CN116782771A - 用于支持患有胃肠病症的伴侣动物的组合物和相关方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于为受炎性肠病(IBD)和/或肠易激综合征(IBS)影响的伴侣动物提供支持的组合物。在一些实施例中，该组合物包括至少一种狼益生菌分离株和至少一种犬益生菌分离株。在一些实施例中，该组合物进一步包括至少一种益生元。还提供了用于制备组合物和用于治疗受试者的IBS和/或IBD的相关方法。

Description

用于支持患有胃肠病症的伴侣动物的组合物和相关方法
相关申请
本公开要求2020年6月29日提交的美国临时专利申请第63/045,283号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及用于治疗胃肠病症的组合物。更特别地，本公开涉及用于支持伴侣动物中受炎性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)影响的伴侣动物的组合物和相关方法。
背景技术
患有炎性肠病(IBD)或肠易激综合征(IBS)的动物通常会出现多种症状，包含但不限于：腹泻、腹痛、胃肠通过时间加快和饮食偏好改变。常见的涉及特征包含遗传易感性、肠道屏障功能受损和肠道微生物群改变。可能的治疗方法包含应用抗生素、益生素、益生元和粪便移植(Major和Spiller,2014)。
尽管已经开发了多种疗法来治疗人类的IBD和IBS，但这些治疗方案通常对动物无效。很少有市售的治疗方案针对如家养狗等伴侣动物的IBS和IBD治疗进行优化。
发明内容
一方面，提供了一种组合物，其包括：狼益生菌第一分离株，其中该狼益生菌第一分离株是乳杆菌科的物种；狼益生菌第二分离株，其中该狼益生菌第二分离株是肠球菌科的物种；和至少一种犬益生菌分离株，其中该至少一种犬益生菌分离株包括乳杆菌科的至少一个物种。
在一些实施例中，该组合物进一步包括至少一种益生元。
在一些实施例中，该至少一种益生元包括麦芽糖糊精、腐植酸和富里酸中的至少一种。
在一些实施例中，该狼益生菌第一分离株是促生乳杆菌属物种，并且该狼益生菌第二分离株是肠球菌属物种。
在一些实施例中，该狼益生菌第一分离株是短促生乳杆菌，并且该狼益生菌第二分离株是屎肠球菌。
在一些实施例中，该狼益生菌第一分离株是短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02或其突变株；并且其中该狼益生菌第二分离株是屎肠球菌菌株WF-3IDAC入藏号181218-03或其突变株。
在一些实施例中，该至少一种犬益生菌分离株包括乳酪杆菌属物种和粘液乳杆菌属物种。
在一些实施例中，该至少一种犬益生菌菌株包括干酪乳酪杆菌和发酵粘液乳杆菌。
在一些实施例中，该至少一种犬益生菌分离株包括：干酪乳酪杆菌菌株K9-1 IDAC入藏号210415-01或其突变株；和发酵粘液乳杆菌菌株K9-2 IDAC入藏号210415-02或其突变株。
在一些实施例中，该组合物包括：短促生乳杆菌菌株WF-1B IDAC入藏号051120-02；屎肠球菌菌株WF-3IDAC入藏号181218-03；干酪乳酪杆菌菌株K9-1 IDAC入藏号210415-01；发酵粘液乳杆菌菌株K9-2 IDAC入藏号210415-02；麦芽糖糊精、腐植酸和富里酸中的至少一种。
另一方面，提供了一种根据权利要求1至10中任一项的组合物用于治疗受试者的炎性肠病(IBD)和/或肠易激综合征(IBS)的用途。
另一方面，提供了一种用于治疗受试者的IBD和/或IBS的方法，其包括向该受试者施用根据权利要求1至10中任一项的组合物。
在一些实施例中，该受试者是家养狗。
在一些实施例中，该组合物口服施用。
另一方面，提供了一种试剂盒，其包括容器中的根据权利要求1至10中任一项的组合物和用于施用该组合物以治疗IBD和/或IBS的说明。
另一方面，提供了一种用于制备用于治疗IBD和/或IBS的组合物的方法，其包括：提供狼益生菌第一分离株，其中该狼益生菌第一分离株是乳杆菌科的物种；提供狼益生菌第二分离株，其中该狼益生菌第二分离株是肠球菌科的物种；提供至少一种犬益生菌分离株，其中该至少一种犬益生菌分离株包括乳杆菌科的至少一个物种；和组合该狼益生菌第一和第二分离株和该至少一种犬益生菌菌株。
在一些实施例中，该方法进一步包括提供至少一种益生元，并将该至少一种益生元与该狼益生菌第一和第二分离株和该至少一种犬益生菌分离株组合。
另一方面，提供了一种短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02。
另一方面，提供了一种组合物，其包括短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02或其突变株和至少一种附加成分。
另一方面，提供了一种短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02或其突变株在制备用于治疗或预防受试者的肠道生态失调的药物方面的用途。
另一方面，提供了一种用于治疗或预防受试者的肠道生态失调的方法，其包括向受试者施用短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02或其突变株。
对于本领域通常技术人员来说，本公开的其它方面和特征将在回顾本公开的具体实施例的以下描述时变得显而易见。
附图说明
现在将参考附图更详细地描述公开的某些方面。在附图中：
图1A示出了罗伊氏粘液乳杆菌WF-1的16S rDNA序列(SEQ.ID NO:1)；图1B示出了动物联合乳杆菌WF-2的16S rDNA序列(SEQ.ID NO:2)；图1C示出了屎肠球菌WF-3的16SrDNA序列(SEQ.ID NO:3)；图1D示出了植物乳植杆菌WF-4的16SrDNA序列(SEQ.ID NO:4)；图1E示出了短促生乳杆菌WF-5的16S rDNA序列(SEQ.ID NO:5)；图1F示出了弯曲广布乳杆菌WF-6的16S rDNA序列(SEQ.ID NO:6)；图1G示出了罗伊氏粘液乳杆菌WF-7的16S rDNA序列(SEQ.ID NO:7)；
图2示出了短促生乳杆菌WF-1B的16S rDNA序列(SEQ.ID NO:10)；
图3A示出了干酪乳酪杆菌K9-1的16S rDNA序列(SEQ.ID NO:8)；图3B示出了发酵粘液乳杆菌K9-2的16S rDNA序列(SEQ.ID NO:9)；
图4是根据一些实施例的用于制备组合物的方法的流程图；
图5是革兰氏染色结果的照片，其示出了短促生乳杆菌WF-1B的细菌形态；
图6是示出了短促生乳杆菌WF-1B的自动聚集结果的图；
图7是示出了短促生乳杆菌WF-1B的细胞表面疏水性测定结果的图；
图8是示出了短促生乳杆菌WF-1B的低pH耐受性测定结果的图；
图9是示出了短促生乳杆菌WF-1B的胆盐耐受性测定结果的图；
图10是示出了短促生乳杆菌WF-1B的胃消化酶(3.2mg/mL胃蛋白酶)耐受性测定结果的图；
图11是示出了短促生乳杆菌WF-1B的肠道消化酶(10mg/mL胰酶)耐受性测定结果的图；
图12是示出了短促生乳杆菌WF-1B的细胞结合测定结果的图；
图13是一组图，其示出了在第-1天(治疗前)和第19天(治疗期间)从对照组(用安慰剂饲喂的狗；黑柱)和测试组(用益生素饲喂的狗；白柱)收集的粪便样本中的特定细菌组/物种的相对丰度(图A＝总细菌；图B＝乳杆菌属某些种；图C＝肠球菌属某些种；图D＝干酪乳酪杆菌；图E＝发酵粘液乳杆菌；图F＝短促生乳杆菌；图G＝屎肠球菌)；竖柱表示平均值±SEM；星号(*)指示两组数据具有统计显著性(P<0.10)；没有通用上标的任何两组数据都指示它们存在统计显著差异(P<0.05)；
图14是示出了在第-1天和第19天从对照组(黑柱)和测试组(白柱)收集的粪便样本中存在的总短链脂肪酸(SCFA)的量化的图(竖柱表示平均值±SEM)；并且
图15是示出了在第-1天(白柱)和第19天(灰柱)从对照组(图A和B)和测试组(图C和D)收集的粪便样本中存在的SCFA的量化的图(竖柱表示平均值±SEM)。
具体实施方式
总体上，本公开提供了一种组合物，其包括至少一种狼(Canis lupus)益生菌分离株和至少一种犬(家犬(C.l.familiaris))益生菌分离株。在一些实施例中，该组合物进一步包括至少一种益生元。还提供了一种用于制备组合物的相关方法和一种用于治疗受试者中的IBS和/或IBD的方法。
该组合物可以是合生元组合物。如本文使用，“合生元”是指包括至少一种益生素组分和至少一种益生元组分的组合物。如本文使用，“益生素”是指对宿主生物体具有至少一种有益作用的微生物细胞培养物或制剂。对宿主生物体的有益作用可以包含例如对宿主的消化系统、免疫系统和脑-肠-微生物组系统中的至少一个的有益作用。如本文使用，“益生元”是指支持至少一种有益微生物的生长和/或活性的物质。
如本文使用，“分离”或“分离物”，当用于指细菌菌株时，是指已经从其自然环境中分离出来的细菌。在一些实施例中，分离株或分离物是特定细菌菌株的生物纯培养物。如本文使用，“生物纯”是指基本上不含其它生物菌株的培养物。
该组合物可以包括至少一种狼益生菌分离株。如本文使用，“狼益生菌”是指从狼身上分离出的具有益生素活性的细菌。如本文使用，“狼”是指狼种的动物，包含任何已知的亚种，但家犬除外。狼也可以被称为灰狼、苍狼、森林狼或苔原狼。在一些实施例中，狼是自由放养的狼。在一些实施例中，狼是原产于加拿大萨斯喀彻温省阿尔伯特王子国家公园的自由放养的狼。
每种狼益生菌分离株可以是原产于狼的胃肠道的胃肠道细菌分离株。在一些实施例中，分离株是从狼粪便中分离出来的。在其它实施例中，每种分离株可以通过任何其它合适的手段从狼身上分离出来。
