CN117625434A - 益生菌pta22、制备兔子食物的营养组合物及降解草酸的组合物 - Google Patents

益生菌pta22、制备兔子食物的营养组合物及降解草酸的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种来自兔子的PTA22益生菌、一种用于制备兔食物的营养组合物和一种用于使兔子降解草酸的组合物。通过本发明，使兔子食用含有PTA22的食物后，可以保证兔子的健康，提高兔子对致病菌的抵抗力。此外，益生菌PTA22还可以帮助兔子降低高钙尿症的结石风险。

Description

益生菌PTA22、制备兔子食物的营养组合物及降解草酸的组 合物
技术领域
本发明关于一种益生菌，尤其涉及一种来自兔子的益生菌及含有该益生菌的兔用食品。
背景技术
兔子是后肠(盲肠)发酵的草食性动物，盲肠含有大量微生物和益生菌，有助于分解植物厚厚的细胞壁，并且，未完全消化的食糜会在盲肠中被发酵并转化为可以被吸收的营养物质。一般而言，粗纤维含量低的食物中，碳水化合物含量较高，不仅容易发酵而引起兔子的腹胀气，还会促进某些细菌的异常生长，如大肠杆菌(Escherichia coli，缩写为E.coli)和梭状芽孢杆菌属等。另外，细菌生长异常可能导致腹泻、肠毒血症、肠梗阻、慢性间歇性腹泻等肠道症状。
因此，为了使兔子能够更好地消化各种食物，并保证兔子胃肠道的健康，本发明提供了一种含有益生菌的兔用食品，以使兔子进食时，便可以摄取适当的益生菌，以预防肠胃紊乱等疾病。
发明内容
有鉴于前述的先前技术，本发明提供从兔子粪便中分离的新颖的益生菌，并且，所述新颖的益生菌在兔子胃肠道中的存活机会更高，而其中一种的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus Plantarum)的新颖的益生菌(以下称为益生菌PTA22)的酸耐受性、胃肠道定殖等能力更为显著。益生菌PTA22的16S rRNA基因序列为SEQ ID No：3，且益生菌PTA22寄存于在NITE(National Institute of Technology and Evaluation)专利微生物寄存中心(NITE Patent Microorganisms Depositary，缩写为NPMD)，寄存号为BP-03477。其中益生菌PTA22具有草酸降解活性。另外，益生菌PTA22具有草酸降解活性、羧甲基纤维素的消化活性、果胶酶的消化活性、木聚醣酶的消化活性和蛋白酶的消化活性，其中益生菌PTA22可以抑制包含至少一种致病菌的生长，且所述至少一种致病菌为蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)、肠沙门氏菌(Salmonella Enterica)、松内志贺氏菌(ShigellaSonnei)、肺炎链球菌(Streptococcus Pneumoniae)、铜绿假单胞菌(PseudomonasAeruginosa)和产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，E.coli(ETEC))。益生菌PTA22对包含氨基糖苷类抗生素(Aminoglycosides antibiotics)、磺胺类抗生素(Sulfonamide antibiotics)、喹诺酮类抗生素(Quinolone antibiotics)及其衍生物中的至少一种的抗生素具有抗性。
基于本发明的其中一个目的，本发明的一个实施例提供一种用于制备兔子食物的营养组合物，且所述制备兔子食物的营养组合物包括益生菌混合物、具高生物价值蛋白质的生物材料、寡糖和赋形剂，其中所述益生菌混合物包括益生菌PTA22、益生菌PTA22后生元或其组合。
基于本发明的另一个目的，本发明的一个实施例还提供一种用于降解兔子饮食中草酸的组合物，且所述用于降解兔子饮食中草酸的组合物包括有效量的益生菌PTA22、具生物价值蛋白质的生物材料、寡糖和赋形剂。
简而言之，本发明的实施例可以在兔子进食的同时，为兔子提供益生菌PTA22，如此一来，可以保证兔子的健康，并提高兔子对致病菌的抵抗力。此外，益生菌PTA22还可以帮助兔子降低高钙尿症和结石的风险。
附图说明
图1为显示菌落LP1、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45在血琼脂培养基上的检测结果；
图2A-2E为分别显示菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45在pH＝3.0、2.5、2.0、1.5和1.0下的酸耐受性测试结果；
图3A-3B为分别显示菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的胆盐耐受性测试结果；
图4为分别显示菌落LP5、LP19、PTA22、LP1和LP2的疏水性测试结果；
图5为分别显示菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的自聚集的测试结果；
图6A-6E为分别显示菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22的共聚集测试结果；
图7为显示菌落PTA22在没有Mn2+及有Mn2+的情况下的草酸降解活性；
图8A为显示菌落PTA22分别在pH＝3.0、2.0、1.0、0.5％胆盐和1.0％胆盐下的酸耐受性试结果；
图8B为显示菌落PTA22在不同的pH值下，且分别于1、10、20、30、60、180和360分钟时的活菌数；
图9为显示菌落PTA22与各种冻干保护剂混合后，PTA22的冻干存活率的结果；
图10A-10C为分别显示冻干菌粉在pH＝3.0、2.0和1.0下的酸耐受性性测试结果；
图11A-11B为分别显示冻干菌粉在0.5％胆盐和1.0％胆盐环境中的胆盐耐受性测试结果；
图12为显示菌落PTA22与单一冻干保护剂和各种组合物混合的比较图；
图13A-13C为分别显示含有益生菌PTA22的组合物在pH＝3.0、2.0和1.0下的酸耐受性测试结果；
图14A-14B为分别显示含有益生菌PTA22与0.5％胆盐和1.0％胆盐的组合物的胆盐耐受性测试结果；
图15A-15B为分别显示PBS对照组和组合物的酸耐受性测试和胆盐耐受性测试结果；
图15C为显示PBS对照组和组合物的耐热性测试结果；以及
图16A-16B为分别显示不含益生菌PTA22的草饼和具有益生菌PTA22的草饼。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加地清楚，以下将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显而易见地，所描述的实施例是本发明实施例的一部分，而不是全部。基于本发明中的实施例，所述领域的通常知识者在根据通常知识而获得的所有其他实施例，都属于本发明所保护的范围。除非另有定义，本文所使用的技术或科学术语应具有与本发明相关的本领域技术人员所理解的通常含义，例如，本文所用「包括」和其他类似用语指出现在该用语之前的元素或对象包括在该术语之后列出的组件或对象及其均等，而不排除其他组件或对象。
[细菌的筛选及溶血测试]
为了确保筛选出的细菌没有引起疾病的可能性，对筛选出的细菌进行溶血测试以确认它们是否会引起疾病。如果菌落小、呈灰白色，且菌落周围没有溶血环，说明该细菌无致病性。
益生菌的菌株通过以下的方法培养。首先，每只兔子取0.1g的粪便颗粒，然后分别溶解在MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)培养液和苛养厌氧菌培养液(FastidiousAnaerobe Broth，缩写为FAB)中，如此一来，每只兔子的粪便颗粒便形成两种样品溶液。MRS培养液用于培养好氧菌(如乳酸杆菌)，FAB用于培养厌氧菌。接下来，将每只兔子的粪便颗粒的两种样品溶液分别以500rpm的速度离心后，各取100μL的上清液序列稀释，以形成相对于原来的菌液浓度为10-7、10-8和10-9的菌液。另外，兔子的盲肠粪便也进行了类似处理，但菌液的系列稀释浓度相对于原来的菌液浓度分别为10-8、10-9和10-10的菌液。
