CN102016003B - 微生物复合体 - Google Patents
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Abstract
不对微生物使用基因工程的方法而以简便的方法使活微生物到达肠道。为此，形成由乳酸菌等微生物、多糖类和融合肽构成的复合体(凝集体)，其中，该融合肽是连接具有与上述微生物表面结合的能力的肽和具有与上述多糖类结合的能力的肽而得到的融合肽，例如肽聚糖水解酶的肽聚糖结合结构域和淀粉酶的淀粉结合结构域的融合蛋白质。另外，优选以直链淀粉或淀粉包覆该复合体。
Description
技术领域
本发明涉及微生物复合体，具体而言，涉及由微生物和多糖类以及能够与上述微生物和上述多糖类结合的肽构成的复合体，更详细而言，涉及由微生物和多糖类以及连接具有与上述微生物表面结合的能力的肽和具有与上述多糖类结合的能力的肽得到的融合肽构成的复合体。
背景技术
近年来，关于益生菌的研究正在积极地开展。所谓益生菌，一般被定义为通过改善肠内细菌构成(肠内菌群)的平衡给宿主带来有益作用的活微生物。作为益生菌所具有的功能，报告有免疫活化作用、防止便秘-腹泻、降低血中胆固醇的作用、降血压作用等。因而，希望摄取益生菌来防止病原微生物的侵入，预防生活习惯病。现在，作为被实用的代表性的益生菌，可以列举乳酸菌。作为用作益生菌的微生物所要求的条件，可以例举是宿主的肠内菌群的一员、廉价且容易处理、耐受胃液和胆汁酸等而能够以存活状态通过上消化道(GIT)到达肠内、能够在作为增殖部位的下消化道(小肠下部、大肠)增殖、能够以食品等的形态维持有效的菌数等。
在日本特表2002-511403号公报中，公开了乳酸菌等微生物能够以存活状态到达下消化道的淀粉胶囊。该淀粉胶囊是以微生物充填由α-淀粉酶等酶进行水解而使内部成为多孔质结构的淀粉颗粒，再将该淀粉颗粒以直链淀粉包覆而得到的。这样的淀粉胶囊能够在室温下长时间保存，并且能够以保持活性的状态到达肠道。
专利文献1：日本特表2002-511403号公报
发明内容
但是，在上述淀粉胶囊中，如果微生物不附着在淀粉上，则难以将微生物摄入成为多孔质的淀粉粒子中，被摄入淀粉的多孔质结构的微生物也有漏出的可能性。具认为，微生物在低pH和胆汁酸下的生存依赖于与淀粉的结合，但并不是所有微生物都具有理想的与淀粉结合的能力。另外，为了赋予与淀粉的结合能力，也考虑对微生物使用基因工程的方法，但从消费者的关心出发，不是优选的方法。
本发明就是鉴于上述背景技术而做出的发明，其目的在于提供一种不对微生物使用基因工程的方法而能够以简便的方法使活菌到达肠道的复合体，本发明的微生物复合体由微生物、多糖类和能够与上述微生物和上述多糖类结合的肽，例如由微生物、多糖类和能够与上述微生物的肽聚糖和上述淀粉两者结合的肽构成。
发明的效果
根据本发明，能够赋予微生物对胃酸和胆汁酸的耐性，使微生物以保持存活的状态到达肠道。另外，能够不因微生物的种类而异地形成复合体。并且，能够由混合肽、微生物和多糖类这种极其简单的方法获得。
附图说明
图1是表示载体pQCPH的构建的图。
图2是表示载体pQCA的构建的图。
图3是表示载体pQCLS的构建的图。
图4是融合蛋白质的表达盒的结构图。
图5是分析纯化的融合蛋白质以及淀粉与融合蛋白质的结合的SDS-PAGE的结果。泳道1是由镍螯合物柱纯化的融合蛋白质，泳道2是使之与淀粉反应后的上清液，泳道3是作为其对照而除去淀粉的情况，泳道4是由离子交换树脂进一步纯化的融合蛋白质，泳道M是分子量标准(Marker)。
图6是表示Lactobacillus casei细胞与融合蛋白质结合的SDS-PAGE的结果。泳道M是分子量标准(是和图5相同的标准)，泳道1是融合蛋白质和孵育的细胞，泳道2是没有添加融合蛋白质的细胞。
图7是表示结合有融合蛋白质的Lb.casei细胞与淀粉形成凝集体的照片。