在一些实施例中，至少一种分离株是乳酸菌菌株。在一些实施例中，至少一种分离株是乳杆菌科的物种，包含但不限于粘液乳杆菌属、联合乳杆菌属、乳植杆菌属、促生乳杆菌属或广布乳杆菌属的物种或原乳杆菌属(也被称为“乳酸杆菌”)的任何其它物种。在一些实施例中，至少一种分离株是肠球菌科的物种，包含例如肠球菌属的物种。在其它实施例中，分离株是原产于狼胃肠道的任何其它属的胃肠道细菌。
在一些实施例中，至少一种狼益生菌分离株选自罗伊氏粘液乳杆菌(原罗伊氏乳杆菌)、动物联合乳杆菌(原动物乳杆菌)、屎肠球菌、植物乳植杆菌(原植物乳杆菌)、短促生乳杆菌(原短乳杆菌)和弯曲广布乳杆菌(原弯曲乳杆菌)。本领域技术人员将理解，当前和以前的名称指代相同的物种，并且实施例不限于任何一个特定术语。
在一些实施例中，至少一种分离株选自以下表1中列出的菌株，并在以W02020/037414公布的国际PCT(专利合作条约)专利申请PCT/CA2019/051140中公开，其通过引用并入本文。对于表1中的每种细菌菌株，每种分离物的生物纯原液根据布达佩斯条约于2018年12月18日存放在加拿大国际保藏局(IDAC)(1015Arlington Street,Winnipeg,Manitoba,Canada R3E 3R2)中。
表1
菌种 IDAC入藏号 16S rDNA序列 示出16S rDNA序列的附图
罗伊氏粘液乳杆菌WF-1 181218-01 SEQ.ID NO:1 图1A
动物联合乳杆菌WF-2 181218-02 SEQ.ID NO:2 图1B
屎肠球菌WF-3 181218-03 SEQ.ID NO:3 图1C
植物乳植杆菌WF-4 181218-04 SEQ.ID NO:4 图1D
短促生乳杆菌WF-5 181218-05 SEQ.ID NO:5 图1E
弯曲广布乳杆菌WF-6 181218-06 SEQ.ID NO:6 图1F
罗伊氏粘液乳杆菌WF-7 181218-07 SEQ.ID NO:7 图1G
在一些实施例中，16S核糖体DNA(rDNA)序列可以用于标识细菌的属和种。16SrDNA序列的测序可以使用PCT/CA2019/051140中描述的方法进行。表1中列出的分离株的部分16S rDNA序列在图1A至1G中示出。
在一些实施例中，分离株中的一种是短促生乳杆菌WF-1B，其从原产于加拿大萨斯喀彻温省阿尔伯特王子国家公园的自由放养的狼的粪便中分离出来。短促生乳杆菌WF-1B的生物纯原液根据布达佩斯条约于2020年11月5日存放在加拿大国际保藏局(IDAC)(1015Arlington Street,Winnipeg,Manitoba,Canada R3E 3R2)中，并分配了入藏号051120-02。短促生乳杆菌WF-1B的部分16S rDNA序列在图2中示出(SEQ.ID NO:10)。
如以下实例中所证明，短促生乳杆菌WF-1B的细菌对低pH和胆盐的存在表现出耐受性。该细菌还对至少一种胃和/或肠道消化酶的存在表现出耐受性。这些结果指示，短促生乳杆菌WF-1B能够在通过酸性犬胃和通过犬肠时存活。如本文使用，“存活”是指测试培养物的活细胞计数(以每mL集落形成单位(CFU)为单位测量)高于检测限[1.7log10(CFU/mL)或50CFU/mL]。
以下实例还表明，短促生乳杆菌WF-1B的细菌具有自动聚集能力和细胞表面疏水性，指示细菌细胞可以能够结合受试者的宿主肠上皮细胞以促进胃肠道的定植。还发现短促生乳杆菌WF-1B的细菌在体外结合犬上皮细胞。
短促生乳杆菌WF-1B的细菌也被证明可产生抑制物质，以抑制至少一种致病性或腐败微生物的生长。如下所讨论，发现WF-1B可抑制几种致病性或腐败微生物菌株，包含大肠杆菌、肠道沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌。
短促生乳杆菌WF-1B对庆大霉素、链霉素和红霉素敏感，但对氨苄青霉素、卡那霉素、克林霉素、四环素和氯霉素耐药。可能需要抗生素敏感性，以防止抗生素耐药基因转移到其它细菌，包含致病细菌。未观察到细菌生长的最低抗生素浓度被称为最小抑菌浓度(MIC)。在一些实施例中，短促生乳杆菌WF-1B具有针对至少一种抗生素的等于或低于欧洲食品安全局(EFSA)设定的MIC临界值的MIC值。全基因组序列分析表明，短促生乳杆菌WF-1B对氨苄青霉素、克林霉素、四环素和氯霉素的耐药性分为固有耐药或基因组突变引起的获得性耐药性。水平抗生素耐药性(AR)基因转移的风险较低。因此，在动物营养中使用短促生乳杆菌WF-1B作为饲料添加剂被认为是安全的。
在一些实施例中，短促生乳杆菌WF-1B表现出一种或多种其它期望的性质，并且这些性质仅不限于本文中描述的那些。
在一些实施例中，该组合物包括上述菌株中的一种的突变体。如本文使用，“突变体”或“突变株”是指与参考细菌菌株的16S rDNA序列具有至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性、至少99％同源性或至少99.5％同源性，但在细菌基因组中的一个或多个其它DNA序列中具有一个或多个DNA突变的细菌菌株。DNA突变可以包含碱基替换(包含转换和颠换)、缺失、插入以及任何其它类型的自然或诱导DNA修饰。
在一些实施例中，该组合物包括狼益生菌分离株的组合。在一些实施例中，该组合物包括第一狼益生菌分离株和狼益生菌第二分离株。在一些实施例中，第一分离株是乳杆菌科的的物种，并且第二分离株是肠球菌科的物种。
第一分离株可以包括例如粘液乳杆菌属、联合乳杆菌属、乳植杆菌属、促生乳杆菌属或广布乳杆菌属(或前乳杆菌属的任何其它物种)的分离株。在一些实施例中，第一分离株是促生乳杆菌属物种，例如短促生乳杆菌。在一些优选实施例中，第一分离株是短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02或其突变株。
第二分离株可以包括例如肠球菌属的分离株。在一些实施例中，第二分离株是屎肠球菌。在一些优选实施例中，第二分离株是屎肠球菌菌株WF-3IDAC入藏号181218-03或其突变株。
在一些实施例中，组合物可以进一步包括另外的狼益生菌分离株，例如第三、第四、第五分离株等。在其它实施例中，该组合物可以包括狼益生菌分离株的任何其它合适组合。
该组合物可以进一步包括至少一种犬益生菌分离株。如本文使用，“犬益生菌”或“狗益生菌”是指从狗身上分离出的具有益生素活性的细菌。如本文使用，“狗”或“家养狗”是指家犬亚种的动物。一些分类学权威也承认家养狗是一种独特的家犬。
每种犬益生菌分离株可以是原产于狗胃肠道的胃肠道细菌的分离株。在一些实施例中，分离株是从狗粪便中分离出来的。在其它实施例中，每种分离株可以通过任何其它合适的手段从狗身上分离出来。
在一些实施例中，至少一种犬益生菌分离株是乳酸菌菌株。在一些实施例中，至少一种分离株是乳杆菌科的物种，包含但不限于粘液乳杆菌属或乳酪杆菌属(或原乳杆菌属的任何其它物种)。在一些实施例中，至少一种分离株选自干酪乳酪杆菌(原干酪乳杆菌)或发酵粘液乳杆菌(原发酵乳杆菌)。在一些实施例中，至少一种分离株选自表2中列出的菌株，并在加拿大专利第2,890,965号中公开，其通过引用并入本文。对于表2中的每种细菌菌株，每种分离物的生物纯原液根据布达佩斯条约于2015年4月21日存放在加拿大国际保藏局(IDAC)(1015Arlington Street,Winnipeg,Manitoba,Canada R3E3R2)中。表2中的菌株的部分16S rDNA序列在图3A和3B中示出。
表2
菌种 IDAC入藏号 16S rDNA序列 示出16S rDNA序列的附图
干酪乳酪杆菌K9-1 210415-01 SEQ.ID NO:8 图2A
发酵粘液乳杆菌K9-2 210415-02 SEQ.ID NO:9 图2B
在一些实施例中，至少一种分离株是表2中列出的菌株中的一种的突变体。
该组合物可以包括犬益生菌分离株的组合。在一些实施例中，该组合物包括犬益生菌第一分离株和犬益生菌第二分离株。第一和第二菌株可以都是乳杆菌科的物种。在一些实施例中，第一分离株是乳酪杆菌属物种，例如干酪乳酪杆菌，并且第二分离株是粘液乳杆菌属物种，例如发酵粘液乳杆菌。在一些优选实施例中，该组合物包括干酪乳酪杆菌K9-1IDAC入藏号210415-01和发酵粘液乳杆菌菌株K9-2 IDAC入藏号210415-02。
在一些实施例中，该组合物可以进一步包括另外的犬益生菌分离株，例如第三、第四、第五分离株等。在其它实施例中，该组合物可以包括犬益生菌分离株的任何其它合适组合。
如以下实例中所证明，狼益生菌和犬益生菌分离株在口服施用于家养狗时通常耐受性良好。分离株也能够在通过犬胃肠道时存活。在一些实施例中，每种分离株对受试者具有一种或多种有益的生理作用，如下文更详细地描述。
在一些实施例中，狼益生菌和犬益生菌分离株可以是活形式。在一些实施例中，分离株可以是冻干(冷冻干燥)形式。在其它实施例中，分离株是液体悬浮液的形式。
在一些实施例中，该组合物是合生元组合物，其进一步包括至少一种益生元。在一些实施例中，该益生元包括多糖益生元。例如，该益生元可以包括麦芽糖糊精。在其它实施例中，该益生元包括至少一种腐植物质组分，包含腐植酸和/或富里酸。术语“腐植酸”和“富里酸”将被理解为分别包含腐植酸和富里酸的异相混合物以及其任何盐、酯或其它衍生物。腐植酸通常在碱性pH下是水溶性的，但在酸性条件下变得不易溶，而富里酸通常在所有pH值下都是水溶性的。
在一些实施例中，该组合物包括两种或更多种益生元的组合。例如，该组合物可以包括麦芽糊精和腐植酸和/或富里酸的组合。在其它实施例中，该组合物可以包括任何其它合适的益生元或益生元组合。该组合物的益生元组分可以是液体形式、粉末形式或任何一种合适的形式。
在一些实施例中，至少一种益生元可以支持组合物中的狼益生菌和/或犬益生菌的生长和/或活性。在一些实施例中，至少一种益生元可以对受试者具有一种或多种有益的生理作用，如下文更详细地描述。