接着，将从MRS培养液和FAB中获得的不同浓度的菌液，且将这些不同浓度的菌液分别均匀地涂盘于MRS琼脂培养基(MRS agar)或苛养厌氧菌琼脂培养基(FastidiousAnaerobe Agar，缩写为FAA)上，以确认这些细菌的溶血特性。MRS琼脂培养基于好氧条件下，以37℃培养好氧菌，例如，乳酸杆菌培养12小时。FAA培养基各别地于好氧条件和厌氧条件下，于37℃中培养厌氧菌12小时。
然后，于血液琼脂培养基上涂盘，以确认单个菌落的溶血特性，且给予每个菌落编号。图1为显示菌落LP1、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45在血液琼脂培养基的检测结果。菌落LP1和LP2(图1未示出)是市售的人肠道益生菌，分别用作其他菌株的阳性对照组1和阳性对照组2，且在随后的实验中也是如此，且从兔子获得的菌落LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45。在图1中，菌落LP1、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45是非溶血性的。
接着，来自血液琼脂培养基的非溶血的菌落培养于3mL的MRS培养液或FAB中。于培养后，将培养基(MRS培养液或FAB)分别分装于1mL的微量离心管中，且分别有三管。并且，将250μL甘油添加到三个微量离心管中的其中两个，以做成冷冻管用于储存，剩余的一管微量离心管用于抽取脱氧核醣核酸(Deoxyribonucleic acid，缩写为DNA)和DNA定序。
进一步地，菌落LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的细菌通过16S rRNA基因进行基因定序，基因定序的过程如下：
1.提取DNA(DNA extraction)：使用十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide，缩写为CTAB)液氮冷冻法提取DNA，接着，以24：1的氯仿/异戊醇分离DNA和蛋白质。然后，加入酒精(EtOH)以沉淀DNA，再用洗提缓冲液(elution buffer)重新溶解。最后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检查DNA的正确性。
2.聚合酶连锁反应&凝胶纯化(Gel purification)：通过聚合酶连锁反应(Polymerase chain reaction，缩写为PCR)扩增细菌的16S rRNA基因，其中细菌的16SrRNA基因利用DNA聚合酶和16S引子(primer)(正向/反向)扩增。接着，通过1％琼脂糖凝胶电泳对细菌的16S rRNA基因的碱基对(base pair)的长短进行验证。然后，利用FavorgenFavorPrepTM GEL/PCR纯化试剂盒，来纯化细菌的目标16S rRNA基因。
3.接合(Ligation)&转形(Transformation)：通过T4 DNA连接酶，将含有Ampr基因的T&ATM载体(vector)和16S rRNA基因接合(ligate)。接着，将接合的载体转形(transform)到大肠杆菌的DH5α细胞中。然后，将转化后的大肠杆菌接种在含有氨苄青霉素(Ampicillin)的溶菌琼脂培养基(Lysogeny broth agar，缩写为LB agar)上，用于选择经T&ATM载体成功转形的DH5α细胞。经过夜培养后，选择存活于LB琼脂培养基上的菌落进行下一步的扩增。
4.质体提取&酶解：通过Favorgen FavorPrepTM质体提取试剂盒提取选定的通过DH5α细胞转化的菌落的质体。然后，将提取的质体用EcoRI或HindIII的限制性内切酶进行切割，以确认16S rRNA基因是否正确接合。接下来，通过1％琼脂糖凝胶电泳检查上述限制性内切酶的产物的碱基对之大小，与PCR结果进行比较，以检查16S rRNA基因是否已成功插入T&ATM载体。
5.定序：对通过限制性内切酶的切割位点鉴定的质体进行定序，且分析定序结果。菌落LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的序列请参考序列表。
[酸耐受性测试]
由于兔子胃酸的pH值约为1.5-1.0，因此，必须测试细菌的酸耐受性(acidtolerance)。进行酸耐受性测试以测试菌落LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的细菌在胃酸环境中的存活时间。
首先，用HCl将MRS培养液的pH值调整到1.0、1.5、2.0、2.5或3.0。接着，分别各取100μL的细菌LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的菌液，且分别加入到以下的MRS培养液中：阴性对照(仅MRS培养液)、pH＝1.0、pH＝1.5、pH＝2.0、pH＝2.5和pH＝3.0。然后，将菌液在37℃下培养4小时，于每小时测量菌液的OD600。
图2A-2E为分别显示菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45在pH＝3.0、2.5、2.0、1.5和1.0下的酸耐受性测试测试结果。在这项酸耐受性测试中，测试时间为0-6小时，0-6小时是根据先前研究中所述[Susan M.Smith(2012).，Gastrointestinal Physiologyand Nutrition of Rabbits.WB Saunders(第162-173页)]。如图2A-2E所示，菌落LP5、LP19和PTA22的存活率表明，从兔子身上发现的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)可以在酸性环境中耐受一段时间，甚至能够持续生长。此外，在1-2小时内，菌落PTA22的酸耐受性存活率最好。
[胆盐耐受性测试]
与酸耐受性测试相似，进行胆盐耐量测试测试(bile-salt tolerance test)以分别测试菌落LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45在肠道环境中的细菌活性。
首先，制备含有重量百分比为0.5％(即0.5wt％)和1.0wt％胆盐(bile-salt)的MRS培养液。接着，取各100μL的菌落LP5、LP19、PTA22、PAL44、SL45的菌液，分别加到以下MRS培养液中：阴性对照(仅MRS培养液)、0.5wt％的胆盐，以及1.0wt％的胆盐。然后，将菌液于37℃下培养8小时，且每小时测定这些菌液的OD600。
图3A-3B为分别显示菌落LP1(阳性对照组1)、LP2(阳性对照组2)、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的胆盐耐受性测试结果。由图3A-3B可知，菌落PAL44和SL45具有较好的活性，可以在肠道内稳定生长。植物乳杆菌的菌落LP5、LP19和PTA 22并无明显差异。根据[Susan M.Smith(2012).，Gastrointestinal Physiology and Nutrition of Rabbits.WBSaunders(第162-173页)]，食物通过十二指肠和回肠的时间分别为10-20分钟和30-60分钟。如图3A-3B所示，菌落LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45在为0.5wt％或1wt％的胆盐环境中，存活率会随着时间下降。因此，在产品开发中，保护剂(protective agent)对于细菌的存活量非常重要。
[分解酶活性分析]
为了探索菌落LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45分解纤维素的能力，进行了分解酶活性分析。所述分解酶包括羧甲基纤维素酶(carboxymethyl cellulase，缩写为CMCase)、木聚醣酶(xylanase)、淀粉酶(amylase)、果胶酶(pectinase)和蛋白酶(protease)。