图8是表示处于人工胃的状态下的Lb.casei细胞的生存率随时间变化的图。△和▲分别表示pH3.0下的细胞单独的情况和以直链淀粉包覆的复合体的情况，□和■分别表示pH2.0下的细胞单独的情况和以直链淀粉包覆的复合体的情况。
具体实施方式
本发明的微生物复合体由微生物、多糖类和能够与上述微生物和上述多糖类结合的肽构成。
在本发明中所使用的多糖类，意指将1种或多种单糖作为构成单元的有机化合物。其种类没有特别限定，例如，除淀粉以外，可例示糖原、果胶、直链淀粉、纤维素、甘露聚糖、壳多糖等。在使用的多糖类中，希望在肠道中存在其分解酶，以使微生物到达肠内时，将微生物从复合体中释放。具体而言，可例示被小肠的淀粉酶分解的淀粉、糖原、果胶、直链淀粉。如果使用这些多糖类，则复合体在通过上消化道之后被消化，微生物从复合体中释放。另外，如果考虑获得的容易性，则希望使用淀粉。
淀粉的种类没有特别限定，不仅可以是来自天然物的淀粉，而且也可以是将天然淀粉进行化学处理、化学修饰而得到的化学修饰多糖类淀粉中的任意一种。由于本发明的复合体是作为食品或医药的形式被摄取的，所以优选使用天然淀粉。
作为天然淀粉，可以例示玉米淀粉、马铃薯淀粉、甘薯淀粉、小麦淀粉、米淀粉、木薯淀粉、高粱淀粉等从各种植物中得到的淀粉，来源植物不受限定。另外，在淀粉中所包含的直链淀粉、支链淀粉含量也不特别限定，可以使用如高直链淀粉玉米淀粉那样的提高了直链淀粉含量的淀粉。另外，对于糖原、果胶、直链淀粉而言，其来源也不受限定，只要是糖原，则也可以使用来自牡蛎的糖原。另外，在本发明中，不仅可以使用单一的多糖类，也可以使用两种以上的多糖类。
作为淀粉，优选使用颗粒状淀粉。颗粒状淀粉可以通过在水中悬浊上述各种淀粉、从悬浊液中沉降分离而得到。其粒径没有特别限制， 但优选使用被整粒过的淀粉。其粒径大致为0.1～100μm左右。希望更优选使用粒径为0.5～5μm左右的淀粉粒。具认为，如果相比于微生物菌体相对过小，则微生物就不能在淀粉周围结合；而如果粒径相比于微生物菌体相对过大，则通过肽结合有微生物的复合体之间的凝集变得困难，死亡的菌体增多，这两种情况均增大了不能提供具有充足耐性的复合体的可能性。
在本发明中所使用的微生物也没有特别限制，但可以例示作为益生菌优选的乳酸菌和双歧杆菌。作为该乳酸菌，可以例示属于乳酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、链球菌属的菌，更具体而言，可以例示Lactobacillus casei(干酪乳杆菌)等。但是，不仅是能够作为益生菌利用的微生物，不限于仅在低pH环境下保存，如果有在其它存活的状态下保存的必要性，则也可以将这些微生物作为对象。除乳酸菌以外，例如，可以例示芽孢杆菌属的微生物、酵母等。
在本发明中，因为通过肽使多糖类和微生物结合，所以与该肽的结合性很重要。即，本发明涉及的融合肽发挥着多糖类和微生物的结合剂的作用。具体而言，该肽是使具有与微生物结合的能力的肽(微生物附着肽)和能够与多糖类结合的肽(多糖类结合肽)融合而得到的肽。在本发明中，所谓微生物附着肽，意指能够识别存在于微生物细胞表面、或其一部分露出而存在于微生物细胞表面的细胞膜的构成成分，例如膜蛋白质、定位于细胞壁的蛋白质、构成细胞壁的肽聚糖或甘露聚糖等，并能够与其结合的肽，只要是能够在作为对象的微生物表面结合的肽，则任何微生物附着肽均可。例如，可以列举定位于乳酸菌的细胞壁的肽聚糖水解酶(例如，参照“Cell Wall Attachment ofa Widely Distributed Peptidoglycan Bindging Domain Is Hindered by CellWall Constituents”，A.Steen et al.