作为一个具体实例，该组合物可以是合生元组合物，其包括：短促生乳杆菌WF-1BIDAC入藏号051120-02；屎肠球菌菌株WF-3IDAC入藏号181218-03；干酪乳酪杆菌菌株K9-1 IDAC入藏号210415-01；发酵粘液乳杆菌菌株K9-2 IDAC入藏号210415-02；和麦芽糖糊精、腐植酸和富里酸中的至少一种。
在一些实施例中，该组合物包括相等比例的每种分离株，例如通过细胞计数或光密度。在其它实施例中，该组合物可以包括任何其它合适比例的分离株。在一些实施例中，该组合物包括至少约1x107CFU/g的每种分离株。在一些实施例中，该组合物包括约1x107CFU/g至约1x1011CFU/g。
在一些实施例中，该组合物包括至少约1mg/mL益生元，或约1mg/mL至约20mg/mL益生元，或约5mg/mL至约15mg/mL益生元。在一些实施例中，该组合物包括大约10mg/mL麦芽糊精或大约10mg/mL腐植酸和/或富里酸。在其它实施例中，该组合物包括任何其它合适浓度的麦芽糖糊精、腐植酸和/或富里酸。
在一些实施例中，该组合物包括协同有效量的至少一种狼益生菌分离株；协同有效量的至少一种犬益生菌分离株；和/或协同有效量的至少一种益生元。如本文使用，“协同有效量”是指足以引起与该组合物中的至少一种其它组分的协同作用的一种组分的量。
该组合物可以是立即、快速、慢速、持续或延迟释放组合物或任何其它合适类型的组合物。
在一些实施例中，该组合物可以进一步包括至少一种药学上或营养上可接受的赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例包含填充剂、粘合剂、载体、稀释剂、稳定剂、润滑剂、助流剂、着色剂、调味剂、涂料、崩解剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂和任何其它药学上或营养上可接受的赋形剂。
在一些实施例中，该组合物可以进一步包括至少一种包封材料。合适的包封材料的非限制性实例包含多糖，例如藻酸盐、植物/微生物树胶、壳聚糖、淀粉、k-角叉菜胶、乙酸邻苯二甲酸纤维素；蛋白质，例如明胶或牛奶蛋白；脂肪；和任何其它合适的包封材料。分离株可以通过喷雾干燥、挤出、凝胶化、液滴挤出、乳化、冷冻干燥或任何其它合适的包封方法包封在包封材料中。分离株的细菌细胞的包封可以保护细胞并延长组合物的保质期。
在一些实施例中，该组合物可以进一步包括至少一种另外的药物或营养成分。另外的成分的非限制性实例包含：至少一种维生素、矿物质、纤维、脂肪酸、氨基酸或任何其它合适的药物或营养成分。
在一些实施例中，该组合物是可摄入组合物。如本文使用，“可摄入”是指可由受试者口服的物质。
在一些实施例中，该可摄入组合物是膳食补充剂的形式。膳食补充剂可以是粉末、胶囊、凝胶胶囊、微胶囊、珠子、片剂、咀嚼片、软糖、液体或任何其它合适形式的膳食补充剂的形式。
在一些实施例中，该可摄入组合物是食品的形式。在一些实施例中，该食品是适合伴侣动物，特别是家养狗的任何形式。在一些实施例中，该食品是固体食品。在一些实施例中，该固体食品可以是干的、湿的、半潮的、冷冻的、脱水的、冷冻干燥的或任何其它合适的形式。合适的固体食品的实例包含但不限于狗粮，例如粗磨物、饼干、咀嚼物、湿狗粮、包含生肉在内的生狗粮、冷冻干燥酸奶等。在一些实施例中，固体食品可以是狗零食的形式，包含例如冷冻干燥狗零食。
在一些实施例中，固体食品其中调配有该组合物。在其它实施例中，该组合物可以在生产后添加到固体食品中。
在一些实施例中，该可摄入组合物可以是用于固体食品的表面涂层的形式。在一些实施例中，该表面涂层包括允许细菌粘附在固体食品的表面的载体。该载体可以是例如食用油或任何其它合适的载体。作为一个实例，油基表面涂层可以在生产和冷却后应用于粗磨狗粮。
在其它实施例中，该可摄入组合物可以以适于洒在固体食品的表面上的粉末形式提供。在其它实施例中，该可摄入组合物可以以液体形式提供以喷到、浇到或滴到固体食品的表面上。
在其它实施例中，该食品是液体食品。液体食品的非限制性实例包含饮料、肉汤、油悬浮液、肉汁、基于牛奶的产品、液体或半固体酸奶等。
在一些实施例中，液体食品其中调配有该组合物。在其它实施例中，该组合物可以在生产后添加到液体食品中。在一些实施例中，该可摄入组合物可以以粉末形式提供，并且该粉末可以溶解在水、牛奶或任何其它合适的液体中以形成液体食品。在其它实施例中，该可摄入组合物可以以液体形式提供，并且可以与水、牛奶或任何其它合适的液体混合以形成液体食品。可替代地，该液体食品可以直接喷到、浇到或滴到受试者的嘴中。
在其它实施例中，该可摄入组合物可以是适合于由伴侣动物，特别是家养狗摄入的任何其它形式。在其它实施例中，该组合物可以是不可摄入的形式，例如栓剂的形式或任何其它合适的形式。
本文提供了一种用于用上述组合物治疗受试者的胃肠病症的方法。本文还提供了一种该组合物用于治疗受试者的胃肠病症的用途。如本文使用，“治疗”是指获得期望的药理学和/或生理学作用。该作用可以是在完全或部分预防健康状况或其症状方面具有预防性，和/或可以是在完全或部分改善健康状况的至少一种症状和/或可归因于健康状况的不良反应方面具有治疗性。为了更清楚起见，将理解，在这种情况下，术语“治疗”旨在包含为受试者提供任何有益的生理作用，并且其含义不限于预防或治愈特定的病症或健康状况。
在一些实施例中，该受试者是伴侣动物，包含但不限于家养狗。在一些实施例中，该狗是成年狗。在其它实施例中，该狗处于任何其它发育阶段。
在一些实施例中，该组合物可以用于治疗受试者的炎性肠病(IBD)和/或肠易激综合征(IBS)。如本文使用，“IBD”是指胃肠道的炎症病状，包含例如克罗恩病和溃疡性结肠炎。如本文使用，“IBS”是指受试者经历复发性或慢性胃肠道症状的功能性肠病。常见症状包含但不限于：腹泻、腹痛、胃肠通过时间加快和饮食偏好改变。在一些实施例中，该组合物可用于治疗IBD和/或IBS的一种或多种症状。在其它实施例中，该组合物可以用于治疗其它胃肠病症，包含例如其它功能性肠病症。
不受理论限制，据信，狼益生菌和狗益生菌分离株的组合以及益生元组分协同作用以诱导至少一种有益的生理作用，以改善与受试者的IBD和/或IBS相关的不适。
如IBD和IBS等胃肠病症与局部肠道炎症和肠道屏障完整性丧失有关。在一些实施例中，该组合物的有益生理作用包含对肠道紧密连接蛋白功能以及恢复或预防肠道组织的屏障干扰的积极作用。在一些实施例中，有益的生理作用还包含帮助维持肠道组织活力。该组合物还可以减少肠中的促炎性细胞因子(包含例如TNF-α)的表达。
此外，IBD和IBS还与肠道微生物群改变和短链脂肪酸(SCFA)水平降低有关，短链脂肪酸是由肠道细菌对纤维进行发酵而产生。SCFA是维持肠道稳态的重要代谢物。在一些实施例中，该组合物的有益生理作用包含对肠道微生物群的构成和/或SCFA的产生的积极作用，例如乙酸盐、丙酸盐和/或丁酸盐水平的增加。
在一些实施例中，该组合物提供一种或多种另外的有益生理作用，并且实施例不仅限于本文公开的益处。
在一些实施例中，狼和狗益生菌分离株和益生元组分都可以有助于一种或多种相同的有益生理作用。可替代地(或另外地)，狼益生菌、狗益生菌和/或益生元组分可以有助于一种或多种不同的有益生理作用。例如，如以下实例中所证明，四种狼和狗益生菌菌株的混合物表现出对肠道屏障完整性和肠道炎症的积极作用，而如麦芽糊精等益生元表现出比菌株本身更大的对肠道微生物群组成和SCFA产生的作用。因此，该组合物的益生素和益生元组分可以具有互补作用，以实现改善IBD和/或IBS症状的整体益处。
该组合物可以以有效量施用于受试者。如本文使用，“有效量”或“治疗有效量”是指能够有效预防、减少或消除症状或健康状况的组合物的量。
在一些优选实施例中，该组合物可口服施用于受试者。在其它实施例中，该组合物可肠内和/或直肠施用于受试者。在一些实施例中，该组合物可以以任何合适的间隔施用于受试者，包含例如每月至少一次、每周至少一次或每天至少一次。
在一些实施例中，有效量可以作为每天单剂量施用。在其它实施例中，有效量可以以在一天中适当间隔的两个或更多个亚剂量施用，或作为一天中的多个微剂量施用。尽管优选将分离株和益生元作为一个剂量一起施用，但本文的实施例也考虑了将该组合物的一种或多种组分分开施用。
除了在本文描述的组合物中使用外，短促生乳杆菌WF-1B可以单独用作益生素，以以类似于PCT/CA2019/051140中描述的个体菌株的方式改善或维持受试者的健康。在一些实施例中，短促生乳杆菌WF-1B可以用于治疗或预防受试者的肠道生态失调或治疗受试者的健康状况或病症。在一些实施例中，短促生乳杆菌WF-1B可以用于治疗或预防受试者的腹泻。在其它实施例中，短促生乳杆菌WF-1B可以用于向受试者提供任何其它健康益处。在一些实施例中，短促生乳杆菌WF-1B可以用于制备用于治疗或预防肠道生态失调、腹泻或任何其它合适的健康状况的药物。
在一些实施例中，短促生乳杆菌WF-1B可以作为包括细菌菌株和一种或多种附加成分的组合物的一部分施用。该附加成分可以包含以上针对多菌株组合物描述的任何成分。附加成分的非限制性实例包含一种或多种药学上或营养上可接受的赋形剂、包封材料、可食用成分和/或食品。该短促生乳杆菌WF-1B组合物可以是与上述组合物相同的任何形式，包含例如补充剂和食品。
本文还提供了一种用于制备用于向患有IBD或IBS的受试者施用的组合物的方法。该方法可以用于制备本文公开的组合物的实施例。
图4示出了根据一些实施例的用于制备组合物的示例性方法100的流程图。在框102处，提供至少一种狼益生菌分离株。在框104处，提供至少一种犬益生菌分离株。在这种情况下，术语“提供”可以是指制备(包含分离或培养)、接收、购买或以其它方式获得分离株。
