KR20230031333A - 위장 장애가 있는 반려 동물을 지원하기 위한 조성물 및 관련 방법 - Google Patents

위장 장애가 있는 반려 동물을 지원하기 위한 조성물 및 관련 방법 Download PDF

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치싱 오우
존 에프. 벌렛
페트야 콜레바
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캔바이오신 인코포레이티드
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Abstract

염증성 장 질환(IBD) 및/또는 과민성 대장 증후군(IBS)에 걸린 반려 동물을 지원하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 늑대 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주 및 개 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 프리바이오틱을 추가로 포함한다. 또한 조성물을 제조하고 대상체에서 IBS 및/또는 IBD를 치료하기 위한 관련 방법을 제공한다.

Description

위장 장애가 있는 반려 동물을 지원하기 위한 조성물 및 관련 방법
관련 출원:
본 개시내용은 2020년 6월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 제 63/045,283 호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야:
본 개시내용은 위장 장애를 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 염증성 장 질환(IBD) 및 과민성 대장 증후군(IBS)에 걸린 반려 동물을 지원하기 위한 조성물 및 관련 방법에 관한 것이다.
염증성 장 질환(IBD) 또는 과민성 대장 증후군(IBS)이 있는 동물은 통상적으로 설사, 복통, 가속화된 위장관 통과 시간, 및 변경된 식단 선호도(이에 제한되지 않음)를 포함한 증상을 나타낸다. 통상적인 암시적 특징에는 유전적 소인, 손상된 장 장벽 기능, 장내 미생물군 변화가 포함된다. 가능한 치료 방법에는 항생제, 프로바이오틱스(probiotics), 프리바이오틱스(prebiotics) 및 대변 이식의 적용이 포함된다(Major & Spiller, 2014).
인간에서 IBD 및 IBS를 치료하기 위한 다양한 치료법이 개발되었지만, 이러한 치료법은 일반적으로 동물에서는 효과적이지 않다. 집에서 기르는 개(domestic dog)와 같은 반려 동물의 IBS 및 IBD 치료에 최적화된 상업적으로 이용 가능한 치료법은 거의 없다.
하나의 양태에서, 늑대 프로바이오틱 세균(wolf probiotic bacteria)의 제1 분리 균주로서 락토바실라세아에(Lactobacillaceae) 과의 종(species)인 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주; 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주로서, 엔테로코카세아에(Enterococcaceae) 과의 종인 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주; 및 개과(canine) 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주로서, 락토바실라세아에(Lactobacillaceae) 과의 적어도 하나의 종을 포함하는 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 프리바이오틱(prebiotic)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 프리바이오틱은 말토덱스트린, 휴믹산(humic acid) 및 풀빅산(fulvic acid) 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주는 레비락토바실러스(Levilactobacillus) 종이고 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주는 엔테로코커스(Enterococcus) 종이다.
일부 구현예에서, 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주는 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis)이고 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주는 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)이다.
일부 구현예에서, 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주는 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 또는 이의 돌연변이 균주이고; 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주는 엔테로코커스 파에시움 균주 WF-3 IDAC 수탁 번호 181218-03 또는 이의 돌연변이 균주이다.
일부 구현예에서, 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주는 락티카제이바실러스(Lacticaseibacillus) 종 및 리모실락토바실러스(Limosilactobacillus) 종을 포함 한다.
일부 구현예에서, 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 균주는 락티카제이바실러스 카제이(Lacticaseibacillus casei) 및 리모실락토바실러스 페르멘툼(Limosilactobacillus fermentum)을 포함 한다.
일부 구현예에서, 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주는 하기를 포함한다: 락티카제이바실러스 카제이 균주 K9-1 IDAC 수탁 번호 210415-01 또는 이의 돌연변이 균주; 및 리모실락토바실러스 페르멘툼 균주 K9-2 IDAC 수탁 번호 210415-02 또는 이의 돌연변이 균주.
일부 구현예에서, 조성물은 하기를 포함한다: 레비락토바실러스 브레비스 균주 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02; 엔테로코커스 파에시움 균주 WF-3 IDAC 수탁 번호 181218-03; 락티카제이바실러스 카제이 균주 K9-1 IDAC 수탁 번호 210415-01; 리모실락토바실러스 페르멘툼 균주 K9-2 IDAC 수탁 번호 210415-02; 말토덱스트린, 휴믹산 및 풀빅산 중 적어도 하나.
또 다른 양태에서, 대상체(subject)에서 염증성 장 질환(IBD) 및/또는 과민성 대장 증후군(IBS)을 치료하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 대상체에게 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 IBD 및/또는 IBS를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 대상체는 집에서 기르는 개이다.
일부 구현예에서, 조성물은 경구 투여된다.
또 다른 양태에서, 용기(container) 중의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물, 및 IBD 및/또는 IBS를 치료하기 위한 조성물의 투여 설명서를 포함하는 키트(kit)를 제공한다.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 IBD 및/또는 IBS 치료용 조성물의 제조 방법을 제공한다: 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주를 제공하고(여기서 상기 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주는 락토바실라세아에 과의 종이다); 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주를 제공하며(여기서 상기 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주는 엔테로코카세아에 과의 종이다); 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주를 제공하고(여기서 상기 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주는 락토바실라세아에 과의 적어도 하나의 종을 포함한다); 상기 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 및 제2 분리 균주와 상기 개 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 균주를 조합한다.
일부 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 프리바이오틱을 제공하고, 상기 적어도 하나의 프리바이오틱을 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 및 제2 분리 균주 및 개 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주와 조합하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02를 제공한다.
또 다른 양태에서, 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 또는 이의 돌연변이 균주 및 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 대상체의 장내 미생물불균형(intestinal dysbiosis)을 치료 또는 예방하기 위한 약제(medicament)의 제조에서의, 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 또는 이의 돌연변이 균주의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 대상체에게 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 또는 이의 돌연변이 균주를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 장내 미생물불균형을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양태 및 특징은 상기 개시내용의 특정 구현예에 대한 하기의 설명을 검토하면 당업자에게 명백해질 것이다.
이제 본 발명의 일부 양태를 첨부된 도면을 참조하여 더 상세히 설명할 것이다. 도면에서:
도 1A는 리모실락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) WF-1의 16S rDNA 서열(서열번호 1)을 나타내고; 도 1B는 리길락토바실러스 아니말리스(Ligilactobacillus animalis) WF-2의 16S rDNA 서열(서열번호 2)을 나타내고; 도 1C는 엔테로코커스 파에시움 WF-3의 16S rDNA 서열(서열번호 3)을 나타내고; 도 1D는 락티플란티바실러스 플란타룸 WF-4의 16S rDNA 서열(서열번호 4)을 나타내고; 도 1E는 엘. 브레비스 WF-5의 16S rDNA 서열(서열번호 5)을 나타내고; 도 1F는 락틸락토바실러스 쿠르바투스(Latilactobacillus curvatus) WF-6의 16S rDNA 서열(서열번호 6)을 나타내고; 도 1G는 엘. 루테리 WF-7의 16S rDNA 서열(서열번호 7)을 나타내고;
도 2는 엘. 브레비스 WF-1B의 16S rDNA 서열(서열번호 10)을 나타내고;
도 3A는 엘. 카제이 K9-1의 16S rDNA 서열(서열번호 8)을 나타내고; 도 3B는 엘. 페르멘툼 K9-2의 16S rDNA 서열(서열번호 9)을 나타내고;
도 4는 일부 구현예에 따른 조성물 제조 방법의 흐름도이고;
도 5는 엘. 브레비스 WF-1B의 세균 형태를 나타내는 그람 염색 결과의 사진이고;
도 6은 엘. 브레비스 WF-1B에 대한 자가-응집 결과를 나타내는 그래프이고;
도 7은 엘. 브레비스 WF-1B에 대한 세포 표면 소수성 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 8은 엘. 브레비스 WF-1B에 대한 낮은 pH 내성 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 9는 엘. 브레비스 WF-1B에 대한 담즙염 내성 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 10은 엘. 브레비스 WF-1B에 대한 위 소화 효소(3.2 ㎎/㎖ 펩신) 내성 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 11은 엘. 브레비스 WF-1B에 대한 장 소화 효소(10 ㎎/㎖ 판크레아틴) 내성 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 12는 엘. 브레비스 WF-1B에 대한 세포 결합 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 13은 대조용(위약을 먹인 개; 흑색 막대) 및 시험(프로바이오틱스를 먹인 개; 백색 막대) 그룹으로부터 -1일(처리-전) 및 19일(처리 동안)에 수집된 분변 샘플에서 특정 세균 그룹/종의 상대 존재비를 나타내는 일련의 그래프이고(패널 A = 총 세균; 패널 B = 락토바실러스 스페시즈; 패널 C = 엔테로코커스 스페시즈; 패널 D = 엘. 카제이; 패널 E = 엘. 페르멘툼; 패널 F = 엘. 브레비스; 패널 G = 이. 파에시움); 수직 막대는 평균 ± SEM을 나타내고; 별표(*)는 2개의 데이터 세트가 통계적으로 유의함(P<0.10)을 가리키고; 공통 위첨자가 없는 2개의 데이터 세트는 이들이 통계적으로 유의하게 상이함을 가리키고(P<0.05);
도 14는 대조용(흑색 막대) 및 시험(흰색 막대) 그룹으로부터 -1일 및 19일 에 수집된 분변 샘플에 존재하는 총 단쇄 지방산(SCFA)의 정량화를 나타내는 그래프이고(수직 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다);
도 15는 대조용(패널 A 및 B) 및 시험(패널 C 및 D) 그룹으로부터 -1일(흰색 막대) 및 19일(회색 막대)에 수집된 분변 샘플에 존재하는 SCFA의 정량화를 나타내는 일련의 그래프이다(수직 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다).
일반적으로, 본 개시내용은 늑대(카니스 루스프(Canis lupus)) 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주 및 개과(씨.엘. 파밀리아리스(C.l. familiaris)) 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 프리바이오틱을 추가로 포함한다. 또한, 조성물을 제조하기 위한 관련 방법, 및 대상체에서 IBS 및/또는 IBD를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
조성물은 신바이오틱(synbiotic) 조성물일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "신바이오틱"은 적어도 하나의 프로바이오틱 성분 및 적어도 하나의 프리바이오틱 성분을 포함하는 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "프로바이오틱"은 숙주 유기체에 대해 적어도 하나의 유익한 효과를 갖는 미생물 세포 배양물 또는 제제를 지칭한다. 숙주 유기체에 대한 유익한 효과는 예를 들어 숙주의 소화 시스템, 면역 시스템 및 뇌-장-마이크로바이옴 시스템(brain-gut-microbiome system) 중 적어도 하나에 대한 유익한 효과를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "프리바이오틱(prebiotic)"은 적어도 하나의 유익한 미생물의 증식 및/또는 활동을 지원하는 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "분리된" 또는 "분리물(isolate)"은 세균 균주와 관련하여 사용될 때 자연 환경에서 분리된 세균을 지칭한다. 일부 구현예에서, 분리 균주 또는 분리물은 세균의 특정 균주의 생물학적으로 순수한 배양물이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "생물학적으로 순수한"은 유기체의 다른 균주가 실질적으로 없는 배양물을 지칭한다.
조성물은 늑대 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "늑대 프로바이오틱 세균"은 늑대로부터 분리된 프로바이오틱 활성을 갖는 세균을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "늑대"는, 카니스 루푸스 파밀리아리스를 제외하고, 임의의 공지된 아종(subspecies)을 포함한 카니스 루푸스 종의 동물을 지칭한다. 늑대는 또한 회색 늑대, 그레이 늑대, 팀버 늑대 또는 툰드라 늑대로도 알려져 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 늑대는 프리레인징(free-ranging) 늑대이다. 일부 구현예에서, 늑대는 캐나다 서스캐처원의 프린스 앨버트 국립공원에 서식하는 프리레인징 늑대이다.