在进入分解酶的活性测试之前，本实验所使用的试剂为刚果红(Congo red)和碘试剂。对于羧甲基纤维素酶、木聚醣酶和果胶酶的活性测试，使用刚果红进行测试，刚果红能与纤维素合成红色复合物，但不与纤维素水解后的产物发生反应。因此，如果细菌可以分解纤维素，当加入刚果红时，菌落周围会出现一个透明的环，即表示细菌已分解纤维素，使纤维素不能与刚果红合成红色复合物。而在淀粉酶活性测试中，淀粉与碘试剂反应后会生成紫色复合物，当淀粉发生分解时，则菌落周围会出现一个透明环。
在羧甲基纤维素酶、木聚醣酶和果胶酶的活性测试中，上述MRS琼脂培养基用重量百分比为0.1％的刚果红水溶液进行染色30分钟，在用1M的NaCl水溶液进行脱色。在淀粉酶的活性测试中，于含有重量百分比为0.02％淀粉的MRS琼脂培养基中加入重量百分比为1％的碘试剂，并染色1分钟，再用去离子水(ddH2O)进行脱色。另外，于蛋白酶的活性测试中，没有使用染色剂，而是肉眼观察的，且蛋白酶活性测试的实验结果也是通过菌落周围是否出现透明环来辨识的。
分解酶活性的分析可以分为定性和定量。在分解酶活性的定性分析中，通过4区划线法，将细菌涂盘于MRS琼脂培养基上，于37℃下培养2天。接着，在4区划线法的MRS琼脂培养基上取单个菌落，将该单个菌落点在含有重量百分比为1％羧甲基纤维素、0.05％木聚醣、1％果胶、0.02％淀粉或1％脱脂牛奶的MRS琼脂培养基上，并且培养1天。
如下表1所示，表1为定性分析的测试结果，从表1的测试结果可知，菌落LP1、LP2、LP5、LP19及PTA 44均具有羧甲基纤维素酶、木聚醣酶、果胶酶、蛋白酶的活性，因为它们都属于植物乳杆菌属(Lactiplantibacillus Plantarum)的同一属。
表1：羧甲基纤维素酶、木聚醣酶、淀粉酶、果胶酶和蛋白酶定性分析的测试结果
在分解酶活性的定量分析中，取菌液浓度为OD600＝1.0的菌液进行分析。利用牛津杯以限制位于MRS琼脂培养基上的细菌的生长区域，并将MRS琼脂培养基于37℃中培养2天后，以染色法观察分解酶的活性。其中，蛋白酶活性测试，结果可以直接用肉眼观察，不需要染色。分解酶活性的定量分析结果列于下表2中。
表2：在羧甲基纤维素酶、木聚醣酶、淀粉酶、果胶酶和蛋白酶的活性定量分析，及其所使用的基质(Substrate)和染剂。
分解酶活性的定量分析结果总结于下表3中。由表3可知，兔子的菌落LP5、LP19和PTA22的木聚醣酶和果胶酶活性优于菌落LP1和LP2。此外，菌落LP5、LP19和PTA22的羧甲基纤维素酶和蛋白酶的活性与菌落LP1和LP2差不多。
表3：菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的微生物分解区的直径(mm)。
[抗菌活性分析-琼脂扩散法]
肠道菌群失调(Dysbiosis of intestinal flora)可能导致各种疾病。家兔摄取益生菌对于抑制致病菌的增殖、调节菌群平衡及提高免疫力非常重要。因此，使用菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45来测试对部分致病菌的抑制活性，例如肠沙门氏菌(Salmonella Enterica)、松内志贺氏菌(Shigella Sonnei)、肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)、肺炎链球菌(St`reptococcus Pneumoniae)、蜡状芽孢杆菌(BacillusCereus)、葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)。琼脂扩散法的实验细节如下所述。
琼脂扩散法-1：使用本案的细菌进行测试
为了测试本案的细菌对致病菌生长的抑制情况，实验设计如下。将本案的细菌置于MRS培养液或FAB培养液中，以37℃培养12小时后，将100μL的菌液均匀地涂盘于MRS琼脂培养基或FAA培养基上，然后，分别干燥10分钟。接着，使用微量吸管(tips)在MRS琼脂培养基或FAA培养基点出几个孔。随后，将100μL的上述致病菌的菌液分别地加入孔中，然后，在37℃下培养12小时。菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的菌液涂盘的FAA培养基之致病菌生长区的直径(mm)列于下表4中，其中包括阴性对照组(无菌液)。
本实验的目的在于测试FAA培养基上的菌落是否能够有效地抑制加入孔中的致病菌生长。因此，生长区的直径越小则表示菌落对致病菌的抑制生长效果越好。为了使生长区直径的差异更为明确，实验组与对照组的生长区直径的差异值列于下表5，且从表5可以明显地得知，菌落LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45对致病菌具有抑制生长的作用，尤其是针对蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和肠沙门氏菌的抑制生长效果尤佳。
表4：FAA培养基上的致病菌生长区的直径(mm)，由菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45，包括阴性对照组。
*FAA阴性对照组：阴性对照组仅包括致病菌，菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45均未涂盘于FAA培养基上。
表5：实验组和阴性对照组之间生长区直径的差异值。
琼脂扩散法-2：使用无细胞溶液进行测试
首先，制备无细胞溶液(Cell-Free Solution，缩写为CFS)(含有细菌之代谢物)。此外，当益生菌分解纤维并将纤维转化为代谢物时，该代谢物就是后生元(Postbiotics)。让菌落LP1(阳性对照组1)、LP2(阳性对照组2)、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45在MRS培养液或FAB培养液中，于37℃下培养48小时，并以5000rpm离心后，分别收集菌落的上清液。
接着，上述的致病菌也分别在37℃下培养，直至致病菌的浓度分别达到1×108CFU/mL后，将100μL的上述致病菌的菌液均匀地铺盘在胰蛋白酶大豆琼脂(TryptoneSoy Agar；TSA)培养基上，静置10分钟。然后，使用微量吸管(tips)在胰蛋白酶大豆琼脂培养基点出几个孔，然后，再将100mL的上述菌落的菌液加入孔中，且在37℃下培养12小时。
菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45，及其对照组包括在内的无细胞溶液的抑制区(inhibitory zones)的测量直径，列于下表6中。本实验的目的在于测试孔中的无细胞溶液(CFS)抑制培养基上的致病菌生长的能力，因此，抑制区(inhibitory zones)的测量直径越大表示无细胞溶液(CFS)的抗菌效果越好。在表6中，菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22的无细胞溶液(CFS)表现出显著的抑制活性。
表6：菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的无细胞溶液(CFS)的抑制区的测量直径，其中包括其阴性对照组。
*ddH2O：阴性对照组，仅包含ddH2O，孔中未添加菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45。
*AP：氨苄青霉素
*KM：卡那霉素
抗菌活性分析-最低抑菌浓度和最小细菌浓度
最低抑菌浓度(Minimuminhibitory concentration，缩写为MIC)是指细菌在培养后，可以阻断致病菌的生长且可以观察到抗菌效果的最低浓度。最低抑菌浓度(MIC)越低表示对致病菌的抑制效果越好。