狼益生菌和犬益生菌分离株可以是本文公开的任何菌株。在一些优选实施例中，狼益生菌分离株是短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02和屎肠球菌菌株WF-3IDAC入藏号181218-03；并且犬益生菌分离株是干酪乳酪杆菌菌株K9-1 IDAC入藏号210415-01和发酵粘液乳杆菌菌株K9-2 IDAC入藏号210415-02。
在框106处，将狼益生菌分离株与犬益生菌分离株组合。在这种情况下，术语“组合”是指混合、掺混分离株或以其它方式将分离株聚集在一起。
在一些实施例中，方法100进一步包括提供至少一种益生元。例如，该益生元可以包括麦芽糖糊精、腐植酸和/或富里酸。在一些实施例中，方法100进一步包括将益生元与狼和犬益生菌分离株组合。在一些实施例中，分离株和益生元同时组合在一起。在其它实施例中，分离株首先组合以形成混合物，并且混合物与益生元组合。
在一些实施例中，方法100进一步包括提供一种或多种附加成分，并将附加成分与分离株和益生元组合。附加成分的非限制性实例包含一种或多种药学上或营养上可接受的赋形剂、包封材料、可食用成分和/或食品。
本文还提供了一种试剂盒，其包括容器中的组合物和用于向患有IBD和/或IBS的受试者施用该组合物的说明。该组合物可以包括至少一种狼益生菌分离株和至少一种犬益生菌分离株。狼益生菌和犬益生菌分离株可以是本文公开的任何菌株。在一些优选实施例中，狼益生菌分离株是短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02和屎肠球菌菌株WF-3IDAC入藏号181218-03；并且犬益生菌分离株是干酪乳酪杆菌菌株K9-1 IDAC入藏号210415-01和发酵粘液乳杆菌菌株K9-2 IDAC入藏号210415-02。
该试剂盒中的分离株可以以冷冻干燥形式、液体形式或任何其它合适的形式提供。尽管分离株优选地组合在单个容器中，但也考虑了一种或多种菌株在分开的容器中提供并且试剂盒包含用于将菌株组合在一起的说明的实施例。
在一些实施例中，该组合物进一步包括至少一种益生元，包含例如麦芽糖糊精、腐植酸和/或富里酸。在一些实施例中，益生元与分离株组合在同一容器中。在其它实施例中，至少一种益生元可以提供在分开的容器中，并且该试剂盒可以包含用于将益生元与组合物的其余部分组合的说明。
用于施用该组合物的说明可以包括用于向如家养狗等伴侣动物施用组合物的说明。该说明可以包含施用该组合物的推荐剂量和频率，并且还可以包含该组合物是否可与食物、其它药物等一起服用的说明。
不受限于上述内容，通过以下实例进一步描述本组合物、用途和方法。
实例1—短促生乳杆菌WF-1B的分离和标识
于2017年3月23日，在加拿大萨斯喀彻温省阿尔伯特王子国家公园收集了自由放养的狼的粪便样本。使用PCT/CA2019/051140中描述的方法分离并标识了一种标记为WF-1B的新菌株。
使用标准方法进行革兰氏染色，并在OMAXTMLED 40x-2000x数字双目生物复式显微镜上使用100×镜头观察革兰氏染色细菌，并使用连接到显微镜的3.0MP USB相机获得照片。示出了分离株WF-1B的杆状细菌形态的革兰氏染色结果在图5中示出。
为了标识菌株的物种，编码16S核糖体DNA(rDNA)的部分基因通过PCR扩增，并通过桑格测序进行测序，如PCT/CA2019/051140中所描述。16S rDNA测序结果在图2中示出，并且分离株被标识为短促生乳杆菌。
为了在菌株水平上标识分离物，进行了全基因组测序(IlluminaTM测序)以获取有关菌株的更多详细信息。短促生乳杆菌WF-1B的全基因组测序的数据分析结果在以下表3中示出。
表3
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分离株短促生乳杆菌WF-1B的生物纯培养物的样本根据布达佩斯条约于2020年11月5日存放在加拿大国际保藏机构(IDAC)(1015Arlington Street,Winnipeg,Manitoba,Canada R3E 3R2)，并分配了入藏号051120-02。
实例2—短促生乳杆菌WF-1B的表征
使用PCT/CA2019/051140中描述的方法对短促生乳杆菌WF-1B的生物活性进行了表征，如下所概述。
实例2.1—自动聚集能力
为了评估分离物的自动聚集活性，进行了自动聚集测定。通过涡旋充分混合30mL完全生长的培养物。测量并记录600nm处的初始光密度(OD600，A0)。将剩余的细胞悬浮液在环境温度下保持静止且不受干扰5小时。每隔一小时取100μL上部悬浮液(细胞悬浮液未涡旋)以测量OD600nm(At)。自动聚集百分比表达为：
其中A0代表0小时的OD600，而At代表1小时、2小时、3小时、4小时或5小时的OD600。
短促生乳杆菌WF-1B的自动聚集率(百分比)在图6中示出。这些结果指示，分离物具有粘附在宿主肠上皮细胞表面的潜力。
实例2.2—细胞表面疏水性
为了评估短促生乳杆菌WF-1B的细菌细胞表面的疏水性，进行了微生物对碳氢化合物的粘附(MATH)测定(Otero等人,2004)以测量菌株在粘附方面的疏水性。通过以8,000rpm离心两分钟收获10mL完全生长的培养物，然后用盐水溶液洗涤细胞三次。用盐水溶液重悬细胞沉淀，并将每种细胞悬浮液的OD600调节至0.5±0.1。测量并记录每种细胞悬浮液的实际最终OD600。将3.6mL细胞悬浮液等分到玻璃试管中，然后将0.6mL溶剂(甲苯或二甲苯)等分到同一玻璃试管中并剧烈涡旋1分钟。将试管保持静止1小时，以使不混溶的溶剂和水相分离。用巴斯德移液管去除水层，测量并记录OD600(OD测试)。每种菌株的疏水性百分比按如下公式计算：
疏水性％＝(OD初始–OD测试)/OD初始
短促生乳杆菌WF-1B的疏水性百分比在图7中示出。这些结果指示，分离物具有粘附在宿主肠上皮细胞表面的潜力。
实例2.3—低pH和胆盐耐受性测定
为了评估短促生乳杆菌WF-1B对酸性条件的耐受性，将1％完全生长的培养物(10μL)传代培养到一组pH值不同(pH＝2.0、2.5、3.0和7.0)的1mL模拟胃液(SGF，不含胃蛋白酶)溶液中。通过用HCI和NaOH调节SGF的pH，随后过滤灭菌来制备不同pH值的SGF溶液。一旦将每种传代培养物接种到每种SGF溶液中后，通过涡旋将混合物充分混合，并立即将60μL每种混合物等分到96孔微量滴定板的第一列中进行稀释和铺板。将剩余的培养物立即在37℃下在气密条件下孵育6小时。在分别孵育2小时、4小时和6小时后，将60μL每种培养物等分到新的96孔微量滴定板的第一列中进行稀释和铺板。
为了评估分离株对胆盐的耐受性，将1％完全生长的培养物(10μL)传代培养到一组胆盐浓度不同(0％、3％和5％)的1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.2)中。通过将相对应量的胆盐溶解到无菌PBS中来制备不同胆盐浓度的PBS溶液。一旦将培养物接种到每种PBS溶液中后，通过涡旋将混合物充分混合，并立即将60μL每种混合物等分到96孔微量滴定板的第一列中进行稀释和铺板。将剩余的培养物立即在37℃下在气密条件下孵育24小时。在分别孵育6小时和24小时后，将60μL每种培养物等分到新的96孔微量滴定板的第一列中进行稀释和铺板。
制备每种培养物的连续10倍稀释液，并且将适当的稀释液铺在MRS琼脂平板上并在37℃下孵育2天。记录活细胞计数，并表达为至少三个独立重复的平均[log10(CFU/mL)]±标准误差。
短促生乳杆菌WF-1B的低pH和胆盐耐受性测定结果分别在图8和9中示出。低pH研究表明，WF-1B在pH 2的溶液中存活2小时，并且在pH 2.5和3.0的溶液中存活6小时。胆盐耐受性测定表明，WF-1B在3％和5％胆盐下存活24小时。
实例2.4—胃和肠道消化酶耐受性测定
为了评估短促生乳杆菌WF-1B对胃消化酶的耐受性，将1％完全生长的培养物(10μL)传代培养到一组pH值不同(pH＝2.0、2.5和3.0)的1mL SGF溶液(含3.2mg/mL胃蛋白酶)中。将培养物在37℃下在气密条件下孵育6小时。在分别孵育0小时、2小时、4小时和6小时后，将60μL每种培养物等分到96孔微量滴定板的第一列中进行稀释和铺板。
为了评估分离物对肠道消化酶的耐受性，将1％完全生长的培养物(10μL)传代培养到一组在pH＝6.8下含10mg/mL胰酶的1mL模拟肠液(SIF)溶液中。将培养物在37℃下在气密条件下孵育24小时。在分别孵育0小时、6小时和24小时后，将60μL每种培养物等分到96孔微量滴定板的第一列中进行稀释和铺板。
制备每种培养物的连续10倍稀释液，并且将适当的稀释液铺在MRS琼脂平板上并在37℃下孵育2天。记录活细胞计数，并表达为至少三个独立重复的平均[log10(CFU/mL)]±标准误差。
短促生乳杆菌WF-1B的胃消化酶和肠道消化酶耐受性测定结果分别在图10和11中示出。胃消化酶耐受性测定表明，WF-1B在pH 2.0下在SGF(含3.2mg/mL胃蛋白酶)中存活4小时，并且在pH 2.5和3.0下存活6小时。肠道消化酶耐受性测定表明，WF-1B在SIF(含10mg/mL胰酶)中存活24小时。
实例2.5—抑制物质的产生
为了评估短促生乳杆菌WF-1B产生针对一系列致病性和腐败微生物的任何抑制物质的能力，使分离物在一系列指示菌株存在的条件下生长。将1μL完全生长的培养物点在强化梭菌琼脂(RCA)平板上，并在37℃下孵育过夜。将十种指示菌株在37℃下在含0.6％酵母提取物(TSBYE)的胰蛋白酶大豆肉汤中培育过夜。将每种指示菌株(0.1％，6μL)接种到6mLRCA软琼脂(含0.75％琼脂)中，然后将混合物浇到点样RCA平板的顶部。将固化的琼脂平板在37℃下孵育过夜。测量并记录指示菌株的无明显生长的抑制区大小。