늑대 프로바이오틱 세균의 각 분리 균주는 늑대의 위장관에 서식하는 위장 세균의 분리 균주일 수 있다. 일부 구현예에서, 분리 균주(들)는 늑대 분변으로부터 분리된다. 다른 구현예에서, 각각의 분리 균주는 임의의 다른 적합한 수단에 의해 늑대로부터 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 분리 균주는 젖산 균주이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 분리 균주는, 비제한적으로 리모실락토바실러스, 리길락토바실러스(Ligilactobacillus), 락티플란티바실러스(Lactiplantibacillus), 레비락토바실러스(Levilactobacillus) 또는 락틸락토바실러스 속의 종 또는 이전의 락토바실러스 속(또한 "락토바실리"라고도 지칭됨)의 임의의 다른 종을 포함한 락토바실라세아에 과의 종이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 분리 균주는 예를 들어 엔테로코커스 속의 종을 포함한 엔테로코카세아에 과의 종이다. 다른 구현예에서, 분리 균주는 늑대 위장관에 서식하는 위장 세균의 임의의 다른 속이다.
일부 구현예에서, 늑대 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주는 리모실락토바실러스 루테리(이전에는 락토바실러스 루테리), 리길락토바실러스 아니말리스(이전에는 락토바실러스 아니말리스), 엔테로코커스 파에시움, 락티플란티바실러스 플란타룸(이전에는 락토바실러스 플란타룸), 레비락토바실러스 브레비스(이전에는 락토바실러스 브레비스), 및 락틸락토바실러스 쿠르바투스(이전에는 락토바실러스 쿠르바투스) 중에서 선택된다. 당업자는 현재 및 이전 명칭이 동일한 종을 지칭하고 구현예가 임의의 하나의 특정 용어로 제한되지 않음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 분리 균주는 하기 표 1에 나열되고 국제 PCT(특허 협력 조약) 특허 출원 PCT/CA2019/051140(WO2020/037414로서 공개됨)(본원에 참고로 포함된다)에 개시된 균주 중에서 선택된다. 표 1의 각 세균 균주에 대해서, 각 분리물의 생물학적으로 순수한 스톡은 2018년 12월 18일에 부다페스트 조약에 따라 캐나다 국제 기탁 기관(IDAC)(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)에 기탁되었다.
균주 IDAC 수탁 번호 16S rDNA 서열 16S rDNA 서열을 나타내는 도면
리모실락토바실러스 루테리 WF-1 181218-01 서열번호 1 도 1A
리길락토바실러스 아니말리스 WF-2 181218-02 서열번호 2 도 1B
엔테로커커스 파에시움 WF-3 181218-03 서열번호 3 도 1C
락티플란티바실러스 플란타룸　WF-4 181218-04 서열번호 4 도 1D
레비락토바실러스 브레비스 WF-5 181218-05 서열번호 5 도 1E
락틸락토바실러스 쿠르바투스 WF-6 181218-06 서열번호 6 도 1F
리모실락토바실러스 루테리 WF-7 181218-07 서열번호 7 도 1G
일부 구현예에서, 16S 리보솜 DNA(rDNA) 서열을 사용하여 세균의 속 및 종을 확인할 수 있다. 16S rDNA 서열의 서열분석을 PCT/CA2019/051140에 기재된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 표 1에 나열된 분리 균주의 부분 16S rDNA 서열을 도 1A 내지 1G에 나타낸다.
일부 구현예에서, 분리 균주 중 하나는 캐나다 서스캐처원의 프린스 앨버트 국립공원에 서식하는 프리-레인징(free-ranging) 늑대의 분변으로부터 분리된, 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B이다. 엘. 브레비스 WF-1B의 생물학적으로 순수한 스톡은 2020년 11월 5일 부다페스트 조약에 따라 캐나다 국제 기탁 기관(IDAC)(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)에 기탁되고 수탁 번호 051120-02가 지정되었다. 엘. 브레비스 WF-1B의 부분적인 16S rDNA 서열을 도 2에 나타낸다(서열번호 10).
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 엘. 브레비스 WF-1B의 세균은 낮은 pH 및 담즙염의 존재에 대한 내성을 나타낸다. 세균은 또한 적어도 하나의 위 및/또는 장 소화 효소의 존재에 대한 내성을 나타낸다. 이러한 결과는 엘. 브레비스 WF-1B가 산성의 개과의 위 및 개과의 장을 통과하여 생존할 수 있음을 가리킨다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "생존하다"는 시험 배양물의 생육성 세포 수(㎖당 콜로니 형성 단위(CFU)로 측정됨)가 검출 한계[1.7log10(CFU/㎖) 또는 50 CFU/㎖]를 초과함을 의미한다.
하기 실시예는 또한 엘. 브레비스 WF-1B의 세균이 자가응집 능력 및 세포 표면 소수성을 가짐을 보여주며, 이는 세균 세포가 위장관의 콜로니화를 용이하게 하기 위해 대상체에서 숙주 장 상피 세포에 결합할 수 있음을 가리킨다. 엘. 브레비스 WF-1B의 세균은 또한 시험관 내에서 개 상피 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
엘. 브레비스 WF-1B의 세균은 또한 적어도 하나의 병원성 또는 부패성 미생물의 증식을 억제하는 억제 물질을 생성하는 것으로 나타났다. 하기에 논의된 바와 같이, WF-1B는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)를 포함한 병원성 또는 부패성 미생물의 여러 균주를 억제하는 것으로 밝혀졌다.
엘. 브레비스 WF-1B는 젠타마이신, 스트렙토마이신 및 에리쓰로마이신에 감수성(susceptibility)이 있지만 암피실린, 카나마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에는 내성이 있다. 항생제 감수성은, 항생제 내성 유전자가 병원성 세균을 포함한 다른 세균으로 전달되는 것을 방지하기 위해 바람직할 수 있다. 세균 증식이 관찰되지 않는 가장 낮은 항생제 농도를 최소 억제 농도(MIC)라고 한다. 일부 구현예에서, 엘. 브레비스 WF-1B는 적어도 하나의 항생제에 대해, 유럽 식품 안전청(EFSA)에 의해 설정된 MIC 컷오프 값 이하인 MIC 값을 갖는다. 전체 게놈 염기서열 분석 결과 엘. 브레비스 WF-1B의 암피실린, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 내성은 본래 내성 또는 게놈 돌연변이에 기인한 획득 내성으로 분류된다. 수평적인 항생제 내성(AR) 유전자 전달의 위험은 낮다. 따라서 엘. 브레비스 WF-1B를 동물 영양의 사료 첨가제로 사용하는 것이 안전한 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, 엘. 브레비스 WF-1B는 하나 이상의 다른 바람직한 성질을 나타내며 이러한 성질은 본원에 기재된 것들에만 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 조성물은 상기 기재된 균주 중 하나의 돌연변이체를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "돌연변이체" 또는 "돌연변이 균주"는 참조 세균 균주의 16S rDNA 서열에 대해, 적어도 95% 상동성, 적어도 96% 상동성, 적어도 97% 상동성, 적어도 98% 상동성, 적어도 99% 상동성, 또는 적어도 99.5% 상동성을 갖지만 달리 세균 게놈의 하나 이상의 다른 DNA 서열에 하나 이상의 DNA 돌연변이를 갖는 세균 균주를 지칭한다. DNA 돌연변이에는 전이 및 변위, 결실, 삽입, 및 임의의 다른 유형의 자연적인 또는 유도된 DNA 변형을 포함한 염기 치환이 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 늑대 프로바이오틱 세균의 분리 균주의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주 및 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 분리 균주는 락토바실라세아에 과의 종이고, 제2 분리 균주는 엔테로코카세아에 과의 종이다.
제1 분리 균주는 예를 들어 리모실락토바실러스, 리길락토바실러스, 락티플란티바실러스, 레비락토바실러스 또는 락틸락토바실러스 속(또는 이전의 락토바실러스 속의 임의의 다른 종)의 분리 균주를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 분리 균주는 레비락토바실러스 브레비스와 같은 레비락토바실러스 종이다 . 일부 바람직한 구현예에서, 제1 분리 균주는 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 또는 이의 돌연변이 균주이다.
제2 분리 균주는 예를 들어 엔테로코커스 속의 분리 균주를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 분리 균주는 엔테로코커스 파에시움이다. 일부 바람직한 구현예에서, 제2 분리 균주는 엔테로코커스 파에시움 균주 WF-3 IDAC 수탁 번호 181218-03 또는 이의 돌연변이 균주이다.
일부 구현예에서, 조성물은 제3, 제4, 제5 분리 균주 등과 같은 늑대 프로바이오틱 세균의 추가적인 분리 균주를 추가로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 늑대 프로바이오틱 세균의 분리 균주의 임의의 다른 적합한 조합을 포함할 수 있다.
조성물은 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "개과 프로바이오틱 세균" 또는 "개 프로바이오틱 세균"은 개로부터 분리된 프로바이오틱 활성을 갖는 세균을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "개" 또는 "집에서 기르는 개"는 카니스 루푸스 파밀리아리스 아종의 동물을 지칭한다. 일부 분류학 당국은 대안적으로, 집에서 기르는 개를 별개의 카니스 파밀리아리스 종으로서 인식한다.
개과 프로바이오틱 세균의 각 분리 균주는 개의 위장관에 서식하는 위장 세균의 분리 균주일 수 있다. 일부 구현예에서, 분리 균주(들)은 개 분변으로부터 분리된다. 다른 구현예에서, 각 분리 균주는 임의의 다른 적합한 수단에 의해 개로부터 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주는 젖산의 한 균주이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 분리 균주는 락토바실라세아에 과의 종, 예를 들어 비제한적으로 리모실락토바실러스 또는 락티카제이바실러스 속의 종(또는 이전에는 락토바실러스 속의 임의의 다른 종)이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 분리 균주는 락티카제이바실러스 카제이(이전에는 락토바실러스 카제이) 또는 리모실락토바실러스 페르멘툼(이전에는 락토바실러스 페르멘툼) 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 분리 균주는 표 2에 나열되고 캐나다 특허 제2,890,965호(본원에 참고로 포함된다)에 개시된 균주 중에서 선택된다. 표 2의 각 세균 균주에 대해서, 각 분리물의 생물학적으로 순수한 스톡은 2015년 4월 21일에 부다페스트 조약에 따라 캐나다 국제 기탁 기관(IDAC)(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)에 기탁되었다. 표 2의 균주의 부분 16S rDNA 서열을 도 3A 및 3B에 나타낸다.
균주 IDAC 수탁 번호 16S rDNA 서열 16S rDNA 서열을 나타내는 도면
락티카제이바실러스 카제이 K9-1 210415-01 서열번호 8 도 2A
리모실락토바실러스 페르멘툼 K9-2 210415-02 서열번호 9 도 2B
일부 구현예에서, 적어도 하나의 분리 균주는 표 2에 나열된 균주 중 하나의 돌연변이체이다.
조성물은 개과 프로바이오틱 세균의 분리 균주의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 개과 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주 및 개과 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주를 포함한다. 제1 및 제2 균주는 모두 락토바실라세아에 과의 종일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 분리 균주는 락티카제이바실러스 카제이와 같은 락티카제이바실러스 종이고, 제2 분리 균주는 리모실락토바실러스 페르멘툼과 같은 리모실락토바실러스 종이다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물은 락티카제이바실러스 카제이 K9-1 IDAC 수탁 번호 210415-01 및 리모실락토바실러스 페르멘툼 균주 K9-2 IDAC 수탁 번호 210415-02를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 제3, 제4, 제5 분리 균주 등과 같은 개과 프로바이오틱 세균의 추가적인 분리 균주를 추가로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 개 프로바이오틱 세균의 분리 균주의 임의의 다른 적합한 조합을 포함할 수 있다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 늑대 프로바이오틱 세균 및 개과 프로바이오틱 세균의 분리 균주는 집에서 기르는 개에게 경구 투여될 때 일반적으로 잘 허용된다. 분리 균주는 또한 개 위장관을 통과하여 생존할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 분리 균주는 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 대상체에 대해 하나 이상의 유익한 생리학적 효과를 갖는다.
