原降解兽药抗生素。生物酶法是目前工业上的热点方法，利用分子生物技术和基因工程技术，可以将外源的降解酶基因表达于合适的载体上，从而高效表达大量稳定性好且酶活高的兽药抗生素降解酶。

如表1所示，现有报道的来源于Bacillus subtilis的漆酶的最适温度为60℃(Heterologous expression of bacterial CotA-laccase,characterization and itsapplication for biodegradation of malachite green.2021年)、来源于Geobactermetallireducens的漆酶最适温度为75℃(Isolation and characterization of aheterologously expressed bacterial laccase from the anaerobe Geobactermetallireducens.2018年)、来源于Pycnoporus sp.SYBC-L10的漆酶最适温度为70℃(Characterization of a robust cold-adapted and thermostable laccase fromPycnoporus sp.SYBC-L10 with a strong ability for the degradation oftetracycline and oxytetracycline by laccase-mediated oxidation.2020年)、来源于Echinodontium taxodii 2538的漆酶最适温度为60℃(Biochemical and molecularcharacterization of a novel laccase from selective lignin-degrading white-rotfungus Echinodontium taxodii 2538.2014年)。

如表2所示，目前有报道来源于Echinodontium taxodii和Pleurotus ostreatusHAUCC 162的漆酶对于磺胺类抗生素有较好的降解效果，但对四环素类抗生素无降解效果(Removal of sulfonamide antibiotics by oriented immobilized laccase on Fe₃O₄nanoparticles with natural mediators.2014年；Heterologous expression andcharacterization of three laccases obtained from Pleurotus ostreatus HAUCC162for removal of environmental pollutants.2018年)；来源于Bacillus subtilis、Cerrena sp.HYB07、Pycnoporus sp.SYBC-L10的漆酶对于四环素类抗生素有较好的降解效果，但对磺胺类四环素无降解效果(An effective in-situ method for laccaseimmobilization:Excellent activity,effective antibiotic removal rate and lowpotential ecological risk for degradation products.2020年；Degradation oftetracycline by immobilized laccase and the proposed transformationpathway.2017；Characterization of a robust cold-adapted and thermostablelaccase from Pycnoporus sp.SYBC-L10 with a strong ability for the degradationof tetracycline and oxytetracycline by laccase-mediated oxidation.2020年)；利用来源于Trametes versicolor的漆酶、来源于Myceliophthora thermophila和Pleurotuseryngii的共固定降解抗生素，对于磺胺类和四环素类的抗生素均有降解效果，但是降解效果有差异，并非对两类抗生素均有较好的降解作用(Removal of antibiotics inwastewater by enzymatic treatment with fungal laccase–Degradation ofcompounds does not always eliminate toxicity.2016年；Degradation oftetracyclines and sulfonamides by stevensite-and biochar-immobilized laccasesystems and impact on residual antibiotic activity.2018年)。

因此，在利用漆酶降解抗生素的领域，温度耐受性以及降解能力更强的漆酶还有待挖掘。

发明内容

本发明从National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中成功筛选到全新的漆酶表达基因。所述漆酶来源于Lysinibacillus fusiformis(GenBank:AYW03784.1)，能够在大肠杆菌E.coli中诱导表达，并表达出具有活性的重聚漆酶；该重组漆酶最适pH为4.0，最适温度80℃，并且在40℃下保温12h仍能保持70％以上的活性，并对包括磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、四环素和氧四环素在内的多种抗生素残留物具有广泛的降解能力，显示了其在环境工业治理中的巨大潜力。

本发明的第一个目的是提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的漆酶在降解抗生素残留物中的应用。

在一种实施方式中，所述抗生素残留物包括磺胺类抗生素和四环素类抗生素。

在一种实施方式中，所述磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺二甲嘧啶。

在一种实施方式中，所述四环素类抗生素包括四环素和土霉素。

本发明的第二个目的是提供一种降解抗生素残留的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的漆酶添加至含有磺胺类抗生素或四环素抗生素的体系中。