结果在表4中示出。在表4中：“是”指示分离物产生针对相对应指示菌株的抑制物质；“否”指示该菌株不产生针对相对应指示菌株的抑制物质；“MRSA”是指甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌；并且“VRE”是指万古霉素耐药性肠球菌。
表4
如表4中所示，WF-1B针对本研究中测试的所有10种指示菌株产生了抑制物质。
实例2.6—抗生素敏感性测定和序列分析
使用肉汤微量稀释确定短促生乳杆菌WF-1B分离株对八种常用临床抗生素的敏感性。肉汤微量稀释按照根据以下的方法进行：国际标准化组织，牛奶和乳制品—适用于双歧杆菌和非肠球菌乳酸菌(LAB)的抗生素最低抑菌浓度(MIC)的确定(ISO10932:2012)。抗生素原液按照根据以下的方法制备：CLSI，《抗菌剂敏感性测试的执行标准(PerformanceStandards for Antimicrobial Susceptibility Testing)》，第23版，CLSI标准M100，宾夕法尼亚州韦恩：临床和实验室标准协会；2013。
短促生乳杆菌WF-1B的抗生素敏感性测定的测量最小抑制浓度(MIC)和微生物临界值在以下表5中示出。
表5
如表5中所示，WF-1B对几种抗生素敏感，包含庆大霉素、链霉素和红霉素，这些抗生素的MIC低于欧洲食品安全局(EFSA)临界值。
为了研究耐药性的性质，首先在物种水平上总结了MIC分布。其次，通过与最新数据库列表进行比较，询问全基因组霰弹枪序列(重叠群或支架)是否存在编码或有助于对任何具有临床重要性的抗菌剂的耐药性的基因，这些数据库包含综合抗生素耐药性数据库(CARD)、抗生素耐药基因注释数据库(ARG-ANNOT)、ReFinder 4.1和使用子系统技术的快速注释(RAST)。
短促生乳杆菌WF-1B对庆大霉素、链霉素和红霉素敏感，但对氨苄青霉素、卡那霉素、克林霉素、四环素和氯霉素耐药。氨苄青霉素、卡那霉素、克林霉素和氯霉素针对短促生乳杆菌WF-1B的MIC落在短促生乳杆菌物种水平上的MIC分布范围内，这指示这些耐药性可能属于固有或自然耐药性。四环素针对短促生乳杆菌WF-1B的MIC落在短促生乳杆菌物种水平上的MIC分布范围外，这指示短促生乳杆菌WF-1B的四环素耐药性属于获得性耐药性。
通过进行RGI(耐药基因标识符)分析来与数据库CARD进行比较，通过搜索获得性抗菌剂耐药基因来与ResFinder 4.1进行比较，并通过进行blast来与ARG-ANNOT进行比较，没有发现短促生乳杆菌WF-1B的命中。
此外，通过搜索RAST输出的子系统特征计数来注释毒力因子、抗生素耐药性和转座元件，以查找毒力、疾病和防御子系统以及噬菌体、转座元件和质粒子系统中标识的那些因子。在短促生乳杆菌WF-1B中未标识出毒力因子或致病性岛。在短促生乳杆菌WF-1B中标识的抗生素耐药性(AR)决定簇包含翻译延伸因子G、核糖体保护型四环素耐药相关蛋白(第2组)、DNA回旋酶亚基A和B、多药外排泵操纵子的转录调节因子、TetR(AcrR)家族、多抗菌挤出蛋白(Na(+)/药物反向转运蛋白)和MDR外排泵的MATE家族。
因此，由于存在核糖体保护型四环素耐药相关蛋白(第2组)、翻译延伸因子G和多药耐药外排泵(这些都存在于短促生乳杆菌WF-1B的染色体上，而不是质粒上)，因此短促生乳杆菌WF-1B对以上列出的抗生素具有耐药性。此外，通过与类似生物体进行比较来表征以上列出的基因侧翼的上游和下游序列，并且没有标识出移动的遗传元件。此外，在短促生乳杆菌WF-1B中未标识出转座元件和基因转移剂。因此，耐药性分为固有耐药性或基因组突变引起的获得性耐药性。水平AR基因转移的风险很低。因此，在动物营养中使用短促生乳杆菌WF-1B作为饲料添加剂被认为是安全的。
实例2.7—细胞结合测定
为了评估短促生乳杆菌WF-1B分离株的体外粘附能力，在本研究中使用了两个犬细胞系MDCK和DH82。在组织培养瓶中用完全培养基从液氮罐中储存的冷冻原液复苏家犬ATCC CCL-34(MDCK(NBL-2))和家犬ATCC CRL-10389(DH82)。本研究中用于细胞系培育的基础培养基是具有高葡萄糖水平、谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基；GibcoTM)。完全培养基由DMEM和10％热灭活(56℃，30分钟)胎牛血清(FBS；GibcoTM)构成。生长条件为37℃及5％CO2。用于细胞分散的溶液为含0.53mM EDTA(乙二胺四乙酸)的0.25％(w/v)胰蛋白酶。在汇合后将细胞系培养物维持两周，以便在粘附测定之前进行完全分化。使用血细胞计进行细胞计数。
通过以3,500g离心10分钟收获5mL完全生长的培养物来制备细菌细胞悬浮液，然后用PBS(pH＝7.4)洗涤细胞三次。将细胞沉淀重悬于基础培养基DMEM中，并且将WF-1B分离株的OD600nm调节至1.0左右并将对照菌株肠道沙门氏菌ATCC 13311的OD600nm调节至0.1左右，这对应于WF-1B分离株的约5x108CFU/mL和对照菌株的约1x108CFU/mL。
MDCK和DH82细胞的细胞单层在12孔组织培养板中制备。以每孔4x104个细胞的浓度接种细胞以获得汇合并使其分化。培养基每两天更换一次。一旦细胞汇合，去除完全培养基，然后用PBS洗涤细胞三次。向每个孔中加入1mL基础培养基DMEM，并在粘附测定前在37℃及5％CO2下孵育1小时。
向汇合的单层细胞中加入细菌细胞悬浮液的1mL等分试样，并在37℃及5％CO2气氛下孵育2小时。向一个孔中加入1mL基础培养基DMEM作为无菌对照。在两小时后，用PBS洗涤单层细胞三次。向每个孔中加入250μL胰蛋白酶-EDTA溶液直至细胞层分散，然后加入1.75mL完全培养基并通过移液吸出细胞。
制备每种培养物的连续10倍稀释液，并且将适当的稀释液铺在MRS琼脂平板上并在37℃下孵育2天。记录活细胞计数，并表达为至少三个独立重复的平均[log10(CFU/mL)]±标准误差。细胞结合率计算为与细胞系结合的活细胞计数除以接种到细胞系的细菌细胞悬浮液的原始CFU。
细胞结合测定的结果在图12中示出。细胞结合测定结果表明，短促生乳杆菌WF-1B表现出较高的细胞表面结合能力。
实例3—狼和犬分离株和益生元的生物学作用
实例3.1—狗饲喂试验
三项独立的狗饲喂试验(一项在加拿大进行，两项在爱尔兰共和国进行)表明，当每天口服施用一次并持续28天时，含有四种乳酸菌菌株(干酪乳酪杆菌K9-1、发酵粘液乳杆菌K9-2、短促生乳杆菌WF-1B和屎肠球菌WF-3)的组合物在健康比格犬中耐受性良好。
此外，通过PMA-qPCR(叠氮溴化丙锭-定量聚合酶链反应)技术从狗饲喂试验中收集的粪便样本中的活细胞计数表明，所有四种益生菌株(干酪乳酪杆菌K9-1、发酵粘液乳杆菌K9-2、短促生乳杆菌WF-1B和屎肠球菌WF-3)在通过狗胃肠道时成功地存活。
通过qPCR确定该组合物对健康狗中的特定细菌物种(包含干酪乳酪杆菌、发酵粘液乳杆菌、短促生乳杆菌和屎肠球菌)的丰度的作用，并且结果在图13中示出。在图13中，竖柱表示平均值±SEM，并且数据分析表明，在对照组(用安慰剂饲喂的狗)和测试组(用K-9Heritage Probiotic饲喂的狗)之间或从同一测试组收集的第-1天(治疗前)和D19(治疗第19天)样本之间，没有观察到细菌(乳杆菌属某些种、干酪乳酪杆菌、发酵粘液乳杆菌和短促生乳杆菌)总数的统计显著差异。D19从测试组收集的粪便样本中存在的肠球菌属某些种的数量显著高于第-1天从测试组所收集(P<0.05)和D19从对照组所收集(P<0.10)。D19从测试组收集的粪便样本中存在的屎肠球菌的数量显著高于第-1天从对照组和测试组所收集(P<0.05)和D19从对照组所收集(P<0.05)。
还确定了该组合物对健康狗中的短链脂肪酸(SCFA)(包含乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸)的产生的作用。结果在图14和15中示出。数据分析表明，第-1天从对照组和测试组收集的粪便样本中存在的SCFA(包含乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸)总量为约200μmol/g粪便。第19天从对照组和测试组收集的粪便样本中存在的SCFA总量分别显著增加到约1,200μmol/g粪便和约1,000μmol/g粪便。总体而言，在对照组和测试组之间，在第-1天或第19天收集的粪便样本中存在的SCFA总量或个体SCFA方面均未观察到显著差异。然而，从对照组或测试组收集的粪便样本中存在的总SCFA或个体SCFA(戊酸除外)的数量从第-1天到第19天急剧增加。
实例3.2—体外胃肠道模型
在被称为TIM-1的模拟犬病的动态体外胃肠道模型中模拟干酪乳酪杆菌K9-1、发酵粘液乳杆菌K9-2、短促生乳杆菌WF-1B和屎肠球菌WF-3在通过犬胃和小肠期间的存活。TIM-1系统由荷兰的TNO(荷兰应用科学研究组织)开发，其是一种模拟胃肠道内的生理过程和条件的计算机控制模型。TIM-1系统由几个区室组成，这些区室通过调节GI通过的阀相互连接。
将以冻干粉末形式与干犬日粮(粗磨物)混合的四种菌株送入TIM-1系统，并通过PMA-qPCR技术在回肠流出物中确定活细胞当量。结果表明：干酪乳酪杆菌K9-1通过TIM-1后的存活率为95.6±4.0％，发酵粘液乳杆菌K9-2的存活率为2.9±1.4％，短促生乳杆菌WF-1B的存活率为317±15％，并且屎肠球菌WF-3的存活率为255±120％。这些数据表明，这些菌株能够在通过犬GI道时存活并到达大肠。
实例3.3—体外肠组织模型
在体外肠道模型(荷兰TNO的InTESTineTM平台)中，通过将来自健康狗的一段结肠组织安装在平台中研究了干酪乳酪杆菌K9-1、发酵粘液乳杆菌K9-2、短促生乳杆菌WF-1B和屎肠球菌WF-3对狗肠道组织的肠道上皮屏障功能和抗炎反应的作用。肠道沙门氏菌菌株用作促炎剂，并且细胞松弛素D用作肠道屏障功能干扰剂。