일부 구현예에서, 늑대 프로바이오틱 세균 및 개과 프로바이오틱 세균의 분리 균주는 생육성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 분리 균주는 동결건조된(동결-건조된) 형태일 수 있다. 다른 구현예에서, 분리 균주는 액체 현탁액의 형태이다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 프리바이오틱을 추가로 포함하는 신바이오틱 조성물이다. 일부 구현예에서, 프리바이오틱은 다당류 프리바이오틱을 포함한다. 예를 들어, 프리바이오틱은 말토덱스트린을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 프리바이오틱은 휴믹산 및/또는 풀빅산을 포함하는 적어도 하나의 부식성 물질 성분을 포함한다. "휴믹산" 및 "풀빅산"이라는 용어는 각각 휴믹산 및 풀빅산의 이종 혼합물 뿐만 아니라 이들의 임의의 염, 에스테르 또는 기타 유도체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 휴믹산은 일반적으로 알칼리성 pH에서 수용성이지만 산성 조건에서는 덜 용해되는 반면, 풀빅산은 일반적으로 모든 pH 값에서 수용성이다.
일부 구현예에서, 조성물은 2개 이상의 프리바이오틱스의 조합을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 말토덱스트린과 휴믹산 및/또는 풀빅산의 조합을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 임의의 다른 적합한 프리바이오틱 또는 프리바이오틱스의 조합을 포함할 수 있다. 조성물의 프리바이오틱 성분은 액체 형태, 분말 형태 또는 임의의 적합한 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 프리바이오틱은 조성물에서 늑대 프로바이오틱 세균 및/또는 개과 프로바이오틱 세균의 증식 및/또는 활동을 지원할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프리바이오틱은 하기에 더욱 상세히 기재되는 바와 같이 대상체에 대해 하나 이상의 유익한 생리학적 효과를 가질 수 있다.
하나의 구체적인 예로서, 조성물은 하기를 포함하는 신바이오틱(synbiotic) 조성물일 수 있다: 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02; 엔테로코커스 파에시움 균주 WF-3 IDAC 수탁 번호 181218-03; 락티카제이바실러스 카제이 균주 K9-1 IDAC 수탁 번호 210415-01; 리모실락토바실러스 페르멘툼 균주 K9-2 IDAC 수탁 번호 210415-02; 및 말토덱스트린, 휴믹산 및 풀빅산 중 적어도 하나.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어 세포 수 또는 광학 밀도에 의해 동일한 비율로 각각의 분리 균주를 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 임의의 다른 적합한 비율로 분리 균주를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 약 1 x 107 CFU/g의 각각의 분리 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1 x 107 CFU/g 내지 약 1 x 1011 CFU/g를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 약 1 ㎎/㎖ 프리바이오틱 또는 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 20 ㎎/㎖, 또는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 15 ㎎/㎖ 프리바이오틱을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 대략 10 ㎎/㎖ 말토덱스트린 또는 대략 10 ㎎/㎖ 휴믹산 및/또는 풀빅산을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 임의의 다른 적합한 농도의 말토덱스트린, 휴믹산 및/또는 풀빅산을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 상승적 유효량의 늑대 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주; 상승적 유효량의 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주; 및/또는 상승적 유효량의 적어도 하나의 프리바이오틱을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "상승적 유효량"은 조성물에서 적어도 하나의 다른 성분과 상승적 효과를 도출하기에 충분한 하나의 성분의 양을 지칭한다.
조성물은 즉시-, 빠른-, 느린-, 지속된- 또는 지연된-방출 조성물 또는 임의의 다른 적합한 유형의 조성물일 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 약제학적 또는 영양학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 부형제의 비제한적 예는 충전제, 결합제, 담체(carrier), 희석제, 안정제, 윤활제, 활주제, 착색제, 풍미제, 코팅제, 붕해제, 보존제, 흡수제, 감미제 및 임의의 다른 약제학적 또는 영양학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 캡슐화 물질을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 캡슐화 물질의 비제한적 예는 알기네이트, 식물/미생물 검, 키토산, 전분, k-카라기난, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트와 같은 다당류; 젤라틴 또는 우유 단백질과 같은 단백질; 지방; 및 임의의 다른 적합한 캡슐화 물질을 포함한다. 분리 균주는 분무 건조, 압출, 젤화, 액적 압출, 유화, 동결-건조 또는 임의의 다른 적합한 캡슐화 방법에 의해 캡슐화된 물질에 캡슐화될 수 있다. 분리 균주의 세균 세포의 캡슐화는 세포를 보호하고 조성물의 유통기한을 연장할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 추가적인 약제학적 또는 영양학적 성분을 추가로 포함할 수 있다. 추가적인 성분의 비제한적 예는 적어도 하나의 비타민, 미네랄, 섬유질, 지방산, 아미노산 또는 임의의 다른 적합한 약제학적 또는 영양학적 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 섭취가능한 조성물이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "섭취가능한"은 대상체가 경구로 소비할 수 있는 물질을 지칭한다.
일부 구현예에서, 섭취가능한 조성물은 식이성 보충제의 형태이다. 식이성 보충제는 분말, 캡슐, 젤 캡슐, 마이크로캡슐, 비드, 정제, 씹을 수 있는 정제, 구미, 액체 또는 임의의 다른 적합한 형태의 식이성 보충제의 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 섭취가능한 조성물은 식품의 형태이다. 일부 구현예에서, 식품은 반려 동물, 특히 집에서 기르는 개에게 적합한 임의의 형태이다. 일부 구현예에서, 식품은 고형 식품(solid food product)이다. 일부 구현예에서, 고형 식품은 건조, 습윤, 반-습윤, 냉동, 탈수, 동결-건조 또는 임의의 다른 적합한 형태일 수 있다. 적합한 고형 식품의 예에는 키블(kibble), 비스킷, 씹는 것, 습윤 개 사료, 날고기를 포함한 날 개 사료, 동결-건조된 요구르트 등과 같은 개 사료가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 고형 식품은 예를 들어 동결-건조된 개 간식을 포함하는 개 간식의 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 고형 식품은 상기 식품 중의 조성물로 제형화된다. 다른 구현예에서, 조성물은 제조-후 고형 식품에 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, 섭취가능한 조성물은 고형 식품을 표면 코팅한 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 표면 코팅은 상기 세균이 고형 식품의 표면에 부착할 수 있도록 하는 담체를 포함한다. 담체는 예를 들어 식용유 또는 임의의 다른 적합한 담체일 수 있다. 일례로서, 유성 표면 코팅은 제조-후 및 냉각-후 키블 개 사료에 적용될 수 있다.
다른 구현예에서, 섭취가능한 조성물은 고형 식품의 표면에 뿌리기에 적합한 분말 형태로 제공될 수 있다. 다른 구현예에서, 섭취가능한 조성물을 액체 형태로 제공하여 고형 식품의 표면에 분무하거나, 붓거나 떨어뜨릴 수 있다.
다른 구현예에서, 식품은 액체 식품이다. 액체 식품의 비제한적 예에는 음료, 국물, 오일 현탁액, 그레이비, 우유-기반 제품, 액체 또는 반-고형 요구르트 등이 포함된다.
일부 구현예에서, 액체 식품은 상기 식품 중의 조성물로 제형화된다. 다른 구현예에서, 조성물은 제조-후 액체 식품에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 섭취가능한 조성물은 분말 형태로 제공될 수 있고 분말은 물, 우유 또는 임의의 다른 적합한 액체에 용해되어 액체 식품을 형성할 수 있다. 다른 구현예에서, 섭취가능한 조성물은 액체 형태로 제공될 수 있고 물, 우유 또는 임의의 다른 적합한 액체와 혼합되어 액체 식품을 형성할 수 있다. 대안적으로, 액체 식품을 대상체의 입에 직접 분무하거나 붓거나 떨어뜨릴 수 있다.
다른 구현예에서, 섭취가능한 조성물은 반려 동물, 특히 집에서 기르는 개가 섭취하기에 적합한 임의의 다른 형태일 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 섭취할 수 없는 형태, 예를 들어 좌약 또는 임의의 다른 적합한 형태일 수 있다.
본원은 상기 기재된 조성물로 대상체의 위장 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 또한 본원은 대상체의 위장 장애를 치료하기 위한 조성물의 용도를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료하다" 또는 "치료"는 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 건강 상태 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나 건강 상태의 적어도 하나의 증상 및/또는 건강 상태로 인한 부작용을 완전히 또는 부분적으로 개선한다는 측면에서 치료적일 수 있다. 더 명확하게 하기 위해, 이 문맥에서 "치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 대상체에게 임의의 유익한 생리학적 효과를 제공하는 것을 포함하도록 의도되며 그 의미는 특정 장애 또는 건강 상태를 예방하거나 치료하는 것으로 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 대상체는 비제한적으로, 집에서 기르는 개를 포함한 반려 동물이다. 일부 구현예에서, 개는 성견이다. 다른 구현예에서, 개는 임의의 다른 발달 단계에 있다.
일부 구현예에서, 조성물을 대상체의 염증성 장 질환(IBD) 및/또는 과민성 대장 증후군(IBS)을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "IBD"는 예를 들어 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 포함하는 위장관의 염증 상태를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "IBS"는 대상체가 재발성 또는 만성 위장 증상을 경험하는 기능성 장 장애를 지칭한다. 통상적인 증상으로는 설사, 복통, 가속화된 위장관 통과 시간, 및 변경된 식단 선호도가 있다. 일부 구현예에서, 조성물을 IBD 및/또는 IBS의 하나 이상의 증상을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물을 예를 들어 다른 기능성 장 장애를 포함한 다른 위장 장애를 치료하는데 사용할 수 있다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 늑대 프로바이오틱 세균 및 개과 프로바이오틱 세균의 분리 균주 조합은 대상체에서 프리바이오틱 성분과 함께 상승적으로 작용하여 IBD 및/또는 IBS와 관련된 불편함을 개선하는 적어도 하나의 유익한 생리학적 효과를 유도하는 것으로 여겨진다.
IBD 및 IBS와 같은 위장 장애는 국소 장 염증 및 장 장벽의 완전성 상실과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 조성물의 유익한 생리학적 효과는 장 밀착 연접 단백질 기능에 대한 긍정적인 효과 및 장 조직의 장벽 교란을 회복 또는 예방하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유익한 생리학적 효과는 또한 장 조직 생육력을 유지하는 것을 돕는 것을 포함한다. 조성물은 또한 장에서, 예를 들어 TNF-α를 포함한 염증-전 사이토카인의 발현을 감소시킬 수 있다.
또한, IBD 및 IBS는 또한 장내 미생물군의 변화 및 장내 세균에 의한 섬유질 발효에 의해 생성되는 단쇄 지방산(SCFA)의 감소된 수준과도 관련이 있다. SCFA는 장의 항상성을 유지하는 데 중요한 대사산물이다. 일부 구현예에서, 조성물의 유익한 생리학적 효과는 아세테이트, 프로피오네이트 및/또는 부티레이트의 증가된 수준과 같은 장내 미생물군의 구성 및/또는 SCFA의 생성에 대한 긍정적인 효과를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 추가적인 유익한 생리학적 효과를 제공하고 구현예는 본원에 개시된 이점에만 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 늑대 및 개 프로바이오틱 세균의 분리 균주 및 프리바이오틱 성분은 모두 하나 이상의 동일한 유익한 생리학적 효과에 기여할 수 있다. 대안적으로(또는 추가적으로), 늑대 프로바이오틱 세균, 개 프로바이오틱 세균 및/또는 프리바이오틱 성분은 하나 이상의 상이한 유익한 생리학적 효과에 기여할 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 늑대 및 개 프로바이오틱 세균의 4개 균주의 칵테일은 장 장벽 완전성과 장 염증에 긍정적인 효과를 나타낸 반면, 말토덱스트린과 같은 프리바이오틱은 장내 미생물군 조성과 SCFA 생성에 상기 균주 자체보다 더 큰 효과를 나타내었다. 따라서, 조성물의 프로바이오틱 및 프리바이오틱 성분은 IBD 및/또는 IBS의 증상을 개선하는데 있어서 전반적인 이점을 달성하기 위해 보완적인 효과를 가질 수 있다.