首先，分别制备菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22的无细胞溶液(CFS)。在营养培养液中培养菌落，并且在37℃下振荡48小时后，以5000rpm离心后，收集经培养的菌落的上清液，即为无细胞溶液(CFS)。接着，在具有营养培养液的96孔盘上，将每种无细胞溶液(CFS)序列稀释为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μL/mL的浓度。此外，96孔盘的营养培养液中还包括256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL氨苄青霉素或卡那霉素的营养培养液，作为阳性对照组。
接着，将100μL的无细胞溶液(CFS)和100μL的致病菌菌液分别添加到96孔盘的每个孔中。因此，96孔盘的每个孔的总体积为200μL。其中，用于本实验的致病菌包括肠沙门氏菌、松内志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌。
类似地，将100μL含有氨苄青霉素或卡那霉素的营养培养液，以及100μL的致病菌菌液分别加入到96孔盘的每个孔中。因此，96孔盘的每个孔的总体积为200μL。
然后，记录每个孔中OD600的初始值。随后，将96孔盘在37℃下培养24小时，并重新记录OD600值，以确定上述每个菌落的最低抑菌浓度(MIC)。
最后，将低于MIC之接下来三个浓度的无细胞溶液(CFS)取100μL，并涂盘于营养琼脂培养基上，接着，将营养琼脂培养基于37℃下培养48-72小时，其中，在营养琼脂培养基上没有菌落生长的无细胞溶液的浓度即被确定为最小细菌浓度(minimum bacterialconcentration，缩写为MBC)。
测定的上述菌落的最低抑菌浓度(MIC)和最小细菌浓度(MBC)分别列于下表7和8中。在表7和表8中，菌落PTA22对蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有较好的抑制活性。
表7：菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的最低抑菌浓度(MIC)。
表8：菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的最小细菌浓度(MBC)。
[抗菌活性分析-抗生素敏感性测试]
为了测试细菌对抗生素的敏感性，实验方案如下，其中抗生素例如为氨基糖苷类抗生素(Aminoglycosides antibiotics)、磺胺类抗生素(Sulfonamide antibiotics)、喹诺酮类抗生素(Quinolone antibiotics)、氨苄青霉素(Ampicillin)、头孢噻肟(Cefotaxime)、氯霉素(Chloramphenicol)、红霉素(Erythromycin)、立放霉素(Rifampicin)和四环霉素(Tetracycline)。进一步地，喹诺酮类抗生素包括环丙沙星(Ciprofloxacin)，氨基糖苷类抗生素包括卡那霉素和万古霉素(Vancomycin)，磺胺类抗生素包括磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole)。利用营养培养液将上述抗生素序列稀释为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL，并分别加入96孔盘中，且96孔盘的每孔中的抗生素溶液的体积为100μL。接着，将100μL的待测菌落LP1、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的菌液分别加入96孔盘的每个孔中，如此一来，96孔盘的每个孔内的溶液的总体积为200μL。并且，记录每个孔在600nm(OD600)的初始吸亮度。然后，将96孔盘置于37℃下，培养24小时。接着，再次测量每个孔的OD600以确定最小抑制浓度。抗生素敏感性测试结果如下表9所示，在表9中，申请人还列出其他已发表文献的其他植物乳杆菌(L.pl 24-2L、L.pl 24-2L、L.plantarum 299和L.plantarum 299v)的数据。
如表9所示，卡那霉素、磺胺甲恶唑和万古霉素对菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22的最低抑制浓度相当地高(>256μg/mL)。环丙沙星对菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22的最低抑制浓度次高(>128μg/mL)。这些结果显示，菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22对环丙沙星、卡那霉素、磺胺甲恶唑和万古霉素具有抗性。并且，与欧洲食品安全局(European FoodSafety Authority，缩写为EFSA)的MIC突破种(breakpoints species)L.plantarum(列在表9的最后一列)相比，菌落PTA22对氯霉素、卡那霉素和四环素具有更高的耐受性，但对氨苄青霉素具有更高的敏感性。
表9：菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22的最低抑制浓度(μg/mL)，以及其他已发表文献的其他植物乳杆菌(L.pl 24-2L、L.pl 24-2L、L.plantarum 299和L.plantarum 299v)的数据
1.LP和PTA22：Lactiplantibacillus Plantarum
2.L.pl 24-2and LL.pl 24-5D(Lactiplantibacillus Plantarum)：参考自Georgieva et al.,2015.(Georgieva,R.,Yocheva,L.,Tserovska,L.,Zhelezova,G.,Stefanova,N.,Atanasova,A.,&Karaivanova,E.(2015).Antimicrobial activity andantibiotic susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacterium spp.intendedfor use as starter and probiotic cultures.Biotechnology&BiotechnologicalEquipment,29(1),84-91.)
3.L.plantarum 299and L.plantarum 299v(Lactiplantibacillus Plantarum)：参考自Klarin et al.,2019.(Klarin,B.,Larsson,A.,Molin,G.,&Jeppsson,B.(2019).Susceptibility to antibiotics in isolates of Lactobacillus plantarum RAPD-type Lp299v,harvested from antibiotic treated,critically ill patients afteradministration of probiotics.MicrobiologyOpen,8(2),e00642.
4.N：Not specified/tested
5.EFSA：欧洲食品安全局(European Food Safety Authority)(EFSA(2005).Opinion of the scientific panel on additives and products or substances usedin animal feed on the updating of the criteria used in the assessment ofbacteria for resistance to antibiotics of human or veterinary importance.TheEFSA Journal,223,1–12.)