在一种实施方式中，以SA或ABTS为介体物质，在含有CuSO₄、以NaAc-HAc为缓冲液的体系中，利用所述漆酶降解抗生素。

优选地，在降解磺胺类抗生素的体系中添加SA为介体物质；在降解四环素类抗生素的体系中添加ABTS为介体物质。

优选地，介体物质的浓度不少于2mM。

更优选地，介体物质浓度为2mM。

在一种实施方式中，CuSO₄的浓度不少于0.5mM。

在一种实施方式中，利用NaAc-HAc为缓冲液将反应体系的pH维持在3.5～6.0，在40～90℃下反应。

优选地，反应体系的pH维持在4.0，在40℃下反应。

在一种实施方式中，反应时间不少于12h。

优选地，反应时间为12h。

本发明的第三个目的是提供含有所述漆酶的产品在降解抗生素中的应用，所述抗生素包括磺胺类抗生素和四环素类抗生素。

在一种实施方式中，所述产品包括但不限于催化剂、酶制剂、污水处理剂或土壤改良剂。

本发明的有益效果：

本发明筛选到一种来源于Lysinibacillus fusiformis的漆酶，相比现有的技术，本发明筛选的漆酶具有在更高温度下长时间稳定降解抗生素，良好的耐热性和优异的降解效率等能力。能够在短时间内降解大量抗生素，并且生产成本低，所用设备少，有助于工业上对兽药抗生素残留的控制。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施方案得到的由重组菌BL21(DE3)诱导表达漆酶(Lac)的SDS-PAGE电泳图其中，M：Marker；1泳道：纯化的重组漆酶Lyfu-Lac

图2是漆酶随pH(pH 2-8)变化的相对酶活变化

图3是漆酶随温度(30-90℃)的相对酶活变化。

图4是漆酶在温度(40，50，60，70，80℃)下连续保温12h的残余酶活变化。

图5是漆酶在介体物质SA和ABTS介导下降解磺胺嘧啶(SDZ)，磺胺二甲嘧啶(SMZ)和磺胺甲噁唑(SMX)12h后，抗生素的残留量。

图6是漆酶在介体物质ABTS介导下降解四环素(TC)和土霉素(OTC)6h后，抗生素的残留量。

图7是漆酶降解磺胺类和四环素类抗生素后降解产物的质谱图。

图8是漆酶降解磺胺类和四环素类抗生素后降解产物的质谱图。

具体实施方式

本发明的发明人在National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中筛选出一种源于纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)的蛋白(SEQID NO：1)(蛋白序列登录号为AYW03784.1)，合成蛋白并试验发现在配合介体物质的情况下，该蛋白具有优异的磺胺类和四环素类抗生素降解活性。

实施例1：蛋白重组表达和纯化

(1)筛酶：在NCBI库中筛选出来源于Lysinibacillus fusiformis的目的蛋白(GenBank:AYW03784.1)。

(2)质粒构建：合成编码步骤(1)的目的蛋白的基因片段(核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)，并在合成过程中将6个组氨酸标签添加到目的基因片段的C末端，以配合后续重组酶的Ni²⁺亲和层析分离纯化步骤。该基因片段还含有Nde I和Xho I酶切位点，用于实现重组质粒的构建。将该基因片段插入经Nde I和Xho I酶切过的大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中，直接获得重组质粒。

(3)工程菌构建：采用热激转化法，将合成的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到相应的重组工程菌。

(4)表达诱导：挑取单菌落接种于4mL LB培养基，于37℃、200r/min培养过夜；以2％接种量转接至200mL LB培养基中，并于37℃、200r/min培养大约2至2.5小时，培养基中氨苄青霉素(Amp)浓度为1％。培养至OD₆₀₀到0.6～0.8后，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mM，在18℃、200r/min下诱导表达24h。

(5)蛋白纯化：将诱导菌液6000rpm离心5min，取上清，通过0.45μm水系膜去除杂质，连接蛋白纯化系统中恒流泵、Ni²⁺亲和层析柱、紫外检测器等装置之间的管路，设置恒流泵的流速为1mL/min，用去离子水进行检漏。蛋白纯化系统准备就绪后，先用两个柱体积的结合缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，pH 7.0)平衡Ni²⁺亲和层析柱，再以0.5mL/min流速将粗蛋白液泵入层析柱。待粗蛋白液全部进入层析柱后，继续用结合缓冲液洗去未吸附的蛋白和其他杂质。待检测器读数稳定后，泵入洗涤缓冲液(40mM咪唑，50mM Tris、500mM NaCl，pH 7.0)洗去结合能力较弱的杂蛋白。待检测器读数再次稳定后，泵入洗脱缓冲液(500mM咪唑，50mM Tris，500mM NaCl，pH 7.0)将吸附的重组蛋白洗脱下来，并根据紫外检测器的信号值收集流出液，即为目标重组蛋白。将上述得到的目标重组蛋白溶液转移至截留分子量为10kDa的透析袋中，用透析夹夹紧后放入透析液1(10mM EDTA·2Na，50mM Tris，pH 7.0)中，置于4℃的层析柜，透析18h，每6h更换一次新鲜的透析液，以除去目标重组蛋白溶液中的咪唑以及其他金属离子。再将透析袋转移至透析液2(50mM Tris，pH 7.0)中，同样透析18h，每6h更换一次新鲜的透析液。透析结束后，收集目标重组蛋白液至管中，于4℃冰箱保存，备用。