，Journal of Biological Chemistry，Vol.278，No.26，23874-23881(2003))和S-layer protein(SlpA)(参照“Surface Display of the Receptor-Binding Region of the Lactobacillusbrevis S-Layer Protein in Lactococccus lactis Provides NonadhesiveLactococci with the Ability To Adhere to intestinal Epithelial Cells”，siljaAvall-Jaaslelainen et al.，Applied and Enviromental Microbiology，Vol.69， No.4，2230-2236(2003))。另外，在融合肽中，并不需要整个的微生物附着肽，至少具有能够在微生物的细胞表面附着的本质性部位，即，具有该肽参与与表面附着的结构域即可。作为该结构域，例如，可以例示与构成乳酸菌细胞膜的肽聚糖附着的肽聚糖水解酶的C-末端重复区域(例如同前)和SlpA的N末端区域。另外，在本发明中，所谓肽，不是仅指数个氨基酸由肽键结合而成的狭义的肽，也不仅是从十几个到几十个氨基酸结合而成的低聚肽，而是以包含几百左右的氨基酸结合而成的蛋白质水平的广泛概念使用。即，本发明的肽可以是能够发挥上述功能的氨基酸以肽键结合而成的物质。
另一方面，在本发明中，需要通过与多糖类结合来保护微生物，所以在融合肽中，需要能够与多糖类结合的肽。在该融合肽中，与微生物附着肽同样，不需要整个的能够与多糖类结合的肽，至少具有能够识别多糖类的结构域即可。作为这样的能够与多糖类结合的肽，例如，可以例示与纤维素结合的纤维素结合结构域(纤维素酶类等)、与淀粉结合的淀粉酶类的淀粉结合结构域。
这些微生物附着肽和多糖类结合肽可以任意组合，根据形成复合体的微生物和多糖类的种类等而考虑各种组合。融合肽可以由一般的基因工程方法得到。即，可以在表达载体中重组入微生物附着肽、优选其表面附着结构域、和具有与多糖类结合的能力的肽、优选编码该多糖类结合结构域的氨基酸序列的碱基序列，使其在大肠杆菌等适当的宿主中表达而得到。另外，融合肽也可以不使用基因工程方法，而是选择同时具有上述的微生物附着能力和多糖类结合能力的天然蛋白质，使用其全部或其一部分。
本发明的复合体能够仅仅混合所得到的融合肽、多糖类和微生物就简单地得到。多糖类、融合肽和微生物的浓度根据多糖类的粒径、微生物的种类、在作为目的的复合体中包含的菌数等适当调整。如果举其一例，则相对于1×109cfu/ml的菌体，混合0.1～100mg/ml、优选2～7mg/ml的淀粉和0.01～10mg/ml的融合肽。
对于复合体的制作而言，可以将融合肽、多糖类和微生物以溶液或分散液状同时混合，但优选首先使融合肽结合在微生物(菌体表面)上之后再使多糖类结合，然后调整结合有融合肽的微生物与多糖类的混合比例，由此形成凝集体。由此，期待微生物和多糖类相互集合，形成纳入有活菌的凝集体。融合肽和微生物的混合及此后的与淀粉溶液的混合，只要是微生物能够生存的温度，则任意温度均可，但希望在结合力高的4℃左右的低温下进行。
所得到的复合体凝集体除了可以直接作为食品或医药品摄取以外，还可以使用适当的赋形剂加工为片剂或颗粒剂等任意的剂型，或作为乳酪、酸乳酪、清凉饮料水等食品原料使用。
另外，所得到的凝集体有时也由淀粉、直链淀粉、果胶、纤维素、甘露聚糖、直链淀粉、蛋白质等可以包覆凝集体(凝集颗粒)的适当的一种或两种以上的包覆成分适当包覆。其中，作为包覆成分，优选淀粉和α-直链淀粉。淀粉和α-直链淀粉在胃液中难以被消化，而在肠道中容易被酶处理，所以，微生物从凝集体中的释放可以迅速进行。对于包覆而言，例如，通过将上述成分的水溶液或由乙醇等有机溶剂形成的溶液向所得到的凝集体喷雾而进行。包覆成分的溶液浓度可适当调整，但优选为0.1～5％左右。其结果，进一步赋予了对胃液和胆汁酸的耐性。另外，在水中悬浊淀粉或直链淀粉并以高温处理，制备以高浓度溶解的溶液，向其中加入凝集体并保持在低温，也能够使大于溶解度的淀粉或直链淀粉沉淀在凝集体表面。
所得到的复合体即使在pH2～3的低pH环境下也可生存，被赋予了耐酸性。因此，通过将这些复合体作为食品或医药品的形态摄取，可以期待微生物以活菌状态到达下消化道。