조성물을 대상체에게 유효량으로 투여할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 증상 또는 건강 상태를 예방, 감소 또는 제거하는데 효과적일 수 있는 조성물의 양을 지칭한다.
일부 바람직한 구현예에서, 조성물을 대상체에게 경구 투여할 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물을 대상체에게 장내 및/또는 직장 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물을, 예를 들어 적어도 월 1회, 적어도 1주에 1회, 또는 적어도 1일 1회를 포함한 임의의 적합한 간격으로 대상체에게 투여할 수 있다.
일부 구현예에서, 유효량을 1일 1회 용량으로 투여할 수 있다. 다른 구현예에서, 유효량을 하루 종일 적합한 간격으로 2회 이상의 하위 용량으로 또는 하루 종일 미세용량으로서 투여할 수 있다. 분리 균주 및 프리바이오틱스를 하나의 용량(dose)으로 함께 투여하는 것이 바람직하지만, 본원의 구현예는 조성물의 하나 이상의 성분의 개별 투여를 고려한다.
본원에 기재된 조성물에서의 사용 외에도, 엘. 브레비스 WF-1B를 PCT/CA2019/051140에 기재된 개별 균주와 유사한 방식으로 대상체의 건강을 개선시키거나 유지하기 위한 프로바이오틱으로서 단독으로 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 엘. 브레비스 WF-1B를 대상체의 장내 미생물불균형을 치료 또는 예방하거나 건강 상태 또는 장애에 대해 대상체를 치료하는 데 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 엘. 브레비스 WF-1B를 대상체에서 설사를 치료하거나 예방하기 위해 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 엘. 브레비스 WF-1B를 대상체에게 임의의 다른 건강상의 이점을 제공하기 위해 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 엘. 브레비스 WF-1B를 장내 미생물불균형, 설사, 또는 임의의 다른 적합한 건강 상태의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 엘. 브레비스 WF-1B를 세균 균주 및 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물의 일부로서 투여할 수 있다. 추가 성분은 다중-균주 조성물에 대해 상기 기재된 성분 중 임의의 성분을 포함할 수 있다. 추가 성분의 비제한적 예에는 하나 이상의 약제학적으로 또는 영양학적으로 허용되는 부형제(excipient), 캡슐화 물질, 식용 성분 및/또는 식품이 포함된다. 엘. 브레비스 WF-1B 조성물은, 예를 들어 보충제 및 식품을 포함한 상기 기재된 조성물과 동일한 형태 중 임의의 것일 수 있다.
또한 본원에서는 IBD 또는 IBS를 가진 대상체에게 투여하기 위한 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 개시된 조성물의 구현예를 제조하는 데 사용될 수 있다.
도 4는 일부 구현예에 따른 조성물을 제조하기 위한 예시적인 방법(100)의 흐름도를 도시한다. 블록(102)에서, 늑대 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주가 제공된다. 블록(104)에서, 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주가 제공된다. 이 문맥에서 "제공"이라는 용어는 분리 균주를 제조(분리 또는 배양 포함), 수령, 구매 또는 달리 획득하는 것을 지칭할 수 있다.
늑대 프로바이오틱 세균 및 개과 프로바이오틱 세균의 분리 균주는 본원에 개시된 임의의 균주일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 늑대 프로바이오틱 세균의 분리 균주는 엘. 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 및 이. 파에시움 균주 WF-3 IDAC 수탁 번호 181218-03이고; 개과 프로바이오틱 세균의 분리 균주는 엘. 카제이 균주 K9-1 IDAC 수탁 번호 210415-01 및 엘. 페르멘툼 균주 K9-2 IDAC 수탁 번호 210415-02이다.
블록(106)에서, 늑대 프로바이오틱 세균의 분리 균주(들)는 개과 프로바이오틱 세균의 분리 균주(들)와 조합된다. 이 문맥에서 "조합"이라는 용어는 분리 균주를 혼합, 블렌딩(blending) 또는 함께 모으는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 방법(100)은 적어도 하나의 프리바이오틱을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 프리바이오틱은 말토덱스트린, 휴믹산 및/또는 풀빅산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법(100)은 프리바이오틱(들)을 늑대 및 개과 프로바이오틱 세균의 분리 균주와 조합하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 분리 균주 및 프리바이오틱(들)은 동시에 함께 조합된다. 다른 구현예에서, 분리 균주가 먼저 조합되어 혼합물을 형성하고 상기 혼합물이 프리바이오틱(들)과 조합된다.
일부 구현예에서, 방법(100)은 하나 이상의 추가 성분을 제공하고 상기 추가 성분(들)을 분리 균주 및 프리바이오틱(들)과 조합하는 것을 추가로 포함한다. 추가 성분의 비제한적 예에는 하나 이상의 약제학적으로 또는 영양학적으로 허용되는 부형제, 캡슐화 물질, 식용 성분 및/또는 식품이 포함된다.
본원은 또한 용기 중의 조성물, 및 IBD 및/또는 IBS를 가진 대상체에게 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 조성물은 늑대 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주 및 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주를 포함할 수 있다. 늑대 프로바이오틱 세균 및 개과 프로바이오틱 세균의 분리 균주는 본원에 개시된 임의의 균주일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 늑대 프로바이오틱 세균의 분리 균주는 엘. 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 및 이. 파에시움 균주 WF-3 IDAC 수탁 번호 181218-03이고; 개과 프로바이오틱 세균의 분리 균주는 엘. 카제이 균주 K9-1 IDAC 수탁 번호 210415-01 및 엘. 페르멘툼 균주 K9-2 IDAC 수탁 번호 210415-02이다.
키트 중의 분리 균주는 동결-건조된 형태, 액체 형태 또는 임의의 다른 적합한 형태로 제공될 수 있다. 분리 균주는 바람직하게는 단일 용기에서 조합되지만, 하나 이상의 균주가 별도의 용기에 제공되고 키트가 균주를 함께 조합하기 위한 설명서를 포함하는 구현예도 또한 고려된다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어 말토덱스트린, 휴믹산, 및/또는 풀빅산을 포함하는 적어도 하나의 프리바이오틱을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 프리바이오틱(들)은 분리 균주와 동일한 용기에서 조합된다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 프리바이오틱이 별도의 용기에 제공될 수 있고 키트는 프리바이오틱(들)을 조성물의 나머지와 조합하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
조성물의 투여 설명서는 집에서 기르는 개와 같은 반려동물에게 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 조성물을 투여하기 위한 권장 투여량 및 빈도를 포함할 수 있고, 음식과 함께 또는 음식 없이, 다른 약물과 함께 또는 상기 약물 없이 조성물을 복용하라는 등의 설명을 또한 포함할 수 있다.
상기에 대해 어떠한 제한도 없이, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법은 하기 실시예에 의해 추가로 기재된다.
실시예 1 - 엘. 브레비스 WF-1B의 분리 및 확인
2017년 3월 23일에 캐나다 서스캐처원의 프린스 앨버트 국립공원에서 프리레인징 늑대의 분변 샘플을 수집하였다. WF-1B라고 표시된 새로운 균주를 분리하고 PCT/CA2019/051140에 기재된 방법을 사용하여 확인하였다.
표준 방법을 사용하여 그람 염색을 수행하고 그람 염색된 세균을 OMAXTM LED 40×-2000× 디지털 양안 생물 화합물 현미경에서 100× 렌즈를 사용하여 시각화하고 현미경에 연결된 3.0 MP USB 카메라를 사용하여 사진을 얻었다. 분리 균주 WF-1B의 막대형 세균 형태를 보이는 그람 염색 결과를 도 5에 나타낸다.
균주의 종을 확인하기 위해서, 16S 리보솜 DNA(rDNA)를 암호화하는 부분 유전자를 PCT/CA2019/051140에 기재된 바와 같이, PCR로 증폭하고 상거 서열분석(Sanger Sequencing)에 의해 서열분석하였다. 16S rDNA 서열분석 결과를 도 2에 나타내며, 분리 균주는 레비락토바실러스 브레비스로 확인되었다.
균주 수준에서 분리물을 확인하기 위해서, 전체 게놈 서열분석(Illumina™ Sequencing)을 수행하여 균주에 대한 보다 상세한 정보를 얻었다. 엘. 브레비스 WF-1B의 전체 게놈 서열분석의 데이터 분석 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
엘. 브레비스 WF-1B
종 수준에서 중간 게놈 크기(bp) 2,570,500
사용된 서열분석 전략 및 계측 Illumina Novaseq 6000(150 bp, 짝진 단부)
판독 품질 검사에 사용된 소프트웨어 FastQCTM (버전 0.11.7)
트리밍 전 베이스 콜링 Q 점수(정확도) 36(99.97%)
트리밍 전 총 판독 # 7,160,318(단부당 3,580,159)
트리밍 전 평균 서열 길이(bp) 150
트리밍 전 서열 데이터의 총 염기쌍(bp) 1,074,047,700(단부당 537,023,850)
게놈의 커버리지 깊이 417
서열 트리밍 및 어댑터 제거에 사용된 소프트웨어 TrimmomaticTM (버전 0.36)
서열 트리밍 및 어댑터 제거에 적용된 매개변수 ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-NovoG.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:20 AVGQUAL:20 MINLEN:75
트리밍 후 총 판독 # 6,892,250(단부당 3,446,125)
트리밍 후 평균 서열 길이(bp) 150
트리밍 후 서열 데이터의 총 염기쌍(bp) 1,033,837,500
서열 조립에 사용된 소프트웨어 SPAdesTM (버전 3.11.1)
서열 조립에 적용된 매개변수 -k 21,33,55,77,99 --cov-cutoff auto
총 콘티그 # 43
500 bp가 넘는 콘티그 # 29
최대 콘티그(bp) 504,198
500 bp가 넘는 콘티그의 총 길이(bp) 2,683,271
예상된 게놈 크기와 비교된 변화 4%
N50 메트릭 394,318
GC 함량 45%
서열 주석에 사용된 소프트웨어 RAST(버전 2.0)
서열 주석에 적용된 매개변수 주석 체계: RASTtk
보존 유전자 호출: 아니오
오류 자동 수정: 예
프레임이동 수정: 예
백필 간격: 예
분리 균주 엘. 브레비스 WF-1B의 생물학적으로 순수한 배양물 샘플은 2020년 11월 5일 부다페스트 조약에 따라 캐나다 국제 기탁 기관(IDAC)(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)에 기탁되었으며 수탁 번호 051120-02가 할당되었다.
실시예 2 - 엘. 브레비스 WF-1B의 특성화
엘. 브레비스 WF-1B의 생물학적 활성은 하기에 개략된 바와 같이 PCT/CA2019/051140에 기재된 방법을 사용하여 특성화되었다.
실시예 2.1 - 자가-응집 능력
분리물의 자가-응집 활성을 평가하기 위해 자가-응집 분석을 수행하였다. 완전히-증식된 배양물 30 ㎖를 볼텍싱하여 철저히 혼합하였다. 600 ㎚에서의 초기 광학 밀도(OD600, A0)를 측정하고 기록하였다. 나머지 세포 현탁액을 가만히 두고 주변 온도에서 5시간 동안 방해하지 않았다. OD600㎚(At)를 측정하기 위해 100 ㎕의 상부 현탁액(세포 현탁액을 볼텍싱하지 않았다)을 1시간 간격으로 채취하였다. 자가-응집 백분율을 하기와 같이 나타내었다:
Figure pct00001
여기서 A0은 0h에서의 OD600을 나타내고, At는 1h, 2h, 3h, 4h 또는 5h에서의 OD600을 나타낸다.
엘. 브레비스 WF-1B의 자가-응집율(백분율)을 도 6에 나타낸다. 이러한 결과는 분리물이 숙주 장 상피 세포 표면에 부착할 가능성이 있음을 가리킨다.