[附着力测试-疏水性(Hydrophobicity)]
在益生菌在胃肠道中定殖(colonization)时，第一步便是将细菌附着到宿主的细胞组织上，其中，疏水性决定了细菌的粘附能力，益生菌的附着能力是决定益生菌能否在兔子的胃肠道中茁壮成长的关键。因此，附着力测试中的疏水性实验设计如下。
将菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22的细菌经过夜培养后，再将这些菌液以5000g的转速离心15分钟。接着，使用4℃(低温)的无菌磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate bufferedsaline，缩写为PBS)溶液来清洗离心后的菌块(pellets)，并且，再次重复离心步骤和清洗步骤。然后，使用PBS溶液悬浮(suspend)菌块(pellets)，并且形成OD600＝1.0的初始菌液(标示为H1)。
将0.6mL的有机溶剂加入至3mL的初始菌液中，并震荡(vortex)2分钟以形成混合菌液，并将混合菌液置于室温下反应。接着，小心地除去下层的水相层液体后，测量上层有机层的OD600值(标示为H2)。上述的有机溶剂为正十六烷(n-hexadecane)、二甲苯(Xylene)或甲苯(Toluene)。另外，疏水性的百分比(Hydrophobicity％)可以利用下列的公式(1)计算。
图4和表10呈现了疏水性的测试结果。一般来说，细菌的疏水性与细菌对肠壁的亲和性(affinity)有关，因此疏水性高的细菌可以很好地附着在肠壁上。如图4所示，在菌落LP5、LP19和PTA22中，只有菌落LP19的疏水性高于10％，因此，疏水性的测试结果显示菌落LP5、LP19和PTA22在兔子肠壁的附着力相对不足。
表10：疏水性的测试结果
有机溶剂 LP1 LP2 LP5 LP19 PTA22
正十六烷(％) 8.72 16.89 4.20 9.80 6.54
二甲苯(％) 7.45 13.74 6.61 11.36 8.55
甲苯(％) 9.26 10.90 6.14 10.99 7.70
[附着力测试-自聚集(Auto-Aggregation)]
除了疏水性外，细菌的自聚集(auto-aggregation)能力对细菌与肠细胞的附着也具有重要的影响。因此，下一步即是测试菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的自聚集能力。
制备10mM的PBS溶液。将PBS溶液的pH值调至pH＝7.4，然后将PBS溶液灭菌备用。分别取MRS琼脂培养基的单个菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45，置入3mL的MRS培养液中，于37℃下振荡培养16小时。接着，将菌液以6000rpm离心10分钟，除去上清液后，用前述的PBS溶液清洗菌块(pellets)，并且使用PBS溶液悬浮菌块(pellets)，以形成OD600＝0.600的初始菌液(标示为A1)。
初始菌液在37℃下培养，并且于培养1、3、6、24小时后测量其OD600值(分别标示为A2)。因此，可以通过下列的公式(2)计算自聚集率(Auto-aggregation％)。
图5为分别显示菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45的自聚集的测试结果。如图5所示，菌落PAL44和SL45的自自聚集率明显地高于较其他菌落，且在大约3小时的时候，菌落PAL44和SL45的自聚集率已达到90％，而其他的菌落PL1、PL2、PL5、PL19和PTA22的自聚集率在24小时的时候，才达到90％，据此，这些菌落PL1、PL2、PL5、PL19和PTA22的自聚集率并没有表现显著的差异。根据论文(AIMS Microbiol.2018；4(1):140-164.)的作者Jack C.Leo等人的说法，自聚集是生物膜形成的条件之一，也是肠壁附着能力的评价指标之一。如图5所示，菌落PTA22在24小时的自聚集率约为90％，因此，菌落PTA22通过胃(3-6小时)、十二指肠和回肠(约1小时)后，菌落PTA22可以有效地在盲肠形成生物膜，并且在盲肠中定殖(colonization)。
[附着力测试-共聚集(Co-Aggregation)]
共聚集(Co-aggregation)会防止致病菌附着于宿主组织上，以避免致病菌定殖于胃肠道中。因此，接着，进行共聚集测试，以了解细菌(即菌落LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22、PAL44和SL45)的共聚集能力。
分别取MRS琼脂培养基的单个菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22，且分别在3mL的MRS培养液中在37℃下，振荡培养16小时。将上述菌液与等量的致病菌混合，然后震荡(vortex)30秒，形成混合菌液。然后，将混合菌液在37℃下培养1、3、6、24小时后，测量其OD600值(标记为Am)。共聚集可以通过下列公式(3)计算共聚集率。于公式(3)中，除上述Am外，A1为上述菌液的OD600值，A2为致病菌的OD600值。
图6A-6E为分别显示菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22的共聚集的测试结果，且在图6A-6E中，致病菌的简称请见下表11。由测试结果可知，植物乳杆菌LP1、LP2、LP5、LP19、PTA22与金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、蜡状芽孢杆菌和大肠杆菌的共聚集率较高，而其中以菌落PTA22的共聚集率最高。另外，菌落LP1、LP2、LP5、LP19和PTA22皆可以有效地抑制金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、蜡状芽孢杆菌和大肠杆菌的生长。
表11：致病菌的缩写
综合以上所述，菌落PTA22的细菌具有以下特征：首先，菌落PTA22对酸的耐受性较强，但对胆盐的耐受性较低。在降解酶活性分析中，菌落PTA22的在羧甲基纤维素酶、木聚醣酶、果胶酶和蛋白酶具有较好的性能，即植物乳杆菌的菌落PTA22可以在含有果胶和短链脂肪酸的培养基中生长，因此，可以将果胶和短链脂肪酸添加到兔子的饲料中。而在上述附着力测试中，疏水性(％)和自聚集率(％)并不高，如此一来，菌落PTA22可与食糜一起被传送至盲肠中，并在盲肠或大肠中时，菌落PTA22发挥在羧甲基纤维素酶和木聚醣酶的活性。在抗菌活性分析中，菌落PTA22的无细胞溶液(CFS)对多种致病菌表现出抗菌活性，其中，与氨苄西林相比，PTA22不受β-内酰胺酶(β-lactamase)的限制，具有更广泛的抗菌活性；而与卡那霉素相比，PTA22对肠沙门氏菌、松内志贺氏菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌具有更明显的抗菌活性。因此，PTA22可用作成年兔子的益生菌。
此外，菌落PTA22已于2021年5月24日，在NITE专利微生物寄存中心(NPMD)寄存，寄存编号为BP-03477。
[PTA22的草酸降解活性]