对上述制备得到的纯化的目标重组蛋白进行分析，图1示出了经纯化的目标重组蛋白的电泳图。由图1可知，本实施例得到的目标重组蛋白的分子量的预测值约为59KDa，是一种胞内蛋白。

实施例2：漆酶的性能

(1)pH对漆酶活性的影响

本实施例采用分光光度法测量了根据本发明的重组酶在pH 2-pH 8的范围中的相对酶活(反应体系2mL，以终浓度10mM的ABTS为底物，添加终浓度0.1mM CuSO₄在40℃测定420nm处产物ABTS自由基的生成量)的变化曲线，其中，分别采用了浓度为50mM的甘氨酸-HCl、NaAc-HAc、NaH₂PO₄～Na₂HPO₄和作为pH缓冲液，结果如图2所示(以最高酶活为100％)。由图2可知，在pH为3～6的范围内，本发明的重组酶的相对酶活能够维持在40％以上，而以pH 4.0的相对酶活最高。同时，也可以得出NaAc-HAc是适用于本发明的优选pH缓冲液。

(2)温度对漆酶活性的影响

本实施例采用分光光度法测量了根据本发明的重组酶在30℃至90℃的温度范围中的相对酶活(反应体系2mL，以终浓度10mM的ABTS为底物，添加终浓度0.1mM CuSO₄在50mM的pH 4.0NaAc-HAc下测定420nm处产物ABTS自由基的生成量)随温度的变化曲线，结果如图3所示(以最高酶活为100％)。由图3可知，在70℃至90℃的温度范围中，重组酶的相对酶活达80％以上，重组漆酶在80℃温度下活力最高，展现出较好的温度耐受性如表1所示。

(3)漆酶的耐热性能测试

本实施例采用分光光度法测量了根据本发明的重组酶在40℃～80℃的温度范围中保温12h后的残余酶活(反应体系2mL，以终浓度10mM的ABTS为底物，添加终浓度0.1mMCuSO₄在50mM的pH 4.0NaAc-HAc和80℃下测定420nm处产物ABTS自由基的生成量)，结果如图4所示。本发明的漆酶能够在40℃下在12h内保持70％以上的活性，显示出优异的耐热性能，如表1。

表1

实施例3：漆酶在降解磺胺类和四环素类抗生素中的应用

(1)利用漆酶降解磺胺类和四环素类抗生素

本实施例采用高效液相色谱法，测量漆酶对两种抗生素的降解效率，色谱条件为：Hypersi1TM ODS C18柱(250×4.6mm,5μm)，流动相75％甲醇(检测磺胺类)和80％乙腈+0.02M磷酸二氢钠缓冲液(检测四环素类)，流速为0.6mL/min，柱温为40℃。

①在反应体系10mL中，以终浓度2mM的SA为介体物质，添加终浓度0.035mg/mL的重组漆酶，终浓度0.5mM的CuSO₄，在40℃和pH4.0(NaAc-HAc)的条件下降解终浓度为0.1g/L的磺胺类抗生素(磺胺嘧啶SDZ，磺胺甲噁唑SMX，磺胺二甲嘧啶SMZ)，反应时间为12小时。

②在反应体系10mL中，以终浓度2mM的ABTS为介体物质，添加终浓度0.035mg/mL的重组漆酶，终浓度0.5mM的CuSO₄，在40℃和pH4.0(NaAc-HAc)的条件下降解终浓度为0.1g/L的四环素类抗生素(四环素TC，土霉素OTC)，反应时间为12小时。