실시예 2.2 - 세포 표면 소수성
엘. 브레비스 WF-1B의 세균 세포 표면의 소수성 특성을 평가하기 위해, 탄화수소에 대한 미생물 부착(MATH) 분석(Otero et al., 2004)을 수행하여 부착에 관한 균주의 소수성을 측정하였다. 8,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 10 ㎖의 충분히 증식된 배양물을 수확한 다음 세포를 생리 식염수로 3회 세척하였다. 세포 펠릿을 생리 식염수로 재현탁하고 각 세포 현탁액의 OD600을 0.5 ± 0.1로 조절하였다. 각 세포 현탁액의 실제 최종 OD600을 측정하고 기록하였다. 3.6 ㎖의 세포 현탁액을 유리 시험관에 분액한 다음, 0.6 ㎖의 용매(톨루엔 또는 자일렌)를 동일한 유리 시험관에 분액하고 1분 동안 격렬하게 볼텍싱하였다. 섞이지 않는 용매와 수성 상이 분리되도록 시험관을 1시간 동안 가만히 두었다. 파스퇴르 피펫으로 수성 층을 제거하고 OD600(OD시험)을 측정하고 기록하였다. 각 균주의 소수성 백분율을 하기 식으로 계산하였다:
% 소수성 = (OD초기 - OD시험)/OD초기
엘. 브레비스 WF-1B의 소수성 백분율을 도 7에 나타낸다. 이러한 결과는 분리물이 숙주 장 상피 세포 표면에 부착할 가능성이 있음을 가리킨다.
실시예 2.3 - 낮은 pH 및 담즙염 내성 분석
산성 조건에 대한 엘. 브레비스 WF-1B의 내성을 평가하기 위해서, 충분히 증식된 배양물(10 ㎕) 1%를 다양한 pH 값(pH = 2.0, 2.5, 3.0 및 7.0)을 갖는 모의 위액(SGF, 펩신 없음) 1 ㎖ 용액 세트에 계대 배양하였다. 상이한 pH 값을 갖는 SGF 용액을, HCl 및 NaOH로 SGF의 pH를 조절한 다음 여과 멸균하여 제조하였다. 각각의 계대 배양물을 각각의 SGF 용액에 접종하였으면, 상기 혼합물을 볼텍싱하여 철저히 혼합하고 각 혼합물 60 ㎕를 희석 및 도말을 위해 즉시 96-웰 미세적정 플레이트의 첫 번째 컬럼에 분액하였다. 나머지 배양물은 즉시 37℃의 기밀 조건에서 6h 동안 배양하였다. 각 배양물 60 ㎕를 희석 및 도말을 위해 각각 2h, 4h 및 6h 배양 후에 새로운 96-웰 미세적정 플레이트의 첫 번째 컬럼에 분액하였다.
담즙염에 대한 분리 균주의 내성을 평가하기 위해서, 충분히 증식된 배양물(10 ㎕) 1%를 다양한 담즙염 농도(0%, 3%, 및 5%)를 갖는 포스페이트 완충된 염수(PBS, pH = 7.2) 1 ㎖ 세트에 계대 배양하였다. 상이한 담즙염 농도를 갖는 PBS 용액을, 상응하는 양의 담즙염을 멸균 PBS에 용해시켜 제조하였다. 배양물을 각 PBS 용액에 접종하였으면, 혼합물을 볼텍싱하여 철저히 혼합하고 각 혼합물 60 ㎕를 희석 및 도말을 위해 즉시 96-웰 미세적정 플레이트의 첫 번째 컬럼에 분액하였다. 나머지 배양액은 즉시 37℃의 기밀 조건에서 24h 동안 배양하였다. 각 배양물 60 ㎕를 희석 및 도말을 위해 각각 6h 및 24h 배양 후에 새로운 96-웰 미세적정 플레이트의 첫 번째 컬럼에 분액하였다.
각 배양물의 일련의 10배 희석물을 제조하고 적합한 희석물을 MRS 아가 플레이트상에 도말하고 37℃에서 2일 동안 배양하였다. 생육성 세포 수를 기록하고 적어도 3개의 독립적인 복제물의 평균[log10(CFU/㎖)] ± 표준 오차로 나타내었다.
엘. 브레비스 WF-1B에 대한 낮은 pH 및 담즙염 내성 분석의 결과를 각각 도 8 및 9에 나타낸다. 낮은 pH 연구는 WF-1B가 pH 2의 용액에서 2시간 동안 생존하고 pH 2.5 및 3.0의 용액에서 6시간 동안 생존함을 보였다. 담즙염 내성 분석은 WF-1B가 24시간 동안 3% 및 5% 담즙염에서 생존함을 보였다.
실시예 2.4 - 위 및 장 소화 효소 내성 분석
엘. 브레비스 WF-1B의 내성을 평가하기 위해서, 충분히 증식된 배양물(10 ㎕) 1%를 다양한 pH 값(pH = 2.0, 2.5 및 3.0)을 갖는 SGF 용액(3.2 ㎎/㎖의 펩신 포함) 1 ㎖ 세트로 계대 배양하였다. 배양물을 37℃의 기밀 조건에서 6h 동안 배양하였다. 각 배양물 60 ㎕를 희석 및 도말을 위해 각각 0h, 2h, 4h 및 6h 배양 후에 96-웰 미세적정 플레이트의 첫 번째 컬럼에 분액하였다.
장 소화 효소에 대한 분리물의 내성을 평가하기 위해서, 충분히 증식된 배양물(10 ㎕) 1%를 pH = 6.8에서 10 ㎎/㎖의 판크레아틴이 포함된 모의 장액(SIF) 1 ㎖ 세트로 계대 배양하였다. 배양물을 24h 동안 기밀 조건 하에 37℃에서 배양하였다. 각 배양물 60 ㎕를 희석 및 도말을 위해 각각 0h, 6h 및 24h 배양 후에 96-웰 미세적정 플레이트의 첫 번째 컬럼에 분액하였다.
각 배양물의 일련의 10배 희석물을 제조하고 적합한 희석물을 MRS 아가 플레이트에 도말하고 37℃에서 2일 동안 배양하였다. 생육성 세포 수를 기록하고 적어도 3개의 독립적인 복제물의 평균[log10(CFU/㎖)] ± 표준 오차로 나타내었다.
엘. 브레비스 WF-1B에 대한 위 소화 효소 및 장 소화 효소 내성 분석 결과를 각각 도 10 및 11에 나타낸다. 위 소화 효소 내성 분석은 WF-1B가 pH 2.0에서 4h 동안 및 pH 2.5 및 3.0에서 6시간 동안 SGF(펩신 3.2 ㎎/㎖ 포함)에서 생존함을 보였다. 장 소화 효소 내성 분석은 WF-1B가 24h 동안 SIF(판크레아틴 10 ㎎/㎖ 포함)에서 생존함을 보였다.
실시예 2.5 - 억제성 물질의 생성
엘. 브레비스 WF-1B의, 일련의 병원성 및 부패성 미생물에 대한 임의의 억제성 물질의 생성 능력을 평가하기 위해서, 분리물을 일련의 지표 균주의 존재 하에서 증식시켰다. 충분히 증식된 배양물 1 ㎕를 클로스트리디움 강화 한천(RCA) 플레이트에 스폿팅하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 10개의 지표 균주를 37℃에서 밤새 0.6% 효모 추출물(TSBYE)이 포함된 트립티카제 대두 브로쓰에서 배양하였다. 각각의 지표 균주(0.1%, 6 ㎕)를 RCA 연성 한천(0.75% 아가 포함) 6 ㎖에 접종한 다음, 혼합물을 스폿팅된 RCA 플레이트의 상단에 부었다. 고화된 아가 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 지표 균주의 가시적인 증식이 없는 억제 구역 크기를 측정하고 기록하였다.
결과를 표 4에 나타낸다. 표 4에서: "예"는 분리물이 해당 지표 균주에 대해 억제성 물질을 생산함을 나타내고; "아니오"는 해당 균주가 해당 지표 균주에 대해 억제성 물질을 생산하지 않음을 나타내며; "MRSA"는 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 지칭하고; "VRE"는 반코마이신 내성 엔테로코커스를 지칭한다.
지표 균주 엘. 브레비스 WF-1B
이. 콜라이　ATCC 11775 예
이. 콜라이　ATCC 25927 예
에스. 엔테리카　ATCC 13311 예
에스. 엔테리카　ATCC 8326 예
엘. 모노사이토게네스 ATCC 1946 예
엘. 모노사이토게네스 ATCC 43256 예
MRSA R667 예
MRSA R776 예
VRE R704 예
VRE R846 예
표 4에 나타낸 바와 같이, WF-1B는 본 연구에서 시험된 10개의 지표 균주 모두에 대해 억제성 물질을 생성하였다.
실시예 2.6 - 항생제 감수성 분석 및 서열 분석
브로쓰 미세희석을 사용하여, 통상적으로 사용되는 8가지 임상 항생제에 대한 엘. 브레비스 WF-1B 분리물의 감수성을 측정하였다. 브로쓰 미세희석을 하기에 따른 방법에 따라 수행하였다: 국제 표준화 기구, 우유 및 유제품 - 비피도박테리아 및 비-엔테로코커스 젖산(LAB)에 적용가능한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)의 측정(ISO 10932:2012). 항생제 모액(stock solution)을 하기 문헌에 따른 방법에 따라 제조하였다: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 23rd edition, CLSI Standard M100, Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2013.
엘. 브레비스 WF-1B에 대한 항생제 감수성 분석에서 측정된 최소 억제 농도(MIC) 및 미생물학적 컷오프 값을 하기 표 5에 나타낸다.
항생제
(㎍/㎖) 		엘. 브레비스
WF-1B
MIC 컷-오프 값
암피실린 8 2
젠타마이신 3 16
카나마이신 85 32
스트렙토마이신 8 64
에리쓰로마이신 0.83 1
클린다마이신 8 1
테트라사이클린 64 8
클로람페니콜 16 4
표 5에 나타낸 바와 같이, WF-1B는 젠타마이신, 스트렙토마이신 및 에리쓰로마이신을 포함한 여러 항생제에 감수성이 있으며 이에 대한 MIC는 유럽 식품 안전청(EFSA) 컷오프 값 미만이다.
내성의 특성을 조사하기 위해서, 먼저 MIC 분포를 종 수준에서 요약하였다. 둘째로, 포괄적인 항생제 내성 데이터베이스(CARD), 항생제 내성 유전자 주석 데이터베이스(ARG-ANNOT), ReFinder 4.1 및 하위시스템 기술을 사용하는 신속한 주석(RAST)을 포함한 최신 데이터베이스 목록과 비교하여, 임상적으로 중요한 임의의 항균제에 대한 내성을 암호화하거나 이에 기여하는 유전자의 존재에 대해 전체 게놈 샷건 서열(콘티그 또는 스캐폴드)을 조사하였다.
엘. 브레비스 WF-1B는 젠타마이신, 스트렙토마이신, 및 에리쓰로마이신에 민감하지만, 암피실린, 카나마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린, 및 클로람페니콜에는 내성이 있었다. 엘. 브레비스 WF-1B에 대한 암피실린, 카나마이신, 클린다마이신 및 클로람페니콜의 MIC는 엘. 브레비스의 종 수준에서 MIC 분포 범위에 속하였으며, 이는 이러한 내성이 본래 또는 천연 내성에 속할 가능성이 있음을 가리킨다. 엘. 브레비스 WF-1B에 대한 테트라사이클린의 MIC는 엘. 브레비스의 종 수준에서 MIC 분포 범위를 벗어났으며, 이는 엘. 브레비스 WF-1B의 테트라사이클린 내성이 획득 내성에 속함을 가리킨다.
RGI(내성 유전자 식별자) 분석 수행에 의한 데이터베이스 CARD, 획득된 항균 내성 유전자 검색에 의한 ResFinder 4.1, 및 blast 수행에 의한 ARG-ANNOT와의 비교에 의해 엘. 브레비스 WF-1B에 대한 적중은 발견되지 않았다.