兔子吃的饲料中钙含量过高会导致兔子摄入过多的钙，而身体会将摄取的多余的钙通过尿液排出体外，即尿钙(calciuria)。然而，长期尿钙会对兔子的肾脏造成负担，严重时可能会引起结石(calculus)，甚至导致肾功能衰竭。因此，对于兔子来说，益生菌是否具有降解草酸的能力相当地重要。以下实验便是测试PTA22是否具有降解草酸的能力。
实验分为两组，第一组：PTA22在MRSOx中培养，MRS培养液含有10mM/L草酸钠，第二组：MRSOx与Mn2+，MRS培养液含有10mM/L草酸钠和5mM/L的MnCl2。草酸盐的浓度使用草酸盐测量试剂(Abcam，UK)，未用来培养的MRSOx作为阴性对照组。此外，本实验是以文献(intestinal lactic acid bacteria in dogs and cats(J.S.Weese et al.,2004))作为参考。
请参阅图7，图7为显示PTA22在没有Mn2+和有Mn2+的情况下的草酸降解活性。在没有Mn2+的情况下，48小时草酸降解率达到9.33％，PTA22具有降解草酸的活性。由于Mn2+会催化草酸降解反应，添加Mn2+后，草酸的降解率在每个时间点都有所提升，尤其是在48小时的时候，达到28.66％。
根据文献，Oxalate degradation by intestinal lactic acid bacteria indogs and cats(J.S.Weese et al.,2004)，PTA22的草酸降解活性显著高于野生型(wildtype)的草酸降解活性。因此，PTA22具有草酸降解活性。
[PTA22的抗压能力-酸耐受性和胆盐耐受性]
请参阅图8A-8B，图8A为分别为PTA22在pH 3.0、2.0、1.0、0.5％胆盐和1.0％胆盐的压力耐受性测试结果；图8B为在不同pH值下，分别在1、10、20、30、60、180和360分钟的PTA22的活菌数。图8A显示，PTA22在pH值＝3.0、2.0及1.0时，没有抗酸性活性，并且活菌数随时间减少。此外，PTA22也不耐受于1.0％的胆盐环境中。图8B显示，PTA22在pH＝6.0、5.0及4.0的环境中仍能持续生长。然而，PTA22从pH＝3.0开始没有酸耐受性活性，且活菌数从pH＝3.0开始下降。
由于兔子的胃酸环境可以达到pH＝1.0，且兔子属于后肠发酵，因此，益生菌存在于兔子消化道中的环境非常关键。但是，PTA22的酸耐受性及胆盐耐受性稍有不足，因此，在制造过程中，将PTA22制成兔子可以食用的形式相当的重要。
为了能够提供更好的抗菌性，以帮助成年兔子在进食时分解纤维，PTA22可以被制成任何可以被兔子食用的形式。此外，为了解决PTA22的酸耐受性和胆盐耐受性的问题，将PTA22与其他赋形剂(excipients)混合作为冻干保护剂(lyoprotectants)。以下为对作为冻干保护剂之各种材料进行测试实验。
[单一材料-PTA22的冻干粉的制备]
由于兔子日常饮食中所需的主要营养素为纤维素、蛋白质、碳水化合物、维生素及矿物质，因此，本发明针对某些材料进行实验，以评估这些材料是否可以作为冻干保护剂(lyoprotectants)。
首先，介绍材料。可以与PTA22混合而制成兔子可食用的食物的材料大致可分为4类：蛋白质、碳水化合物、具高生物价蛋白质的生物材料(biological materials withhigh biological value protein)和醣醇。
所述的蛋白质包括脱脂牛奶(skim milk)、乳清蛋白(whey protein)、大豆蛋白(soybean protein)和豌豆蛋白(pea protein)。碳水化合物包括单醣(monosaccharides)、双醣(disaccharides)、多醣(polysaccharides)和寡醣(oligosaccharides)。单醣包括甘露醣(mannose)和鼠李醣(rhamnose)。双醣包括蔗糖(Sucrose)和海藻醣(Trehalose)。寡醣包括菊粉(inulin)、木寡醣(xylo-oligosaccharides)和果寡醣(fructo-oligosaccharides)。
具高生物价蛋白质的生物材料是指生物体所食用的能够保留在生物体内以满足生长和/或维持所需，以降低饲料转化率(feed conversion rate，缩写为FCR)的生物材料。具有高生物价值蛋白质的生物材料包括辣木叶(Moringa oleifera)及小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，辣木叶及小球藻提供高生物价蛋白质和维生素。此外，将生物材料制成粉末，在实验或制备过程中可以更容易地称重。
此外，重量/体积百分比为2.5％(wt/vol％)的麸胺酸钠(sodium glutamate)、1wt/vol％的黄原胶(Xanthan gum)和1wt/vol％的阿拉伯胶(gum Arabic)也是在测试中使用的测试单一材料。此外，使用10wt/vol％PBS溶液作为阴性对照组。
接着，每种材料的制备浓度如下所示。实际上，实验中使用了5-15wt/vol％的蛋白质，因为超过15wt/vol％的蛋白质存在过饱和的问题。实验中使用了5-20wt/vol％的碳水化合物，因为超过20wt/vol％的碳水化合物存在过饱和的问题。
此外，具高生物价蛋白质的生物材料在制备兔子食物时，具有赋形剂的功能。其中，根据实验结果，5-10wt/vol％的具高生物价蛋白质的生物材料的赋形效果较佳。
接着，将1mL的上述的单一材料与PTA22的菌块(pellets)混合。通过将PTA22菌块(pellets)悬浮于10mM PBS溶液中，然后，PTA22的浓度测量是以测量PTA22菌液的OD600来估计的。当OD600＝1.00±0.02时，便可以对PTA22菌液进行冻干测试。将冷冻干燥机在-40℃、12Pa下，预冷30分钟后，将PTA22菌液与单一材料混合的液体在-40℃下冷冻，且冷冻干燥10小时，以制成冻干菌粉(freeze-dried bacterial powder)。然后，将PTA22菌液与单一材料混合的冻干菌粉保存于4℃，直至下一步的测试。
[单一材料-冻干存活率测试]
将冻干菌粉(freeze-dried bacterial powder)重新溶解在PBS溶液中，且定量至1mL以制成菌液。用PBS溶液序列稀释100μL的菌液，然后涂盘于培养基上，并于37℃下进行培养。培养后，菌液的CFU/mL(标示为N1)以下列的公式(4)计算。公式(4)中，N0表示冻干前菌液的CFU/mL，N1表示冻干后菌液的CFU/mL。
如图9所示，与醣类或蛋白质混合的PTA22具有更好的抗冻干能力，其中，特别是PTA22与10wt/vol％的海藻糖、10wt/vol％的脱脂牛奶或10wt/vol％的山梨糖醇混合后，其冻干存活率高达70％以上，其次，将PTA22与10wt/vol％蔗糖、10wt/vol％鼠李糖或10wt/vol％甘露糖混合后，其冻干存活率可达60％以上。
[单一材料测试-冻干菌粉的酸耐受性]
将上述的冻干菌粉分别加入3mL的MRS培养液中，且各条件如下：(1)pH＝3.0的MRS培养液；(2)pH＝2.0的MRS培养液；(3)pH＝1.0的MRS培养液。接着，分别在1、30、60、180和360分钟时，取培养后的100μL的菌液，且将菌液以8000rpm离心30秒后，去除上清液。然后，用100μL的10mM PBS溶液清洗菌块(pellets)，再将悬浮溶液以8000rpm离心30秒后，去除上清液。加入100μL的10mM PBS溶液以悬浮菌块(pellets)，并用10mM PBS溶液序列稀释菌液，接着，将稀释后的菌液涂盘于MRS琼脂培养基上，以37℃培养3天。最后，计算酸耐受性测试的CFU/mL。