结果如图5，图6所示。重组漆酶在丁香酸介体物质参与下对磺胺类抗生素最大降解率分别为87.5％SDZ，92.2％SMZ，86.5％SMX；在ABTS介体物质参与下对四环素类抗生素最大降解率分别为100％TC和83.1％OTC，展现出较高的针对两类抗生素的降解性能，如表2所示。

表2

^a NR:无检测

^b SYR:syringaldehyde

(2)漆酶对两种抗生素降解后产物分析

将(1)中得到的降解混合溶液12000r/min离心5分钟后通过LC-MS检测产物组成，结果如图7，8(以磺胺二甲嘧啶和四环素为例)和表3所示。如图7，8和表3所示，本发明的重组漆酶制备降解磺胺类抗生素产物的质谱主要表现出在404(SMX产物)，429(SMZ产物)和401(SDZ产物)m/z，以及169m/z(丁香酸产物)，由此可以推断该重组漆酶降解磺胺类抗生素为加合反应。本发明的重组漆酶制备降解四环素类抗生素产物的质谱主要表现出在958(TC产物)，和974(OTC产物)m/z，以及514m/z(ABTS产物)，和最终的259m/z(3-ethyl-6-sulfonate benzothiazolone)，由此可以推断该重组漆酶降解四环素类抗生素为加合反应，并且最终加合产物发生N-N键断裂生成259m/z物质。

表3

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种高效降解兽药抗生素残留的漆酶及其应用

<130> BAA220655A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 513

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Leu Glu Lys Phe Val Asp Ala Leu Pro Ile Pro Asp Thr Leu

1 5 10 15

Lys Pro Val Gln Gln Ser Lys Glu Lys Thr Tyr Tyr Glu Val Thr Met

20 25 30

Glu Glu Cys Ala His Gln Leu His Arg Asp Leu Pro Pro Thr His Leu

35 40 45

Trp Gly Tyr Asn Gly Leu Phe Pro Gly Pro Thr Ile Glu Ala Lys Arg

50 55 60

Asn Glu Asn Val Tyr Val Lys Trp Met Asn Asn Leu Pro Ser Glu His

65 70 75 80

Phe Leu Pro Ile Asp His Thr Ile His His Ser Asp Ser Gln His Glu

85 90 95

Glu Pro Glu Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Val Thr Pro

100 105 110

Asp Asp Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Ser Lys Asp Phe Glu

115 120 125

Gln Thr Gly Pro Tyr Phe Lys Arg Glu Val Tyr His Tyr Pro Asn Gln

130 135 140

Gln Arg Gly Ala Ile Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Leu Thr

145 150 155 160

Arg Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Val Gly Ala Tyr Ile Ile His Asp

165 170 175

Pro Lys Glu Lys Arg Leu Lys Leu Pro Ser Gly Glu Tyr Asp Val Pro

180 185 190

Leu Leu Ile Thr Asp Arg Thr Ile Asn Glu Asp Gly Ser Leu Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Gly Pro Glu Asn Pro Ser Pro Ser Leu Pro Thr Pro Ser Ile

210 215 220

Val Pro Ala Phe Cys Gly Glu Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Val Trp

225 230 235 240

Pro Tyr Leu Glu Val Glu Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Val Ile Asn

245 250 255

Ala Ser Asn Thr Arg Thr Tyr Asn Leu Ser Leu Asp Asn Gly Gly Glu

260 265 270

Phe Ile Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Val Lys

275 280 285

Leu Asn Ser Phe Ser Leu Ala Pro Ala Glu Arg Tyr Asp Ile Ile Ile

290 295 300

Asp Phe Thr Ala Tyr Glu Gly Gln Ser Ile Ile Leu Ala Asn Ser Glu

305 310 315 320

Gly Cys Gly Gly Asp Val Asn Pro Glu Thr Asp Ala Asn Ile Met Gln

325 330 335

Phe Arg Val Thr Lys Pro Leu Ala Gln Lys Asp Glu Ser Arg Lys Pro

340 345 350

Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Pro Ser Val Gln Asn Glu Arg Ile His Asn

355 360 365

Ile Arg Thr Leu Lys Leu Ala Gly Thr Gln Asp Glu Tyr Gly Arg Pro

370 375 380

Val Leu Leu Leu Asn Asn Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Glu Ala