实施例1
[融合蛋白质的制备]
作为表达融合蛋白质的宿主，使用大肠杆菌Escherichia coliXL1-Blue，以LB(Luria-Bertani)培养基或LB琼脂培养基在37℃下培养该大肠杆菌。
(载体的构建)
为了表达能够与微生物表面和淀粉结合的融合肽(融合蛋白质)，在具有T5启动子的载体pQE31(Qiagen公司)中插入Lactococcus lactisIL 1403株(Agricultural Research Service Culture Collection，NRRL)的编码肽聚糖水解酶(EMBL：AE006264)的肽聚糖结合结构域(CPH) 的基因、和Streptococcus bovis 148株的α-淀粉酶的接头序列以及编码淀粉结合结构域的基因。
用于融合蛋白质表达的载体通过以下的3个阶段构建。首先，构建将来自Lc.lactis IL1403的染色体DNA的CPH基因重组入pQE31中而得到的pQCPH(参照图1)。接着，构建在其中重组入Streptococcusbovis 148株的α-淀粉酶(EMBL：AB000830)的接头序列和编码淀粉结合结构域的基因而得到pQCA(参照图2)。然后，构建重组入来自pQCA的用于表达作为最终目的的融合蛋白质的基因盒(图4)的表达载体pQCLS(参照图3)。
1.pQCPH的构建
以基因组情报被公开的Lc.lactis IL1403株的染色体DNA作为模板，以5’-tgcgcgccatgggtacttctaattccggtggttcaacagc的碱基序列所示的cph-F(正向：序列号1)和5’-gcggatccttatttaatacgaagatattgacc的碱基序列所示的cph-R(反向：序列号2)作为引物进行PCR，制备编码CPH的DNA片段。将由NcoI和BamHI消化得到的该片段克隆入以相同的 NcoI和BamHI消化后的pQE31(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)中，构建pQCPH。
2.pQCA的构建
以5’-tctctcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcg的碱基序列所示的pch-NF(正向：序列号3)和5’-aaggatcccctttaatacgaagatattgaccaattaaaatgg的碱基序列所示的cph-NR(反向：序列号4)作为引物进行PCR，由此扩增从pQCPH的T5启动子中的XhoI位点到CPH基因的3’末端，以XhoI和BamHI进行消化。以XhoI和BamHI消化将Streptococcusbovis 148株的α-淀粉酶克隆入pQE31中得到的pQEAmy31(东京农业大学佐藤英一博士提供，参照Direct Production of Ethanol from RawCorn Starch via Fermentation by Use of a Novel Surface-engineered YeastStrain Codisplaying Glucoamylase and α-Amylase，Hasayori Shigechi，Eiichi Satoh et al.，Applied and Environmental Microbiology，Vol.70，No.8，5037-5040(2004))，与由PCR得到的片段连接。其中，3’末端侧的引物除去了CPH基因的终止密码子，通过BamHI位点与α-淀粉酶基因连接时，引物的制作符合该要求。
3.pQCLS的构建