더욱이, 독성 인자, 항생제 내성, 및 전이성 인자에 대해, 독성, 질병 및 방어 하위시스템, 및 프로파지, 전이성 인자 및 플라스미드 하위시스템에서 확인된 이들 인자에 대한 RAST 출력의 하위시스템 특징 수를 검색하여 주석을 달았다. 엘. 브레비스 WF-1B에서는 독성 인자나 병원성 유전자군(pathogenicity island)이 확인되지 않았다. 엘. 브레비스 WF-1B에서 확인된 항생제 내성(AR) 결정인자는 번역 연장 인자 G, 리보솜 보호형 테트라사이클린 내성 관련 단백질(그룹 2), DNA 자이라제 서브유닛 A 및 B, 다중약물 유출 펌프 오페론의 전사 조절인자, TetR(AcrR) 패밀리, 다중 항균 압출 단백질(Na(+)/약물 역수송체) 및 MDR 유출 펌프의 MATE 패밀리를 포함한다.
따라서 엘. 브레비스 WF-1B는, 플라스미드 상에 존재하는 대신에 엘. 브레비스 WF-1B의 염색체 상에 존재하는, 리보솜 보호형 테트라사이클린 내성 관련 단백질(그룹 2), 번역 연장 인자 G, 및 다중약물 내성 유출 펌프의 존재로 인해 상기 나열된 항생제에 내성이었다. 더욱이, 상기에 나열된 유전자에 플랭킹된(flanked) 상류 및 하류 서열을, 유사한 유기체의 서열과 비교하여 특성화하였으며 이동성 유전 요소는 확인되지 않았다. 또한, 엘. 브레비스 WF-1B에서 전이성 인자 및 유전자 전달제는 확인되지 않았다. 따라서, 상기 내성은 본래 내성 또는 게놈 돌연변이에 기인한 획득 내성 중 어느 하나로 분류된다. 수평적인 AR 유전자 전달의 위험은 낮다. 따라서 엘. 브레비스 WF-1B를 동물 영양의 사료 첨가제로 사용하는 것은 안전한 것으로 간주된다.
실시예 2.7 - 세포 결합 분석
시험관내에서 엘. 브레비스 WF-1B 분리물의 부착 능력을 평가하기 위해, 2개의 개과 세포주, MDCK 및 DH82를 이 연구에 사용하였다. 카니스 파밀리아리스 ATCC CCL-34(MDCK(NBL-2)) 및 카니스 파밀리아리스 ATCC CRL-10389(DH82)를 조직 배양 플라스크에서 완전 배지와 함께 액체 질소 탱크에 보관된 냉동 스톡으로부터 소생시켰다. 세포주 배양을 위해 이 연구에서 사용된 기본 배지는 높은 글루코스 수준, 글루타민 및 나트륨 피루베이트를 포함하는 DMEM(Dubecco의 변형된 이글 배지; GibcoTM)이었다. 완전 배지는 DMEM 및 10% 열 불활성화(56℃에서 30분 동안) 소 태아 혈청(FBS; GibcoTM)으로 구성되었다. 증식 조건은 37℃, 5% CO2였다. 세포 분산에 사용된 용액은 0.53 mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)와 함께 0.25%(w/v) 트립신이었다. 부착 분석 전에 완전한 분화를 허용하기 위해 합류 후 2주 동안 세포주 배양물을 유지하였다. 세포 계수를 위해 혈구계산기를 사용하였다.
세균 세포 현탁액을, 3,500 g에서 10분 동안 원심분리에 의해 충분히 증식된 배양물 5㎖를 수확한 다음 세포를 PBS(pH = 7.4)로 3회 세척하여 제조하였다. 세포 펠릿을 기본 배지 DMEM에 재현탁하고 WF-1B 분리물에 대해 약 1.0 및 대조용 균주 에스. 엔테리카 ATCC 13311에 대해 약 0.1의 OD600㎚로 조절하였으며, 이는 WF-1B 분리물에 대해 약 5 x 108 CFU/㎖ 및 대조용 균주에 대해 약 1 x 108 CFU/㎖에 해당한다.
MDCK 및 DH82 세포의 세포 단층을 12-웰 조직 배양 플레이트에서 제조하였다. 세포를 웰당 4×104 세포의 농도로 접종하여 합류시키고 분화되게 하였다. 배양 배지를 2일 마다 교체하였다. 세포가 합류되었으면, 완전 배지를 제거한 다음 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 기본 배지 DMEM 1 ㎖를 각 웰에 가하고 부착 분석 전에 1h 동안 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다.
세균 세포 현탁액 1 ㎖ 분액을 합류된 단층 세포에 가하고 5% CO2 대기 하에 37℃에서 2h 동안 배양하였다. 1 ㎖의 기본 배지 DMEM을 하나의 웰에 가하여 무균 대조군으로 사용하였다. 2시간 후, 단층 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 250 ㎕의 트립신-EDTA 용액을 세포 층이 분산될 때까지 각 웰에 가한 후, 1.75 ㎖의 완전 배지를 가하고 피펫팅에 의해 세포를 흡출하였다.
각 배양물의 일련의 10배 희석물을 제조하고 적합한 희석물을 MRS 아가 플레이트 상에 도말하고 37℃에서 2일 동안 배양하였다. 생육성 세포 수를 기록하고 적어도 3개의 독립적인 복제물의 평균[log10(CFU/㎖)] ± 표준 오차로 나타내었다. 세포 결합율을, 세포주에 대한 세균 세포 현탁액의 최초 접종된 CFU에 대해, 세포주에 결합한 생육성 세포 수로서 계산하였다.
세포 결합 분석 결과를 도 12에 나타낸다. 세포 결합 분석 결과는 엘. 브레비스 WF-1B가 높은 세포 표면 결합 능력을 나타냄을 입증하였다.
실시예 3 - 늑대 및 개과 분리 균주 및 프리바이오틱스의 생물학적 효과
실시예 3.1 - 개 급식 시험(Dog Feeding Trial)
3개의 독립적인 개 급식 시험(하나는 캐나다에서, 2개는 아일랜드 공화국에서 수행됨)은 4개의 젖산 균주, 엘. 카제이 K9-1, 엘. 페르멘툼 K9-2, 엘. 브레비스 WF-1B 및 이. 파에시움 WF-3이 28일 동안 1일 1회 경구 투여될 때 건강한 비글 개에서 잘 허용됨을 입증하였다.
또한, PMA-qPCR(프로피디움 모노아지드 - 정량적 폴리머라제 연쇄 반응) 기술에 의해 개 급식 시험으로부터 수집된 분변 샘플로부터의 생육성 세포의 열거는 4개의 프로바이오틱 균주(엘. 카제이 K9-1, 엘. 페르멘툼 K9-2, 엘. 브레비스 WF-1B 및 이. 파에시움 WF-3)가 모두 개 위장관을 성공적으로 통과하여 생존함을 입증하였다.
엘. 카제이, 엘. 페르멘툼, 엘. 브레비스 및 이. 파에시움을 포함한 특정 세균 종의 풍부도에 대한 상기 조성물의 효과를 qPCR에 의해 측정하였으며 그 결과를 도 13에 나타낸다. 도 13에서, 세로 막대는 평균 ± SEM을 나타내고 데이터 분석은 대조군(위약을 먹인 개)과 시험 그룹(K-9 Heritage Probiotic Blend®를 먹인 개) 사이, 또는 세균, 락토바실러스 스페시즈, 엘. 카제이, 엘. 페르멘툼 및 엘. 브레비스의 총수에 대해 동일한 시험 그롭으로부터 수집된 -1일(처리 전) 및 D19(처리 19일) 샘플 사이에서 통계학적으로 유의한 차이가 존재하지 않았음을 보인다. 시험 그룹으로부터 D19에 수집된 분변 샘플 중에 존재하는 엔테로코커스 스페시즈의 수는 -1일에 시험 그룹으로부터 수집된 것(P<0.05) 및 D19에 대조군으로부터 수집된 것(P<0.10)보다 유의하게 더 높았다. 시험 그룹으로부터 D19에 수집된 분변 샘플 중에 존재하는 이. 파이세움의 수는 -1일에 대조군 및 시험 그룹 모두로부터 수집된 것(P<0.05) 및 D19에 대조군으로부터 수집된 것(P<0.05)보다 유의하게 더 높았다.
건강한 개에서 아세트산, 프로피온산, n-부티르산, 이소-부티르산, 발레르산 및 이소-발레르산을 포함한 단쇄 지방산(SCFA)의 생성에 대한 조성물의 효과를 또한 측정하였다. 그 결과를 도 14 및 15에 나타낸다. 데이터 분석은 -1일에 대조군 및 시험 그룹으로부터 수집된 분변 샘플 중에 존재하는 아세트산, 프로피온산, n-부티르산, 이소부티르산, 발레르산 및 이소발레르산을 포함한 SCFA의 총량이 약 200 μmol/g 분변임을 보였다. 19일에 대조군 및 시험 그룹으로부터 수집된 분변 샘플 중에 존재하는 SCFA의 총량은 각각 약 1,200 μmol/g 분변 및 약 1,000 μmol/g 분변으로 유의하게 증가하였다. 전반적으로, 대조군과 시험 그룹 사이에, -1일 또는 19일에 수집된 분변 샘플 중에 존재하는 전체 SCFA 또는 개별 SCFA의 양 모두에 관하여 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 대조군 또는 시험 그룹으로부터 수집된 분변 샘플 중에 존재하는 전체 SCFA 또는 개별 SCFA(발레르산 제외)의 양은 -1일부터 19일까지 급격하게 증가하였다.
실시예 3.2 - 시험관 내 위장 모델
엘. 카제이 K9-1, 엘. 페르멘툼 K9-2, 엘. 브레비스 WF-1B 및 이. 파에시움 WF-3이 개과의 위와 소장을 통과하는 동안의 생존을, TIM-1로서 지칭되는 개 조건을 시뮬레이션하는 동적 시험관 내 위장 모델에서 시뮬레이션하였다. TIM-1 시스템은 네덜란드의 TNO(네덜란드 응용 과학 연구소)에서 개발되었으며 위장관 내의 생리학적 과정과 조건을 시뮬레이션하는 컴퓨터 제어 모델이다. TIM-1 시스템은 GI 통과를 조절하는 밸브로 상호 연결된 여러 구획으로 이루어진다.
건식 개과 사료(키블)와 혼합된 동결 건조된 분말 포맷의 4개 균주를 TIM-1 시스템에 공급하고, PMA-qPCR 기술에 의해 회장 유출물에서 생육성 세포 균등물을 측정하였다. 결과는 TIM-1 통과 후 엘. 카제이 K9-1의 생존율이 95.6 ± 4.0%이고, 엘. 페르멘툼 K9-2의 경우 2.9 ± 1.4%, 엘. 브레비스 WF-1B의 경우 317 ± 15%, 및 이. 파에시움 WF-3의 경우 255 ± 120%임을 보인다. 이러한 데이터는 균주가 개의 GI관을 생존하여 통과하여 대장에 도달할 수 있음을 입증한다.
실시예 3.3 - 시험관내 장 조직 모델
개의 장 조직의 장 상피 장벽 기능 및 소염 반응에 대한 엘. 카제이 K9-1, 엘. 페르멘툼 K9-2, 엘. 브레비스 WF-1B 및 이. 파에시움 WF-3의 효과를, 플랫폼에 올려놓은 건강한 개의 결장 조직 분절을 사용하는 시험관내 장 모델(InTESTine™ 플랫폼, TNO, The Netherlands)에서 연구하였다. 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 균주를 염증-전 작용제로서 사용하고 사이토칼라신 D를 장 장벽 기능 교란제로 사용하였다.