肠道沙门氏菌的接种显著破坏了结肠组织的屏障功能，其对紧密连接功能有特异性作用。当在接种肠道沙门氏菌前30分钟接种四种益生菌株(干酪乳酪杆菌K9-1、发酵粘液乳杆菌K9-2、短促生乳杆菌WF-1B和屎肠球菌WF-3)的混合物时，甘露醇(一种细胞旁转运指示剂)的增加的细胞旁转运减少了10-15％，指示这些益生菌株对肠道紧密连接蛋白功能以及恢复或预防肠道组织的屏障干扰有积极作用。
对于所有孵育，累积乳酸脱氢酶(LDH，一种细胞毒性指示剂)向顶端和基底侧区室中的泄漏较低，指示在6小时孵育期间的肠道组织活力适当。添加四种益生菌株(干酪乳酪杆菌K9-1、发酵粘液乳杆菌K9-2、短促生乳杆菌WF-1B和屎肠球菌WF-3)的混合物的所有孵育均表现出LDH释放减少，指示这些益生菌株对维持肠道组织活力有积极作用。这种积极作用主要是由于LDH向顶端区室的分泌减少了3至4倍。
通过qPCR确定结肠组织中的IL-4、IL-6、IL-12α、IL-12β、IFN-γ、和TNF-α和GAPDH的基因表达。在与肠道沙门氏菌一起进行的孵育中观察到IL-6、IL-12β、IFN-γ和TNF-α表达增加的趋势。有趣的是，当在接种肠道沙门氏菌前30分钟接种四种益生菌株(干酪乳酪杆菌K9-1、发酵粘液乳杆菌K9-2、短促生乳杆菌WF-1B和屎肠球菌WF-3)的混合物时，这些细胞因子基因的表达增加略有减少。特别地，TNF-α的表达显著减少。这些结果表明，四种益生菌株的混合物对减少肠道沙门氏菌引起的肠道炎性反应具有积极作用。
实例3.4—体外肠道微生物群模型
在体外肠道模型(荷兰TNO的i-screenTM平台)中确定益生菌株和益生元对犬结肠中的短链脂肪酸(SCFA)的产生和微生物群组成的变化的作用。使用六只健康犬捐赠的粪便材料来制备i-screen的基本接种物。将添加或不添加腐植酸和富里酸或麦芽糊精的混合物的单一益生菌株或多种益生菌株的混合物接种到i-screen孵育系统的96个孔中的一个孔中。通过气相色谱法(GC)定量SCFA的产生，并在孵育24小时后通过V4高变区的16S rDNA基因扩增子测序确定粪便微生物群的组成。
数据分析表明，麦芽糊精以及较小程度上的腐植酸和富里酸的存在支持了丙酸盐的产生，而代价是乙酸盐。麦芽糊精也产生了高产量的丁酸盐。除屎肠球菌WF-3外的益生菌株对SCFA产量造成的改变较小，并且水平与对照条件(仅微生物群)更类似。然而，与其它暴露条件相比，初始计数为107CFU/mL的屎肠球菌WF-3的单独存在或其与短促生乳杆菌WF-1B或弯曲广布乳杆菌WF-6的联合存在支持更高的乙酸盐产量。
在38℃下孵育24小时后，微生物群中乳杆菌和肠球菌的相对丰度发生变化。具体地，乳杆菌菌株似乎没有在i-screen中以高相对丰度定植在犬肠道微生物群中，相反，它们在孵育24小时后在微生物群中保持边际百分比。另一方面，与乳杆菌相比，屎肠球菌在i-screen中以更高的水平存在于犬肠道微生物群中。益生元麦芽糊精强烈影响了微生物群组成，而腐植酸和富里酸的混合物在较小程度上影响了微生物群组成。麦芽糖糊精，特别是在浓度为10mg/mL时，支持普雷沃氏菌属、巨单胞菌属、考拉杆菌属、琥珀酸弧菌属和狭义梭菌属的增加。这在以梭菌属XI、梭杆菌属、拟杆菌属、副萨特氏菌属、未分类的毛螺菌科和多尔氏菌属为代价时发生。
实例4—先前的使用腐植酸和/或富里酸的动物饲喂试验的总结
其它研究人员进行的使用腐植酸和/或富里酸的动物饲喂试验表明，腐植酸和富里酸提供许多不同的有益作用，包含：维持或调节肠道微生物群；抑制不良肠道微生物的生长，但刺激所需肠道微生物的生长；减少霉菌生长和毒素产生；增强免疫效力；改善肠道健康；改善养分消化率和利用率；作为生长促进剂；改善生产性能；降低血脂和胆固醇；并增加抗氧化能力。(Islam等人,2005；Kuhnert等人,2015；van Rensburg,2015；Kaevska等人,2016；Arif等人,2019；Visscher等人,2019；Mudronova等人,2020)。
尽管已经示出并描述了具体实施例，但本领域技术人员将了解，可以在不脱离本公开的范围的情况下进行各种变化和修改。前述说明书中使用的术语和表达已在本文中用作描述而非限制性术语，并且此类术语和表达的使用无意排除所示出和描述特征或其部分的等同物。此外，在解释本公开时，所有术语都应以符合上下文的最广泛方式解释。特别地，术语“包括”应被解释为以非排他性方式指代元素、组分或步骤，即指示所引用的元素、组分或步骤可以与未明确引用的其它元素、组分或步骤一起存在、利用或组合。
参考文献
以下参考文献由此通过引用整体并入：
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序列表
<110> 加拿大生物芯公司（CanBiocin Inc.）
<120> 用于支持患有胃肠病症的伴侣动物的组合物和相关方法
<130> 56015-126
<150> 美国临时案第63/045,283号
<151> 2020-06-29
<160> 10
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 767
<212> DNA
<213> 罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）
<220>
<221> misc_feature
<222> (456)..(456)
<223> n为a、t、g或c
<220>
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<213> 屎肠球菌（Enterococcus faecium）
<220>
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<213> 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）
<220>
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<220>
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gatgcacttc ttcggttgag ccgaangctt tcacatcaga cttaaaaaac cgcctgcgct 180
cgctttacgc ccaataaatc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg 240
cacgtagtta gccgtggctt tctggttaaa taccgtcaat acctgaacag ttactctcag 300
atatgttctt ctttaacaac agagttttac gagccgaaac ccttcttcac tcacgcggcg 360
ttgctccatc agactttcgt ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt 420
ttgggccgtg tctcagtccc aatgtggccg attaccctct caggtcggct acgtatcatt 480
gccatggtga gccgttaccc caccatctag ctaatacgcc gcgggaccat ccaaaagtga 540
tagccgaagc catctttcaa nctcggacca tgcggtccaa gttgttatgc ggtattagca 600
tctgtttcca ggtgttatcc cccgcttctg ggcaggtttc ccacgtgtta ctcaccagtt 660
cgccactcac tcaaatgtaa atcatgatgc aagcaccaat caataccaga gttcgttcga 720
cttgcatgta ttangcacgc cgccagcgtt cgtcctgagc 760
<210> 5
<211> 739
<212> DNA
<213> 短乳杆菌（Lactobacillus brevis）
<220>
<221> misc_feature
<222> (560)..(560)
<223> n为a、t、g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (715)..(715)
<223> n为a、t、g或c
<400> 5
acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg cattccaccg ctacacatgg 60
agttccactg tcctcttctg cactcaagtc tcccagtttc cgatgcactt ctccggttaa 120
gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg cccaataaat 180
ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct 240
ttctggttaa ataccgtcaa cccttgaaca gttactctca aaggtgttct tctttaacaa 300
cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggc attgctccat cagactttcg 360
tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt gtctcagtcc 420
caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc tacgtatcat cgtcttggtg ggcctttacc 480
tcaccaacta actaatacgc cgcgggatca tccagaagtg atagccgaag ccacctttca 540
aacaaaatcc atgcggattn tgttgttata cggtattagc acctgtttcc aagtgttatc 600
ccctgcttct gggcagattt cccacgtgtt actcaccagt tcgccactcg cttcattgtt 660
gaaatcagtg caagcacgtc attcaacgga agctcgttcg acttgcatgt attangcatg 720
ccgccagcgt tcgtcctga 739
<210> 6
<211> 765
<212> DNA
<213> 弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）
<220>
<221> misc_feature
<222> (737)..(737)
<223> n为a、t、g或c
<400> 6
gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca 60
tttcaccgct acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc ccagtttccg 120
atgcacttct tcggttgagc cgaaggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgctc 180
gctttacgcc caataaatcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc 240
acgtagttag ccgtggcttt ctggttggat accgtcacta cctgatcagt tactatcaaa 300
tacgttcttc tccaacaaca gagttttacg atccgaaaac cttcttcact cacgcggcgt 360
tgctccatca gactttcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc 420
tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga ttaccctctc aggtcggcta tgcatcacgg 480
tcttggtgag cctttacctc accaactaac taatgcaccg cgggtccatc ctaaagtgat 540
agccgaaacc atctttcaac cttgcaccat gcggtgctag gttttatgcg gtattagcat 600
ctgtttccaa atgttatccc ccactttagg gcaggttacc cacgtgttac tcacccgtcc 660
gccactcact caaatgttat caatcagaag caagcttctt caatctaacg agagtgcgtt 720
cgacttgcat gtattangca cgccgccagc gttcgtcctg agcca 765
<210> 7
<211> 767
<212> DNA
<213> 罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）
<220>
<221> misc_feature
<222> (166)..(166)
<223> n为a、t、g或c
<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (728)..(728)
<223> n为a、t、g或c
<400> 7
agcgtcagtt gcagaccaga cagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc 60
attccaccgc tacacatgga gttccactgt cctcttctgc actcaagtcg cccggtttcc 120
gatgcacttc ttcggttaag ccgaaggctt tcacatcaga cctaancaac cgcctgcgct 180
cgctttacgc ccaataaatc cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg 240
cacgtagtta gccgtgactt tctggttgga taccgtcact gcgtgaacag ttactctcac 300
gcacgttctt ctccaacaac agagctttac gagccgaaac ccttcttcac tcacgcggtg 360
ttgctccatc aggcttgcgc ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt 420
atggaccgtg tctcagttcc attgtggccg atcagnctct caactcggct atgcatcatc 480
gccttggtaa gccgttacct taccaactag ctaatgcacc gcaggtccat cccagagtga 540
tagccaaagc catctttcaa ncaaaagcca tgtggctttt gttgttatgc ggtattagca 600
tctgtttcca aatgttatcc cccgctccgg ggcangttac ctacgtgtta ctcacccgtc 660
cgccactcac tggtgatcca tcgtcaatca ggtgcaagca ccatcaatca gttgggccag 720
tgcgtacnac ttgcatgtat taggcacacc gccggcgttc atcctga 767
<210> 8
<211> 750
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n为a、t、g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
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<220>
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<222> (37)..(37)
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<220>
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<222> (687)..(687)
<223> n为a、t、g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (717)..(717)
<223> n为a、t、g或c
<400> 8
agttttggtc gatgaacggt gcttgcactg ngantcnact taaaacgagt ggcggacggg 60
tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag tgggggataa catttggaaa cagatgctaa 120
taccgcataa atccaagaac cgcatggttc ttggctgaaa gatggcgyaa gctatcgctt 180
ttggatggac ccgcggcgta ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgatgat 240
acgtagccga actgagaggt tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 300
acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc 360
gtgagtgaag aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaat ggtcggcaga 420
gtaactgttg tcggcgtgac ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca 540
ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc tcggcttaac cgaggaagcg catcggaaac 600
tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag 660
atatatggaa gaacaccagt ggcgaangcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgangct 720
cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat 750
<210> 9
<211> 754
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n为a、t、g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (235)..(235)