以pQE31Amy为模板，使用5’-aaggatccgggccaagctagccaagcagctc的碱基序列所示的引物Link-F(正向：序列号5)和5’-gcgccaattatctgggttttgg的碱基序列所示的引物Link-R(反向：序列号6)，由PCR制备编码α-淀粉酶的酶结构域和淀粉结合结构域(以下记作SBD)之间的接头序列部分的基因。以BamHI和BstXI消化pQCA，除去编码CD区域和接头序列部分的基因，取而代之，插入以pQE31Amy为模板由PCR制备的编码接头序列部分的片段，构建pQCLS。序列号7表示用于表达融合蛋白质的基因盒的碱基序列。
被导入了pQCLS的大肠杆菌，在加入了100μg/ml的氨苄青霉素和15μg/ml的四环素的LB培养基中在37℃下培养过夜，通过离心分离收集细菌。接着，将菌体移入含有抗生素的新鲜的上述LB培养基中，在37℃下培养，直至660nm的浊度(OD660)达到0.5。此后，在上述培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使其为1mM，诱导融合蛋白质的表达。为了维持质粒，在培养基中添加最终浓度400μg/ml的氨苄青霉素。培养4小时以上后收集细菌。
[融合蛋白质的纯化]
通过利用了融合蛋白质的N末端的组氨酸标签与镍螯合物柱(Ni-NTA superflow column(1.5ml)，Qiagen公司)的相互作用的金属亲和层析，纯化融合蛋白质。将从100ml上述培养基中收集的大肠杆菌菌体在结合用缓冲液(50mM NaH2PO4(pH8)，300mM NaCl，10mM咪唑)中悬浊，添加溶菌酶使最终浓度为1mg/ml，在冰上孵育1小时。
以超声波破碎细胞，将离心分离得到的上清液加入由上述结合用缓冲液平衡的Ni-NTA柱中。以结合用缓冲液(50mM NaH2PO4(pH8)，300mM NaCl，20mM咪唑)将柱洗净后，以洗脱用缓冲液(250mMNaH2PO4(pH8)，300mM NaCl，20mM咪唑)洗脱吸附的蛋白质。洗脱液通过超滤在20Mm Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中置换，加入以20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡的阴离子交换树脂Super Q 5PW中，利用0～1M NaCl的直线浓度梯度将其洗脱。收集含有融合蛋白质的组分，通过超滤浓缩、脱盐。纯化的融合蛋白质进行12％SDS-PAGE，以Coomasie Brilliant Blue R250染色确认纯度。
(与细胞表面附着的试验)
为了确认所得到的融合蛋白质与细胞的附着(结合)，进行以下试验。在MRS培养基(Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)中在37℃下培养Lactobacillus casei NRRL B-441，直至OD660达到1。通过离心分离细胞收集细菌，在含有0.12mg/ml上述融合蛋白质的MRS培养基中悬浊，在37℃下平稳摇动2小时，直至OD660达到1.5。将细胞在0.1M的磷酸钠缓冲液(pH7.0)(PB)中洗净后，分散在SDS-PAGE用缓冲液(20％(w/v)甘油，125mM Tris-HCl(pH6.8)，4％SDS，5％(v/v)β-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)中，煮沸5分钟。与细胞结合的融合蛋白质采用和上述同样的方法由SDS-PAGE法检出。
(和淀粉结合的试验)
另外，为了确认所得到的融合蛋白质与淀粉的结合，进行如下实验。混合200μl由Ni-NTA柱纯化的融合蛋白质溶液(0.06mg/ml in PB)和等量的淀粉颗粒悬浊液(10mg/ml in PB)，以37℃平稳摇动3小时。离心分离后，由SDS-PAGE检出上清液中未结合的融合蛋白质。
[复合体的形成和微胶囊化]