에스. 엔테리카의 접종은 결장 조직의 장벽 기능을 현저하게 방해하여 밀착 연접 기능에 특별한 영향을 미쳤다. 만니톨(세포간 수송 지표)의 증가된 세포간 수송은, 4개의 프로바이오틱 균주, 엘. 카제이 K9-1, 엘. 페르멘툼 K9-2, 엘. 브레비스 WF-1B 및 이. 파에시움 WF-3의 칵테일을 에스. 엔테리카 접종 30분 전에 접종할 때 감소되었으며, 이는 이러한 프로바이오틱 균주가 장 밀착 연접 단백질 기능에 긍정적인 영향을 미치고 장 조직의 장벽 교란을 회복 또는 예방함을 가리킨다.
정점 및 기저측부 구획으로의 누적된 락테이트 데하이드로게나제(LDH, 세포 독성 지표) 누출은 모든 배양물에서 낮았으며, 이는 배양 6시간 동안 적절한 장 조직 생육력을 가리킨다. 4개의 프로바이오틱 균주, 엘. 카제이 K9-1, 엘. 페르멘툼 K9-2, 엘. 브레비스 WF-1B 및 이. 파에시움 WF-3의 칵테일을 첨가한 모든 배양물은 감소된 LDH 방출을 나타내었으며, 이는 이들 프로바이오틱 균주가 장 조직 생육력 유지에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 가리킨다. 이러한 긍정적인 효과는 주로 정점 구획으로의 LDH 분비의 3- 내지 4배 감소에 의해 야기되었다.
결장 조직에서 IL-4, IL-6, IL-12α, IL-12β, IFN-γ, 및 TNF-α 및 GAPDH의 유전자 발현을 qPCR에 의해 측정하였다. 살모넬라 엔테리카와의 배양물에서 IL-6, IL-12β, IFN-γ 및 TNF-α의 발현 증가 경향이 관찰되었다. 흥미롭게도, 이러한 사이토카인 유전자의 증가된 발현은 4개의 프로바이오틱 균주, 엘. 카제이 K9-1, 엘. 페르멘툼 K9-2, 엘. 브레비스 WF-1B 및 이. 파에시움 WF-3 칵테일을 에스. 엔테리카 접종 30분 전에 접종하였을 때 약간 감소되었다. 특히, TNF-α의 발현이 유의하게 감소하였다. 이러한 결과는 4개의 프로바이오틱 균주 믹스가 살모넬라 엔테리카에 의해 유도된 장내 염증 반응의 감소에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 시사한다.
실시예 3.4 - 시험관 내 장내 미생물군 모델
프로바이오틱 균주 및 프리바이오틱스가 단쇄 지방산(SCFA)의 생산 및 개과 결장 내 미생물군 조성 이동에 미치는 영향을 시험관내 장 모델(i-screen™ 플랫폼, TNO, The Netherlands)에서 측정하였다. 건강한 개 6마리가 제공한 분변을 i-screen 용의 기본 접종물 제조에 사용하였다. 휴믹산과 풀빅산 또는 말토덱스트린의 혼합물을 첨가하거나 첨가하지 않은 하나의 단일 프로바이오틱 균주 또는 다중 프로바이오틱 균주의 칵테일을 i-screen 배양 시스템의 96개 웰 중 하나의 웰에 접종하였다. SCFA의 생산을 기체 크로마토그래피(GC)에 의해 정량화하고 분변 미생물군의 조성을, 배양 24시간 후 V4 고가변 영역의 16S rDNA 유전자 앰플리콘 서열분석에 의해 측정하였다.
데이터 분석은 말토덱스트린, 및 보다 적은 정도로 휴믹산 및 풀빅산의 존재가 아세테이트의 댓가로 프로피오네이트 생성을 지원한다는 것을 보여주었다. 말토덱스트린은 또한 부티레이트의 높은 생성을 산출하였다. 이. 파에시움 WF-3을 제외한 프로바이오틱 균주는 SCFA 생성에 더 적은 변화를 일으켰고 그 수준은 대조용 조건(미생물군 단독)에 더 필적한다. 그러나, 이. 파에시움 WF-3이 단독으로 또는 엘. 브레비스 WF-1B 또는 락틸락토바실러스 쿠르바투스 WF-6과 함께 107 CFU/㎖의 초기 계수로 존재하는 것은 다른 노출 조건에 비해 더 높은 아세테이트 생성을 지원하였다.
38℃에서 24시간 배양 후에, 미생물군에서 락토바실러스와 엔테로코커스의 상대 존재비가 변하였다. 구체적으로, 락토바실러스 균주는 i-screen에서 개과의 장내 미생물군을 높은 상대 존재비로 콜로니화하지 않고, 오히려 배양 24시간 후에 미생물군에서 미미한 백분율로 남아 있는 것으로 나타났다. 한편으로, 엔테로코커스 파에시움은 락토바실러스와 비교하여 i-screen에서 더 높은 수준으로 개의 장내 미생물군 중에 존재한 채 남아있었다. 프리바이오틱 말토덱스트린은 미생물군 조성에 강력한 영향을 미쳤지만, 휴믹산과 풀빅산의 혼합물은 훨씬 덜 영향을 미쳤다. 말토덱스트린은, 특히 10 ㎎/㎖의 농도에서, 프레보텔라(Prevotella), 메가노모나스(Meganomonas), 파스코락토바테리움(Phascolarctobaterium), 숙시니비브리오(Succinivibrio) 및 클로스트리디움 센수 스트릭토(Clostridium sensu stricto) 속의 증가를 지원하였다. 이는 클로스트리디움(Clostridium) XI, 푸소박테리움(Fusobacterium), 박테로이데스(Bacteroides), 파라슈테렐라(Parasutterella), 분류되지 않은 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 및 도레아(Dorea)의 댓가로 발생하였다.
실시예 4 - 휴믹산 및/또는 풀빅산을 사용한 선행 동물 급식 시험의 요약
다른 연구자들이 수행한 휴믹산 및/또는 풀빅산을 사용한 동물 급식 시험에서 휴믹산 및 풀빅산이 하기를 포함한 다수의 다양한 유익한 효과를 제공한다는 것이 입증되었다: 장내 미생물군을 유지 또는 조절하고; 바람직하지 않은 장내 미생물의 증식을 억제하지만 바람직한 장내 미생물의 증식은 자극하고; 곰팡이 증식 및 독소 생성을 감소시키고; 면역 효능을 증대시키고; 장 건강을 개선시키고; 영양소 소화율 및 이용률을 개선시키고; 증식 촉진제로서 작용하고; 생산성을 개선시키고; 혈중 지질 및 콜레스테롤을 감소시키고; 항산화 능력을 증가시킨다. (Islam et al., 2005; K
Figure pct00002
hnert et al., 2015; van Rensburg, 2015; Kaevska et al., 2016; Arif et al., 2019; Visscher et al., 2019; Mudro
Figure pct00003
ovα et al., 2020).
특정 구현예를 도시하고 기재하였지만, 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 상기 명세서에서 사용된 용어 및 표현은 본원에서 설명을 위한 용어로 사용된 것으로 제한되지 않으며, 이러한 용어 및 표현을 사용함에 있어서 도시되고 기재된 특징 또는 그 일부의 균등물을 배제하려는 의도가 없다. 더욱이, 본 개시내용을 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥에 따라 가능한 한 광범위하게 해석되어야 한다. 특히, "포함하다" 및 "포함하는"이라는 용어는 비-배타적인 방식으로 요소, 성분, 또는 단계를 지칭하는 것으로서 해석되어야 하며, 이는 참조된 요소, 성분 또는 단계가 존재하거나, 사용되거나, 또는 명시적으로 참조되지 않은 다른 요소, 성분, 또는 단계와 조합될 수 있음을 가리킨다.
참고문헌
하기의 참고문헌은 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다:
Figure pct00004
Figure pct00005
International Depositary Authority of Canada IDAC181218-01 20181218 International Depositary Authority of Canada IDAC181218-02 20181218 International Depositary Authority of Canada IDAC181218-03 20181218 International Depositary Authority of Canada IDAC181218-04 20181218 International Depositary Authority of Canada IDAC181218-05 20181218 International Depositary Authority of Canada IDAC181218-06 20181218 International Depositary Authority of Canada IDAC181218-07 20181218 International Depositary Authority of Canada IDAC051120-02 20201105 International Depositary Authority of Canada IDAC210415-01 20150421 International Depositary Authority of Canada IDAC210415-02 20150421
SEQUENCE LISTING <110> CanBiocin Inc. <120> COMPOSITIONS AND RELATED METHODS FOR SUPPORTING COMPANION ANIMALS <130> 56015-126 <150> US Provisional No. 63/045,283 <151> 2020-06-29 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 767 <212> DNA <213> Lactobacillus reuteri <220> <221> misc_feature <222> (456)..(456) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (561)..(561) <223> r is a or g <400> 1 agcgtcagtt gcagaccaga cagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc 60 attccaccgc tacacatgga gttccactgt cctcttctgc actcaagtcg cccggtttcc 120 gatgcacttc ttcggttaag ccgaaggctt tcacatcaga cctaagcaac cgcctgcgct 180 cgctttacgc ccaataaatc cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg 240 cacgtagtta gccgtgactt tctggttgga taccgtcact gcgtgaacag ttactctcac 300 gcacgttctt ctccaacaac agagctttac gagccgaaac ccttcttcac tcacgcggtg 360 ttgctccatc aggcttgcgc ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt 420 atggaccgtg tctcagttcc attgtggccg atcagnctct caactcggct atgcatcatc 480 gccttggtaa gccgttacct taccaactag ctaatgcacc gcaggtccat cccagagtga 540 tagccaaagc catctttcaa rcaaaagcca tgtggctttt gttgttatgc ggtattagca 600 tctgtttcca aatgttatcc cccgctccgg ggcaggttac ctacgtgtta ctcacccgtc 660 cgccactcac tggtgatcca tcgtcaatca ggtgcaagca ccatcaatca gttgggccag 720 tgcgtacgac ttgcatgtat taggcacacc gccggcgttc atcctga 767 <210> 2 <211> 692 <212> DNA <213> Lactobacillus animalis <400> 2 ttacagacca gagagccgct ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac gcatttcacc 60 gctacacatg gagttccact ctcctcttct gcactcaagt ctcccagttt ccaatgcact 120 actccggtta agccgaaggc tttcacatca gacttaaaag accgcctgcg ttccctttac 180 gcccaataaa tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 240 tagccgtggc tttctggtta gataccgtcg aaacgtgaac agttactctc acgcactttc 300 ttctctaaca acagggtttt acgatccgaa gaccttcttc acccacgcgg cgttgctcca 360 tcaggctttc gcccattgtg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtttgggccg 420 tgtctcagtc ccaatgtggc cgatcaacct ctcagttcgg ctacgcatca ttgccttggt 480 aagcctttac ctcaccaact agctaatgcg ccgcgggccc atccaaaagc ggtagcatag 540 ccacctttta catagttacc atgcggtaac tatggttatg cggtattagc acctgtttcc 600 aagtgttatc cccctctttt gggcaggttg cccacgtgtt actcacccgt tcgccactca 660 actctttatc ggtgagtgca agcactcggt ga 692 <210> 3 <211> 706 <212> DNA <213> Enterococcus faecium <220> <221> misc_feature <222> (558)..(558) <223> n is a, t, g, or c <400> 3 agccgccttc gccactggtg ttcctccata tatctacgca tttcaccgct acacatggaa 60 ttccactctc ctcttctgca ctcaagtctc ccagtttcca atgaccctcc ccggttgagc 120 cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgctc gctttacgcc caataaatcc 180 ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt 240 ctggttagat accgtcaagg gatgaacagt tactctcatc cttgttcttc tctaacaaca 300 gagttttacg atccgaaaac cttcttcact cacgcggcgt tgctcggtca gactttcgtc 360 cattgccgaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtt tgggccgtgt ctcagtccca 420 atgtggccga tcaccctctc aggtcggcta tgcatcgtgg ccttggtgag ccgttacctc 480 accaactagc taatgcaccg cgggtccatc catcagcgac acccgaaagc gcctttcaaa 540 tcaaaaccat gcggtttnga ttgttatacg gtattagcac ctgtttccaa gtgttatccc 600 cttctgatgg gcaggttacc cacgtgttac tcacccgttc gccactcctc tttttccggt 660 ggagcaagct ccggtggaaa aagaagcgtt cgacttgcat gtatta 706 <210> 4 <211> 760 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> misc_feature <222> (109)..(109) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (146)..(146) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (561)..(561) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (734)..(734) <223> n is a, t, g, or c <400> 4 agcgtcagtt acagaccaga cagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc 60 atttcaccgc tacacatgga gttccactgt cctcttctgc actcaagtyt cccagtttcc 120 gatgcacttc ttcggttgag ccgaangctt tcacatcaga cttaaaaaac cgcctgcgct 180 cgctttacgc ccaataaatc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg 240 cacgtagtta gccgtggctt tctggttaaa taccgtcaat acctgaacag ttactctcag 300 atatgttctt ctttaacaac agagttttac gagccgaaac ccttcttcac tcacgcggcg 360 ttgctccatc agactttcgt ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt 420 ttgggccgtg tctcagtccc aatgtggccg attaccctct caggtcggct acgtatcatt 480 gccatggtga gccgttaccc caccatctag ctaatacgcc gcgggaccat ccaaaagtga 540 tagccgaagc catctttcaa nctcggacca tgcggtccaa gttgttatgc ggtattagca 600 tctgtttcca ggtgttatcc cccgcttctg ggcaggtttc ccacgtgtta ctcaccagtt 660 cgccactcac tcaaatgtaa atcatgatgc aagcaccaat caataccaga gttcgttcga 720 cttgcatgta ttangcacgc cgccagcgtt cgtcctgagc 760 <210> 5 <211> 739 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis <220> <221> misc_feature <222> (560)..(560) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (715)..(715) <223> n is a, t, g, or c <400> 5 acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg cattccaccg ctacacatgg 60 agttccactg tcctcttctg cactcaagtc tcccagtttc cgatgcactt ctccggttaa 120 gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg cccaataaat 180 ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct 240 ttctggttaa ataccgtcaa cccttgaaca gttactctca aaggtgttct tctttaacaa 300 cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggc attgctccat cagactttcg 360 tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt gtctcagtcc 420 caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc tacgtatcat cgtcttggtg ggcctttacc 480 tcaccaacta actaatacgc cgcgggatca tccagaagtg atagccgaag ccacctttca 540 aacaaaatcc atgcggattn tgttgttata cggtattagc acctgtttcc aagtgttatc 600 ccctgcttct gggcagattt cccacgtgtt actcaccagt tcgccactcg cttcattgtt 660 gaaatcagtg caagcacgtc attcaacgga agctcgttcg acttgcatgt attangcatg 720 ccgccagcgt tcgtcctga 739 <210> 6 <211> 765 <212> DNA <213> Lactobacillus curvatus <220> <221> misc_feature <222> (737)..