385 390 395 400

Pro Lys Ala Gly Thr Thr Glu Ile Trp Ser Ile Val Asn Pro Thr Arg

405 410 415

Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Ser Phe Arg Val Leu Asp

420 425 430

Arg Arg Pro Phe Asp Ile Ala Arg Tyr Gln Glu Arg Gly Glu Leu Ser

435 440 445

Tyr Thr Gly Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys Gly Trp Lys

450 455 460

Asp Thr Ile Gln Ala His Ala Gly Glu Val Leu Arg Ile Ala Ala Thr

465 470 475 480

Phe Gly Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu

485 490 495

His Glu Asp Tyr Asp Met Met Arg Pro Met Asp Ile Thr Asp Pro His

500 505 510

Lys

<210> 2

<211> 1542

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacacttg aaaaatttgt ggatgctctc ccaatcccag atacactaaa gccagtgcag 60

caatcaaaag aaaaaacata ctatgaagtc accatggagg aatgcgccca tcagcttcac 120

cgcgatctcc ccccgaccca cctgtggggc tacaacggcc tatttcccgg gcctaccatt 180

gaggccaaaa gaaacgaaaa cgtgtatgtg aaatggatga acaaccttcc gtcagagcat 240

ttccttccga tcgatcacac gattcaccac agtgacagcc agcatgaaga gccagaagta 300

aagactgttg ttcatttaca cggaggcgtc acgccagatg atagtgatgg gtatccagag 360

gcctggtttt ccaaagactt tgaacaaaca ggcccttact ttaaacgaga ggtttatcat 420

tatccgaatc agcagcgcgg tgctattttg tggtatcacg atcacgccat ggcgctcacc 480

aggctgaatg tctatgccgg acttgttggc gcttatatta ttcacgatcc aaaggaaaaa 540

cgcttaaagc tgccttccgg tgaatacgac gtgccgcttc tgatcacaga ccgcacgatc 600

aacgaggacg gttctttgtt ttatccaagc gggccggaaa acccttcccc gtcactgcct 660

accccttcaa tcgttccggc tttttgcgga gaaaccatac tcgtcaacgg gaaggtatgg 720

ccatacttgg aggtcgaacc taggaaatac cgctttcgcg tcatcaacgc ctccaatacg 780

agaacctata acctgtcact cgataatggc ggggagttta ttcagattgg ttcagacgga 840

gggctcctgc cgcgctctgt aaaactgaac tctttcagtc ttgcgcccgc tgaacgttac 900

gatatcatca ttgatttcac agcctatgaa ggacaatcaa tcattttggc aaacagcgag 960

ggctgcggag gtgacgttaa tccagaaaca gatgcgaata tcatgcaatt cagagtcaca 1020

aaaccgttgg cacaaaaaga cgaaagcaga aagccaaagt acctcgcctc atacccttcc 1080

gtgcagaatg aaagaataca caacatcaga acactgaaac tggcaggcac ccaagacgaa 1140

tacggcagac ccgtccttct tctcaataac aaacgctggc acgatcctgt cacagaagca 1200

ccaaaagccg gcacaactga aatatggtcc atcgtcaatc cgacacgcgg aacacatccg 1260

atccacctgc atttggtctc cttccgtgtg ttagaccggc gtccgtttga tatcgcgcgt 1320

tatcaagaaa gaggggaatt gtcctacacc ggcccggctg tcccgccgcc gccaagtgaa 1380

aagggctgga aagacaccat tcaagcacat gcaggtgaag tcctgagaat cgcggcgaca 1440

ttcgggccat acagcggacg atacgtatgg cactgccata ttcttgagca tgaagactat 1500

gacatgatga gaccgatgga tataactgat ccccataaat aa 1542

Claims

1.一种降解抗生素的方法，其特征在于，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的漆酶添加至含有磺胺类抗生素或四环素类抗生素的体系中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以丁香酸或ABTS为介体物质，在含有CuSO₄、以NaAc-HAc为缓冲液的体系中，利用所述漆酶降解抗生素。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用NaAc-HAc为缓冲液将反应体系的pH维持在3.5～6.0，在40～90℃下反应。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应时间不少于12h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺二甲嘧啶。

6.根据权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述四环素类抗生素包括四环素和土霉素。

7.含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的漆酶的产品在降解磺胺类抗生素或四环素类抗生素中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品包括催化剂、酶制剂、污水处理剂或土壤改良剂。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，将含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的漆酶的产品添加至含有磺胺类抗生素或四环素类抗生素的体系中以实现对抗生素的降解。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺二甲嘧啶；所述四环素类抗生素包括四环素和土霉素。