此外，本实验更包括酸耐受性测试的对照组。将0.1g冻干菌粉定量至1mL，以10mMPBS溶液作为菌液，再取100μL菌液进行序列稀释，并涂盘于MRS琼脂培养基上，以37℃培养后，计算酸耐受性测试对照组的CFU/mL。
图10A-10C分别显示了冻干菌粉在pH 3.0、2.0和1.0下的酸耐受性测试结果。如图10A-10C所示，单一材料(例如10wt/vol％果寡糖、10wt/vol％果寡糖、10wt/vol％寡醣、2.5wt/vol％麸胺酸钠、10wt/vol％脱脂牛奶、10wt/vol％乳清蛋白和5wt/vol％辣木叶)可以帮助PTA22在酸性环境(pH 3)中生长。并且，20wt/vol％的麦芽糊精和10wt/vol％的木寡糖，可以帮助PTA22在酸性环境(pH＝1.0)中仍然维持一定的活菌量。
由于，兔子胃酸为pH＝1.0至1.5，并且，食物在兔子摄入后约360分钟才会通过胃，因此，于本实验中，pH为1.0及360分钟的数据最接近兔子的摄食情况，因此，对于兔子产品的后续开发而言，10wt/vol％的果寡糖和5wt/vol％的辣木叶相当地重要。
[单一材料-冻干菌粉的胆盐耐受性]
将上述冻干菌粉分别加入3mL的MRS培养液中，且各条件如下：(1)含有0.1％胆盐的MRS培养液；(2)含有0.05％胆盐的MRS培养液。接着，分别在1、30、60、180和360分钟时，取100μL的菌液。将菌液以8000rpm离心30秒后，去除上清液，再用100μL的10mM PBS溶液清洗菌块(pellets)。然后，将悬浮溶液以8000rpm离心30秒，去除上清液后，加入100μL的10mMPBS溶液以悬浮菌块(pellets)，并用10mM PBS溶液系列稀释菌液。将稀释后的菌液涂盘于MRS琼脂培养基上，以37℃培养3天。最后，计算胆盐耐受性测试的CFU/mL。
此外，本实验更包括胆盐耐受性测试的对照组。将0.1g冻干菌粉定量至1mL，以10mM PBS溶液作为菌液，取100μL菌液进行系列稀释，并涂盘于MRS琼脂培养基上，以37℃培养后，计算胆盐耐受性测试对照组的CFU/mL。
图11A-11B为分别显示冻干菌粉于0.5％胆盐和1.0％胆盐的胆盐耐受性的测试结果。如图11A-11B所示，大豆蛋白和豌豆蛋白等蛋白质，果寡糖和木寡糖等寡醣，以及辣木叶和小球藻等具高生物价蛋白质的生物材料，帮助了PTA22提升了胆盐耐受性。值得一提的是，20wt/vol％的麦芽糊精还可以保护PTA22免受胆盐耐受性的影响。
[组合物-用于制备PTA22冻干粉的冻干保护剂]
根据上述冻干、酸耐受性和胆盐耐受性的实验数据，部分的单一材料，例如大豆蛋白、豌豆蛋白、果寡糖、木寡糖及辣木叶，可以帮助PTA22在酸的环境下存活。此外，蛋白质、寡醣和高生物价蛋白质的生物材料帮助PTA22在胆盐耐受性测试中有良好的表现。因此，进一步，进行组合上述材料的各种组合物的实验。各种组合物列于下表12中。
表12：PTA22的各种组合物
组合物和PTA22的配方描述如下：以SMF为例，取10g脱脂牛奶、10g辣木叶和10g果寡糖，加入ddH2O至100mL。最后，将1mL的SMF与定量的PTA22混合后，进行冷冻干燥。
[组合物-冻干测试]
测试上述的组合物与PTA22混合后的冻干耐受性。冻干耐受性测试的实验方案在前面的内容中已描述，在此不再赘述。如图12所示，与单一的冻干保护剂相比，于冻干耐受性测试中，含有PTA22的组合物具有大于60％的相对稳定的冻干存活率。基于草食动物的食物配方，BMF、BMX、BCF、BCX、PMF、PMX、PCF和PCX是更好的选择。
[组合物-酸耐受性测试]
测试上述组合物与PTA22混合的酸耐受性性。酸耐受性测试的实验方案在前面的内容中已描述，在此不再赘述。图13A-13C分别显示了含有PTA22的组合物在pH值为3.0、2.0和1.0下的酸耐受性测试结果。
如图13A-13C所示，所有组合物与PTA22混合后，PTA22的酸耐受性性有显著的改善。其中，将图8A-8B与图13A-13C比较，BMF在pH值为3.0、2.0和1.0的条件下，仍具有随着时间持续增长的活菌数，特别是pH值为1.0且360分钟的条件下，与其他组合物相比，BMF与PTA22混合的酸耐受性性效果最为显著。因此，BMF对帮助PTA22在酸性环境中持续生长的效果最好。
[组合物-胆盐耐受性测试]
测试上述组合物与PTA22混合的胆盐耐受性。胆盐耐受性测试的实验方案在前面的内容中已描述，在此不再赘述。图14A-14B为分别显示含有PTA22的组合物分别在和0.5％胆盐和1.0％胆盐环境的胆盐耐受性的测试结果。
如图14A-14B所示，在胆盐耐受性测试中，与没有任何保护剂的PTA22相比，所有组合物与PTA22混合皆使得PTA22的活菌数有显著提升，并且，增强了PTA22在压力下生长的能力。
比较图8A和图14A，PTA22无法在0.5％的胆盐环境中持续生长，且PTA22只能维持某一程度的活菌数。然而，如图8A，与组合物混合的PTA22可以在0.5％胆盐环境中持续生长，并且活菌数高于原始的活菌数。
比较图8A和图14B，PTA22无法在1.0％胆盐环境中存活，并且于1.0％胆盐环境30分钟后，便无法测量到PTA22的活菌数。然而，如图14B所示，与组合物混合的PTA22可以在1.0％胆盐环境中继续生长，其中，5-10％wt/vol BMF、10wt/vol％BMX、10wt/vol％BCF、5％wt/vol PMF、5wt/vol％PMX和10wt/vol％PCX等组合物是较好的冻干保护剂。
此外，除考虑冻干保护剂是否具有增加PTA22的抗酸耐受性和抗胆盐耐受性外，还需要考虑后续制备兔子食物的类型、溶解性和粘性。经测试，由5％蛋白质(脱脂牛奶、乳清蛋白、大豆蛋白或豌豆蛋白)、生物材料(10％小球藻或5％辣木叶)和5％寡醣(果寡糖或木寡糖)组成的组合物具有可溶解性且流动性好等优点，但粘性较差，易崩解。因此，即使含有5％蛋白质和5％寡醣的组合物有助于PTA22具有良好的酸耐受性，但仅含有5％蛋白质和5％寡醣的组合物不适合制备兔子的食物。
10wt/vol％的蛋白质(脱脂牛奶、乳清蛋白、大豆蛋白或豌豆蛋白)、生物材料(10wt/vol％小球藻或wt/vol 5％辣木叶)和10wt/vol％寡醣(果寡糖或木寡糖)具有可溶解性且流动性好等优点，并且粘性好，不易崩解。因此，含有10％蛋白质和10％寡醣的组合物适合用于制备兔子的食物。
[其他组合物-压力耐受性测试(Stress Tolerance Test)]
值得一提的是，如图12-14B所示，单一材料中的麦芽糊精和大豆蛋白使PTA22在冻干耐受性、酸耐受性和胆盐耐受性的能力上有显著的提升。因此，本发明进一步提供另外一种组合物，其包含20％的麦芽糊精、10％的大豆蛋白和PTA22。
接着，对包含20％麦芽糊精、10％大豆蛋白和PTA22的组合物进行酸耐受性测试和胆盐耐受性测试。酸耐受性测试方案和胆盐耐受性测试方案与前述相同，在此不再赘述。
为了仿真益生菌制造过程的环境，以下进行耐热性测试。耐热存活率测试的条件如下：