接着，形成乳酸菌、融合蛋白质和淀粉的复合体。复合体如下形成：首先，在和上述附着试验相同的条件下使乳酸菌与融合蛋白质附着，此后，与淀粉悬浊液混合，使之与淀粉结合。即，在MRS培养基中培养乳酸菌，直至OD660达到1，离心分离1.5ml该乳酸菌培养液，将得到的菌体在含有0.12mg/ml的融合蛋白质的MRS培养基中悬浊，在30℃下孵育2小时。离心分离后，加入PB悬浊，重复2次该操作进行洗净，除去未结合的融合蛋白质。然后在PB中悬浊，使细胞浓度为1×109cells/ml(OD600＝1)。
混合等量的上述细胞悬浊液和在PB中分散的淀粉颗粒悬浊液，在室温下平稳地搅拌30分钟后放置1小时。作为对照，也在不添加淀粉的情况下和不添加上述细胞悬浊液的情况下进行实验。复合体的形成通过肉眼和由相差显微镜观察来确认。另外，细胞与淀粉的结合率由Crittenden等的方法(参照Crittenden，R.，et al.，Adhesion of bifidobacteriato granular starch and its implications in probiotic technologies.Appliedand Environmental Microbiology，Vol.67，No.8，3469-3475(2001))测定。
由直链淀粉将复合体包覆(微胶囊化)使用1％的来自马铃薯的直链淀粉溶液(直链淀粉由Sigma公司生产)进行。即，在耐压容器中加入10mg/ml的直链淀粉悬浊液，以180℃加热1小时，放冷到室温，由此溶解直链淀粉，将0.5ml的该溶液与复合体慢慢地混合，在4℃下使之凝胶化过夜，由此而进行。
[人工胃液中的细胞生存率的测定]
在0.5％的生理食盐水中溶解胃蛋白酶，使其为3mg/ml，以12MHC1将pH调整为2.0或3.0，制备人工胃液。人工胃液过滤后灭菌。在1ml的人工胃液中混合微生物复合体(5×107cells)，在37℃下孵育。以一定的时间间隔通过离心分离除去人工胃液，以PB洗净复合体，再以生理食盐水洗净2次。然后，在含有30units/ml的α-淀粉酶(Megazyme，Bray，Ireland)的PB中悬浊复合体，在40℃下孵育20分钟，使细胞从复合体中释放。在MRS琼脂培养基上以37℃培养24小时，计测活菌数。
[结果和考察]
(融合蛋白质的表达及其纯化)
从1L大肠杆菌培养液中可以得到约0.3g融合蛋白质，其75％存在于可溶性组分中。由SDS-PAGE测得的分子大小是56kDa，和理论值一致。另外，在由亲和层析纯化的试样中，除56kDa以外，也包含71kDa和73kDa的蛋白质(图5，泳道1)。另外，序列号8表示融合蛋白质的氨基酸序列。
在与来源于玉米的淀粉的结合实验中，除了目的融合蛋白质以外，这2种蛋白质也在某种程度上与淀粉结合(图5，泳道2)。为了只得到目的融合蛋白质，如上述那样使用阴离子色谱法(图5，泳道4)。由阴离子色谱法纯化得到的融合蛋白质与淀粉结合(图5，泳道2)，所以可知是具有与淀粉结合的能力的活性体。另外，虽然未图示，但确认纯化的融合蛋白质不仅与玉米淀粉结合，而且也与马铃薯淀粉结合。
(融合蛋白质与细胞的附着)
将Lb.casei NRRL B-441株的细胞与纯化的融合蛋白质孵育，由SDS-PAGE确认在其上清液中残存的融合蛋白质(图6)。确认融合蛋 白质在细胞上附着，如果采用Crittenden等的方法，则在各细胞上附着6×104分子的融合蛋白质。
(复合体的形成)
相对于一定量的附着有融合蛋白质的细胞，改变淀粉浓度，研究与淀粉的结合。在表1中表示目测凝集体的大小进行对照和比较的结果。使用未结合融合蛋白质的细胞时的凝集程度，和只使用淀粉的对照为同等程度。与此相对，当使用在细胞上附着有融合蛋白质的细胞时，淀粉浓度为2mg/ml时的凝集程度强于对照，在为5mg/ml时明显强于对照。此时的细胞与淀粉结合率，不添加融合蛋白质时为4.4％，与此相对，添加时为32％。在图7中表示添加融合蛋白质时的乳酸菌和淀粉的凝集物的显微镜照片。
[表1]淀粉浓度对由融合蛋白质产生的乳酸菌和淀粉的凝集程度的影响
| 淀粉浓度 | 混合结合有融合蛋白质的 乳酸菌和淀粉时 | 不加融合蛋白质时 | 仅为淀粉 |