<223> n为a、t、g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (701)..(701)
<223> n为a、t、g或c
<400> 9
tcgacgcgtt ggcccaattg attganggtg cttgcacctg attgattttg gtcgccaacg 60
agtggcggac gggtgagtaa cacgtaggta acctgcccag aagcggggga caacatttgg 120
aaacagatgc taataccgca taacaacgtt gttcgcatga acaacgctta aaagatggct 180
tctcgctatc acttctggat ggacctgcgg tgcattagct tgttggtggg gtaanggcct 240
accaaggcga tgatgcatag ccgagttgag agactgatcg gccacaatgg gactgagaca 300
cggcccatac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatgggc gcaagcctga 360
tggagcaaca ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt aaagctctgt tgttaaagaa 420
gaacacgtat gagagtaact gttcatacgt tgacggtatt taaccagaaa gtcacggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga tttattgggc 540
gtaaagagag tgcaggcggt tttctaagtc tgatgtgaaa gccttcggct taaccggaga 600
agtgcatcgg aaactggata acttgagtgc agaagagggt agtggaactc catgtgtagc 660
ggtggaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ngcggctacc tggtctgcaa 720
ctgacgctga gactcgaaag catgggtagc gaac 754
<210> 10
<211> 840
<212> DNA
<213> 短乳杆菌（Lactobacillus brevis）
<400> 10
aaccggagaa gtgcatcgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc 60
atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct 120
agtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg 180
tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc 240
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 300
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac 360
cttaccaggt cttgacatct tctgccaatc ttagagataa gacgttccct tcggggacag 420
aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 480
caacgagcgc aacccttatt atcagttgcc agcattcagt tgggcactct ggtgagactg 540
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 600
ggctacacac gtgctacaat ggacggtaca acgagtcgcg aagtcgtgag gctaagctaa 660
tctcttaaag ccgttctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagttggaa 720
tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 780
gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc caaagccggt gagataacct tcgggagtca 840
PCT/RO/134表

Claims (22)

1.一种组合物，其包括：
狼益生菌第一分离株，其中所述狼益生菌第一分离株是乳杆菌科的物种；
狼益生菌第二分离株，其中所述狼益生菌第二分离株是肠球菌科的物种；和
至少一种犬益生菌分离株，其中所述至少一种犬益生菌分离株包括乳杆菌科的至少一个物种。
2.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包括至少一种益生元。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述至少一种益生元包括麦芽糖糊精、腐植酸和富里酸中的至少一种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述狼益生菌第一分离株是促生乳杆菌属物种，并且所述狼益生菌第二分离株是肠球菌属物种。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述狼益生菌第一分离株是短促生乳杆菌，并且所述狼益生菌第二分离株是屎肠球菌。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述狼益生菌第一分离株是短促生乳杆菌WF-1BIDAC入藏号051120-02或其突变株；并且其中所述狼益生菌第二分离株是屎肠球菌菌株WF-3IDAC入藏号181218-03或其突变株。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述至少一种犬益生菌分离株包括乳酪杆菌属物种和粘液乳杆菌属物种。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述至少一种犬益生菌菌株包括干酪乳酪杆菌和发酵粘液乳杆菌。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述至少一种犬益生菌分离株包括：干酪乳酪杆菌菌株K9-1 IDAC入藏号210415-01或其突变株；和发酵粘液乳杆菌菌株K9-2IDAC入藏号210415-02或其突变株。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括：
短促生乳杆菌菌株WF-1B IDAC入藏号051120-02；
屎肠球菌菌株WF-3IDAC入藏号181218-03；
干酪乳酪杆菌菌株K9-1 IDAC入藏号210415-01；
发酵粘液乳杆菌菌株K9-2 IDAC入藏号210415-02；
麦芽糖糊精、腐植酸和富里酸中的至少一种。
11.一种根据权利要求1至10中任一项所述的组合物用于治疗受试者的炎性肠病(IBD)和/或肠易激综合征(IBS)的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述受试者是家养狗。
13.一种用于治疗受试者的IBD和/或IBS的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1至10中任一项所述的组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者是家养狗。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述组合物口服施用。
16.一种试剂盒，其包括容器中的根据权利要求1至10中任一项所述的组合物和用于施用所述组合物以治疗IBD和/或IBS的说明。
17.一种用于制备用于治疗IBD和/或IBS的组合物的方法，其包括：
提供狼益生菌第一分离株，其中所述狼益生菌第一分离株是乳杆菌科的物种；
提供狼益生菌第二分离株，其中所述狼益生菌第二分离株是肠球菌科的物种；
提供至少一种犬益生菌分离株，其中所述至少一种犬益生菌分离株包括乳杆菌科的至少一个物种；和
组合所述狼益生菌第一和第二分离株和所述至少一种犬益生菌菌株。
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括提供至少一种益生元，并将所述至少一种益生元与所述狼益生菌第一和第二分离株和所述至少一种犬益生菌分离株组合。
19.一种短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02。
20.一种组合物，其包括短促生乳杆菌WF-1BIDAC入藏号051120-02或其突变株和至少一种附加成分。
21.一种短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02或其突变株在制备用于治疗或预防受试者的肠道生态失调的药物方面的用途。
22.一种用于治疗或预防受试者的肠道生态失调的方法，其包括向受试者施用短促生乳杆菌WF-1B IDAC入藏号051120-02或其突变株。
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