(1)0.05g的冻干菌粉在60℃下测试30分钟；(2)将0.05g的冻干菌粉溶于200μL的10mM PBS溶液中，以60℃进行30分钟的测试。然后，将不同条件下的冻干细菌粉末用10mMPBS溶液定量至1mL。每100μL加热后的菌液用MRS培养液序列稀释，以计算CFU/mL(标示为N4)。
类似地，对控制组的耐热性进行测试，控制组的处理方式如下：将0.05g冻干菌粉定量至1mL，用10mM的PBS溶液作为菌液，取100μL的菌液进行序列稀释并涂盘于培养基上。培养基在37℃下培养后，计算原始菌数CFU/mL(标示为N3)。
耐热性存活率以公式(5)计算，其中在公式(5)中，N3表示37℃(即不加热)的菌液的CFU/mL，N4表示60℃菌液的CFU/mL。
图15A-15B为分别显示PBS对照组和组合物的酸耐受性测试和胆盐耐受性测试结果；图15C显示了PBS对照组和组合物的耐热性测试结果。
如图15A-15B所示，与PBS对照组相比，包含20wt/vol％麦芽糊精、10％大豆蛋白和PTA22的组合物具有更好的酸耐受性能力和胆盐耐受性能力。此外，如图15C所示，在60℃且作用30分钟的条件下，0.05g的冻干菌粉的含水量决定了高温环境下的存活率，并且，冻干菌粉的存活率高于菌液。
[兔子食物的制备]
本发明的其中一个目的便是为兔子提供含有益生菌的食物，例如含有益生菌的草饼、片剂、饼干或颗粒状食物，以使兔子在进食时，便能够获得适当的益生菌进行消化。因此，下一步是将赋形剂与特定成分的组合物混合，以获得可以适合生产及储存的兔子食物。
首先，含有PTA22的食物的制备方案如下：PTA22与3mL的MRS培养液在37℃下培养12小时后，将100μL的培养后菌液在50mL的MRS培养液中以37℃进行继代培养12小时，以扩增细菌。接着，将继代培养后的菌液以5000rpm离心5分钟，除去上清液。用10mM PBS溶液悬浮菌块(pellets)，并将悬浮的菌液通过OD600以定量为OD600＝1.00±0.02。取1mL定量后的菌液置于15mL离心管中，将定量后的菌液以5000rpm离心5分钟，去除上清液。转移和离心的步骤在同一个15mL离心管中重复4次，以获得4倍量的菌块(pellets)，且分别用4mL的组合物溶液悬浮菌块(pellets)。经测试，PTA22的菌块(pellets)为(1.00±0.02)×1012CFU/mL。
然后，用模具称取2g赋形剂，所述的赋形剂例如为草粉、药草粉、蔬菜粉、果粉、淀粉、豆渣、纤维粉或其任意组合，并添加4mL的组合物溶液后，将具有PTA22的组合物溶液充分混合并压制成草饼、片剂、饼干或颗粒状食物。接着，将草饼在-20℃中冷冻过夜以使其成形，最后，将草饼、片剂、饼干或颗粒状食物用冷冻干燥机在12Pa、-40℃的条件下冷冻干燥10小时，并将草饼、药片、饼干或颗粒状食物放入袋子中，且置于干燥箱中。
附加一提的是，本制备过程更制备了未添加PTA22的组合物的草饼、片剂、饼干或颗粒状食物作为对照组。
表12：每个草饼、片剂、饼干或颗粒状食物的各别含量
如上表12所示，上述的营养组合物的蛋白质、生物材料、寡醣和赋形剂的重量比为2-4：1-2：2-4：100，该营养组合物含有(1.00±0.02)×1012CFU/mL的PTA22。
图16A-16B分别显示不含PTA22的草饼和含有PTA22的草饼。如图16A-16B所示，添加的营养组合物而未添加PTA22可以使食物的赋形能力更好，但通过冷冻干燥制备后，仍容易受到霉菌污染；而含有PTA22的营养组合物不仅提升了兔子食物的赋形能力，并且，含有PTA22的草饼也降低在冻干过程中受到外源霉菌污染的情况发生。
【符号说明】
无

Claims (14)

1.一种来自兔子的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus Plantarum)益生菌(以下称为益生菌PTA22)，
其中所述益生菌PTA22的16S rRNA的基因序列为SEQ ID No:3，在NITE专利微生物寄存中心(NPMD)的寄存号为BP-03477；
其中所述益生菌PTA22具有草酸降解活性、羧甲基纤维素的消化活性、果胶酶的消化活性、木聚醣酶的消化活性和蛋白酶的消化活性；
其中所述益生菌PTA22可以抑制致病菌的生长，所述致病菌包括蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、肠沙门氏菌、松内志贺氏菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌中的至少一种；以及
其中所述益生菌PTA22对包括氨基糖苷类抗生素、磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素及其衍生物中的至少一种的抗生素具有抗性。
2.如权利要求1所述的益生菌，其中所述喹诺酮类抗生素包括环丙沙星，所述氨基糖苷类抗生素包括卡那霉素和万古霉素，所述磺胺类抗生素包括磺胺甲恶唑。
3.一种用于制备兔子食物的营养组合物，包括：
益生菌混合物，其包括如权利要求1所述的益生菌PTA22、所述益生菌PTA22的后生元或其组合；
具高生物价值蛋白质的生物材料的水性悬浮溶液；
寡醣的水溶液；以及
赋形剂。
4.如权利要求3所述的用于制备兔子食物的营养组合物，更包含、一蛋白质的水溶液。
5.如权利要求4所述的用于制备兔子食物的营养组合物，其中所述蛋白质、所述具高生物价值蛋白质的生物材料、所述寡醣和所述赋形剂的重量比为2-4：1-2：2-4：100，其中所述益生菌混合物包括(1.00±0.02)×1012CFU/mL的所述益生菌PTA22。
6.如权利要求3所述的用于制备兔子食物的营养组合物，其中所述具高生物价值蛋白质的生物材料的水性悬浮溶液为选自5-10wt/vol％的辣木叶和5-10wt/vol％的小球藻。
7.如权利要求3所述的用于制备兔子食物的营养组合物，其中所述寡醣的水溶液为选自10-20wt/vol％的木寡糖以及10-20wt/vol％的果寡糖所组成的群组中的一种。
8.如权利要求4所述的用于制备兔子食物的营养组合物，其中所述蛋白质的水溶液为选自5-10wt/vol％的脱脂牛奶以及5-10wt/vol％的乳清蛋白所组成的群组中的一种。
9.如权利要求4所述的用于制备兔子食物的营养组合物，其中所述赋形剂为草粉、药草粉、蔬菜粉、果粉、淀粉、豆渣、纤维粉或其任意组合。
10.如权利要求9所述的用于制备兔子食物的营养组合物，其中所述食物的种类包括草饼、片剂、饼干或颗粒状食物。
11.一种用于降解兔子饮食中草酸的组合物，包括：
有效量的如权利要求1所述的益生菌PTA22、所述益生菌PTA22的后生元或其组合；
组合物，包括具高生物价值蛋白质的生物材料；
寡醣的水溶液；以及
赋形剂。
12.如权利要求11所述的降解兔子饮食中草酸的组合物，其中所述具高生物价值蛋白质的生物材料为选自由5-10wt/vol％辣木叶和5-10wt/vol％小球藻所组成的群组中的一种。
13.如权利要求11所述的降解兔子饮食中草酸的组合物，其中所述寡醣为选自由10-20wt/vol％的木寡糖和10-20wt/vol％的果寡糖所组成的群组中的一种。
14.如权利要求11所述的降解兔子饮食中草酸的组合物，其中所述赋形剂为草粉、药草粉、蔬菜粉、果粉、淀粉、豆渣、纤维粉或其任意组合。
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