| 1 | + | + | + |
| 2 | ++ | + | + |
| 5 | +++ | + | + |
| 10 | + | + | + |
(人工胃液中的细胞生存率)
在表2和图8中表示以人工胃液处理复合体时的生存率，该复合体是由融合蛋白质使Lb.casei NRRL B-441株的细胞与淀粉结合，再以直链淀粉包覆而得到的。以pH2.0和3.0处理游离细胞1小时后的存活率分别为0.002％和0.74％，与此相对，通过融合蛋白质与淀粉结合并以直链淀粉包覆时，以pH2.0和3.0处理1小时后的存活率分别上升至6％和64％。另外，如表2中所示，在不以直链淀粉进行包覆时，以pH3.0的人工胃液处理1小时后的生存率为11％。
[表2]在pH3.0的人工胃液中处理1小时后的存活率
| 乳酸菌 | 融合蛋白质 | 淀粉 | 直链淀粉 | 存活率(％) |
| + | + | + | + | 64 |
| + | - | + | + | 37 |
| + | + | - | + | 7 |
| + | + | + | - | 11 |
| + | - | - | - | 0.074 |
如上所述，可以确认如果使用融合蛋白质形成乳酸菌与淀粉的复合体(凝集体)，则显著提高在人工胃液中的生存率。另外，虽然在表2中，不添加融合蛋白质时生存率也上升，但可以认为，如已经由Wanget al.等所报告的那样，这是在低pH环境下存在淀粉以及与淀粉颗粒混合存在所导致的。另外，虽然不使用融合蛋白质而以直链淀粉包覆与淀粉的复合体时生存率也上升，但是可以认为这是由于Lb.casei NRRLB-441株本身在某种程度上具有与淀粉和直链淀粉结合的能力。
产业上的可利用性
如果根据本发明，就能够提高在低pH环境下的微生物的生存率。因此，能够将菌体通过处于低pH环境下的上消化道而以存活的状态送到下消化道，利用本发明可以扩大乳酸菌等益生菌的应用范围。
Claims (10)
1.一种微生物复合体，其特征在于：
由存活状态的微生物、多糖类和能够与所述微生物和所述多糖类结合的肽构成，用于使微生物以保持存活的状态到达肠道，
所述微生物是益生菌，
所述多糖类是淀粉、糖原中的任意1种或2种以上，
所述具有与微生物结合的能力的肽是肽聚糖水解酶的肽聚糖结合结构域，
所述具有与多糖类结合的能力的肽是淀粉酶的淀粉结合结构域。
2.如权利要求1所述的微生物复合体，其特征在于：
所述多糖类是直链淀粉、支链淀粉中的任意1种或2种以上。
3.如权利要求1或2所述的微生物复合体，其特征在于：
所述能够与微生物和多糖类结合的肽是连接肽聚糖水解酶的肽聚糖结合结构域和淀粉酶的淀粉结合结构域而得到的融合肽。
4.如权利要求1或2所述的微生物复合体，其特征在于：
所述微生物是乳酸菌。
5.如权利要求3所述的微生物复合体，其特征在于：
所述微生物是乳酸菌。
6.如权利要求1或2所述的微生物复合体，其特征在于：
所述复合体具有包含多糖类和／或蛋白质的包覆层。
7.如权利要求3所述的微生物复合体，其特征在于：
所述复合体具有包含多糖类和／或蛋白质的包覆层。
8.连接具有与微生物表面结合的能力的肽和具有与多糖类结合的能力的肽而得到的融合肽的应用，
所述应用是在能够使微生物以保持存活的状态到达肠道的微生物复合体中的应用，
所述微生物是益生菌，
所述多糖类是淀粉、糖原中的任意1种或2种以上，
所述具有与微生物表面结合的能力的肽是肽聚糖水解酶的肽聚糖结合结构域，
所述具有与多糖类结合的能力的肽是淀粉酶的淀粉结合结构域。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述多糖类是直链淀粉、支链淀粉中的任意1种或2种以上。
10.权利要求1～7中任一项所述的微生物复合体在用于使所述微生物以保持存活的状态到达肠道的食品或医药品的制造中的应用。
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