(737) <223> n is a, t, g, or c <400> 6 gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca 60 tttcaccgct acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc ccagtttccg 120 atgcacttct tcggttgagc cgaaggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgctc 180 gctttacgcc caataaatcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc 240 acgtagttag ccgtggcttt ctggttggat accgtcacta cctgatcagt tactatcaaa 300 tacgttcttc tccaacaaca gagttttacg atccgaaaac cttcttcact cacgcggcgt 360 tgctccatca gactttcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc 420 tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga ttaccctctc aggtcggcta tgcatcacgg 480 tcttggtgag cctttacctc accaactaac taatgcaccg cgggtccatc ctaaagtgat 540 agccgaaacc atctttcaac cttgcaccat gcggtgctag gttttatgcg gtattagcat 600 ctgtttccaa atgttatccc ccactttagg gcaggttacc cacgtgttac tcacccgtcc 660 gccactcact caaatgttat caatcagaag caagcttctt caatctaacg agagtgcgtt 720 cgacttgcat gtattangca cgccgccagc gttcgtcctg agcca 765 <210> 7 <211> 767 <212> DNA <213> Lactobacillus reuteri <220> <221> misc_feature <222> (166)..(166) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (456)..(456) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (561)..(561) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (635)..(635) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (728)..(728) <223> n is a, t, g, or c <400> 7 agcgtcagtt gcagaccaga cagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc 60 attccaccgc tacacatgga gttccactgt cctcttctgc actcaagtcg cccggtttcc 120 gatgcacttc ttcggttaag ccgaaggctt tcacatcaga cctaancaac cgcctgcgct 180 cgctttacgc ccaataaatc cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg 240 cacgtagtta gccgtgactt tctggttgga taccgtcact gcgtgaacag ttactctcac 300 gcacgttctt ctccaacaac agagctttac gagccgaaac ccttcttcac tcacgcggtg 360 ttgctccatc aggcttgcgc ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt 420 atggaccgtg tctcagttcc attgtggccg atcagnctct caactcggct atgcatcatc 480 gccttggtaa gccgttacct taccaactag ctaatgcacc gcaggtccat cccagagtga 540 tagccaaagc catctttcaa ncaaaagcca tgtggctttt gttgttatgc ggtattagca 600 tctgtttcca aatgttatcc cccgctccgg ggcangttac ctacgtgtta ctcacccgtc 660 cgccactcac tggtgatcca tcgtcaatca ggtgcaagca ccatcaatca gttgggccag 720 tgcgtacnac ttgcatgtat taggcacacc gccggcgttc atcctga 767 <210> 8 <211> 750 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (687)..(687) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (717)..(717) <223> n is a, t, g, or c <400> 8 agttttggtc gatgaacggt gcttgcactg ngantcnact taaaacgagt ggcggacggg 60 tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag tgggggataa catttggaaa cagatgctaa 120 taccgcataa atccaagaac cgcatggttc ttggctgaaa gatggcgyaa gctatcgctt 180 ttggatggac ccgcggcgta ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgatgat 240 acgtagccga actgagaggt tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 300 acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc 360 gtgagtgaag aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaat ggtcggcaga 420 gtaactgttg tcggcgtgac ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480 gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca 540 ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc tcggcttaac cgaggaagcg catcggaaac 600 tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag 660 atatatggaa gaacaccagt ggcgaangcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgangct 720 cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat 750 <210> 9 <211> 754 <212> DNA <213> Lactobacillus fermentum <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (235)..(235) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (701)..(701) <223> n is a, t, g, or c <400> 9 tcgacgcgtt ggcccaattg attganggtg cttgcacctg attgattttg gtcgccaacg 60 agtggcggac gggtgagtaa cacgtaggta acctgcccag aagcggggga caacatttgg 120 aaacagatgc taataccgca taacaacgtt gttcgcatga acaacgctta aaagatggct 180 tctcgctatc acttctggat ggacctgcgg tgcattagct tgttggtggg gtaanggcct 240 accaaggcga tgatgcatag ccgagttgag agactgatcg gccacaatgg gactgagaca 300 cggcccatac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatgggc gcaagcctga 360 tggagcaaca ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt aaagctctgt tgttaaagaa 420 gaacacgtat gagagtaact gttcatacgt tgacggtatt taaccagaaa gtcacggcta 480 actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga tttattgggc 540 gtaaagagag tgcaggcggt tttctaagtc tgatgtgaaa gccttcggct taaccggaga 600 agtgcatcgg aaactggata acttgagtgc agaagagggt agtggaactc catgtgtagc 660 ggtggaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ngcggctacc tggtctgcaa 720 ctgacgctga gactcgaaag catgggtagc gaac 754 <210> 10 <211> 840 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis <400> 10 aaccggagaa gtgcatcgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc 60 atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct 120 agtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg 180 tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc 240 agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 300 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac 360 cttaccaggt cttgacatct tctgccaatc ttagagataa gacgttccct tcggggacag 420 aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 480 caacgagcgc aacccttatt atcagttgcc agcattcagt tgggcactct ggtgagactg 540 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 600 ggctacacac gtgctacaat ggacggtaca acgagtcgcg aagtcgtgag gctaagctaa 660 tctcttaaag ccgttctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagttggaa 720 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 780 gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc caaagccggt gagataacct tcgggagtca 840

Claims (22)

  1. 늑대 프로바이오틱 세균(wolf probiotic bacteria)의 제1 분리 균주로서, 락토바실라세아에(Lactobacillaceae) 과의 종(species)인 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주;
    늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주로서, 엔테로코카세아에(Enterococcaceae) 과의 종인 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주; 및
    개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주로서, 락토바실라세아에(Lactobacillaceae) 과의 적어도 하나의 종을 포함하는 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주
    를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 프리바이오틱(prebiotic)을 추가로 포함하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    적어도 하나의 프리바이오틱이 말토덱스트린, 휴믹산(humic acid) 및 풀빅산(fulvic acid) 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주가 레비락토바실러스(Levilactobacillus) 종이고 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주가 엔테로코커스(Enterococcus) 종인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주가 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis)이고 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주가 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주가 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 또는 이의 돌연변이 균주이고; 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주가 엔테로코커스 파에시움 균주 WF-3 IDAC 수탁 번호 181218-03 또는 이의 돌연변이 균주인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주가 락티카제이바실러스(Lacticaseibacillus) 종 및 리모실락토바실러스(Limosilactobacillus) 종을 포함하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 균주가 락티카제이바실러스 카제이(Lacticaseibacillus casei) 및 리모실락토바실러스 페르멘툼(Limosilactobacillus fermentum)을 포함하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주가 락티카제이바실러스 카제이 균주 K9-1 IDAC 수탁 번호 210415-01 또는 이의 돌연변이 균주; 및 리모실락토바실러스 페르멘툼 균주 K9-2 IDAC 수탁 번호 210415-02 또는 이의 돌연변이 균주를 포함하는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    레비락토바실러스 브레비스 균주 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02;
    엔테로코커스 파에시움 균주 WF-3 IDAC 수탁 번호 181218-03;
    락티카제이바실러스 카제이 균주 K9-1 IDAC 수탁 번호 210415-01;
    리모실락토바실러스 페르멘툼 균주 K9-2 IDAC 수탁 번호 210415-02;
    말토덱스트린, 휴믹산 및 풀빅산 중 적어도 하나
    를 포함하는, 조성물.
  11. 대상체(subject)에서 염증성 장 질환(IBD) 및/또는 과민성 대장 증후군(IBS)을 치료하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  12. 제11항에 있어서,
    대상체가 집에서 기르는 개(domestic dog)인, 용도.
  13. 대상체에게 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IBD 및/또는 IBS를 치료하기 위한 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    대상체가 집에서 기르는 개인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    조성물이 경구 투여되는, 방법
  16. 용기(container) 중의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물, 및 IBD 및/또는 IBS를 치료하기 위한 조성물의 투여 설명서를 포함하는 키트(kit).
  17. IBD 및/또는 IBS를 치료하기 위한 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주를 제공하는 단계로서, 상기 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 분리 균주는 락토바실라세아에 과의 종인 단계;
    늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주를 제공하는 단계로서, 상기 늑대 프로바이오틱 세균의 제2 분리 균주는 엔테로코카세아에 과의 종인 단계;
    개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주를 제공하는 단계로서, 상기 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주는 락토바실라세아에 과의 적어도 하나의 종을 포함하는 단계;
    상기 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 및 제2 분리 균주와 상기 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 균주를 조합하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    적어도 하나의 프리바이오틱을 제공하고, 상기 적어도 하나의 프리바이오틱을 늑대 프로바이오틱 세균의 제1 및 제2 분리 균주 및 개과 프로바이오틱 세균의 적어도 하나의 분리 균주와 조합하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02.
  20. 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 또는 이의 돌연변이 균주 및 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함하는 조성물.
  21. 대상체의 장내 미생물불균형(intestinal dysbiosis)을 치료 또는 예방하기 위한 약제(medicament)의 제조에서의, 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 또는 이의 돌연변이 균주의 용도.
  22. 대상체에게 레비락토바실러스 브레비스 WF-1B IDAC 수탁 번호 051120-02 또는 이의 돌연변이 균주를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 장내 미생물불균형을 치료 또는 예방하기 위한 방법.

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