CN115044515B - 抗宠物腹泻复合益生菌及其应用 - Google Patents

抗宠物腹泻复合益生菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供抗宠物腹泻复合益生菌及其应用。所述复合益生菌由植物乳杆菌ZY08、屎肠球菌ZJUIDS‑R1、动物联合乳杆菌ZJUIDS‑R2按照等比例组合。本发明从健康宠物粪便中分离获得的益生菌并进行组合。该益生菌组合物具有较强的胆盐水解酶活力，在耐酸耐胆盐方面比其他乳酸菌有明显的优势，适合肠胃环境并具有增殖能力。该益生菌组合物具有良好的抗菌活性，能抑制肠内有害的病原菌。所述复合益生菌可在制备预防宠物腹泻产品中的应用。本发明中的复合益生菌可广泛用于开发各种宠物预防腹泻相关益生功能产品。

Description

抗宠物腹泻复合益生菌及其应用
技术领域
本发明属于动物微生物技术领域，涉及抗宠物腹泻复合益生菌及其应用。
背景技术
在宠物动物饲养过程中，因其脆弱的消化系统常发生胃肠道疾病。腹泻的发生通常与肠道微生物的区系变化有关，约80％的患病兔会出现腹泻这一症状。出现该症状的原因可以分为环境因素、营养因素和病原因素，在宠物的饲养过程中，占比最大的原因是营养因素，例如饲喂高蛋白、高纤维或含高碳水化合物饲料，以及饲料发霉、饲料中随意添加抗生素等都会引起动物发生腹泻。
目前，市面上用于预防宠物兔及其他宠物腹泻的疫苗较少，进行治疗时主要采用药物调控和生物调控。随着禁止使用抗生素的进程，腹泻等疾病防治开始寻找新的出路，益生菌、寡聚糖和酶制剂等具有巨大的应用前景，其中益生菌相关的研究最多。
2001年，FAO和WHO联合专家咨询会将益生菌定义为“活的微生物，当摄入足够的数量时，会给宿主带来未指明的健康益处”。机体摄入的外来有益细菌，通过与胃肠道免疫系统和微生物菌群相互作用，对宿主健康产生积极的影响。当受到外界刺激后，肠道内菌群失调，有害菌大量繁殖，有益菌难以对抗，自身稳态被打破，此时补充益生菌事半功倍，能在较短时间内发挥作用。益生菌在动物机体内通过免疫调节、增加肠道屏障功能、维持肠道菌群平衡、调节营养物质等作用机制影响宿主健康，能有效降低幼龄动物的发病率和死亡率、提高成年动物生产性能、改善肉质、提高饲料转化率等。益生菌作为一种天然高效环保的添加剂，是目前为止最有效的抗生素替代品。
发明内容
本发明的目的是提供抗宠物腹泻复合益生菌，所述复合益生菌由植物乳杆菌ZY08、屎肠球菌ZJUIDS-R1、动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2按照等比例组合。所述植物乳杆菌ZY08，屎肠球菌ZJUIDS-R1，动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2均已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为：植物乳杆菌ZY08为CGMCC NO.14847，保藏日期：2017年11月1日；屎肠球菌ZJUIDS-R1为CGMCCNO.24376，保藏日期：2022年1月24日；动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2为CGMCCNO.24560，保藏日期：2022年3月21日。
本发明从健康宠物的粪便中筛选出两株益生菌，分别为屎肠球菌ZJUIDS-R1(Enterococcus Faecium)，和动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2(Ligilactobacillus animalis)，从健康的婴儿粪便中分离到一株植物乳杆菌ZY08(Lactobacillus plantarum)通过细菌形态学、生理学、培养特性和16S rDNA测序等对该菌进行了鉴定。
本发明的另一个目的是提供所述复合益生菌在制备预防宠物腹泻产品中的应用。本发明涉及的宠物主要有：犬、猫、兔、豚鼠、龙猫、仓鼠等。本发明主要是针对动物的细菌性腹泻，且偏向多种致病菌混合感染导致的腹泻。导致动物腹泻的病原微生物主要又分为细菌、真菌、病毒、寄生虫等。引起动物腹泻的细菌常见于大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、巴氏杆菌、产气荚膜梭菌等，其中以大肠杆菌为病因的腹泻占首位，单一病原菌可以引起动物腹泻，也可以与其他病原菌混合感染发病，在生产和生活中混合感染引起的腹泻占比最大。
所述产品为具有抗腹泻功能的药品、宠物饲料或宠物零食等。
本发明所述的具有预防腹泻功能的药品包括具有抗腹泻功能的益生菌复合活菌制剂或益生菌复合活菌菌液，该活菌制剂或菌液中活菌数为1.0×1010～5.0×1010CFU/g。
本发明所述的具有抗动物腹泻功能的饲料由所述抗宠物腹泻的益生菌组合混合发酵制备。所述饲料优选为具有预防腹泻功能的草粉(例如为提摩西草草粉)混合物。
本发明所提供的益生菌组合在动物试验中腹泻预防率达到90％(n＝10)。其具有以下能力：(1)具有较强的胆盐水解酶活力；(2)能耐受酸和胆盐，并且具有一定的增殖能力；具有抗菌活性；具有较高的凝集率和疏水性。即，能耐受胃肠道环境、无抗生素耐性、能抑制肠内有害的病原菌，与肠上皮细胞具有较高的亲和力，能阻碍致病菌在肠道的定植的和感染。
本发明从宠物粪便中分离获得的益生菌组合具有预防宠物腹泻功能。该复合益生菌产品具有较强的胆盐水解酶活力，适合肠胃环境并具有增殖能力。无抗生素耐性，具有抗菌活性。本发明中的动物联合乳杆菌可广泛用于开发预防动物腹泻相关益生功能产品。
附图说明
图1为复合腹泻粪便形状图。注：腹泻初期可观察到兔肛门周围存在粪便内容物，粪便形状不规则，出现一头带尖或者两头都带尖，且粪便普遍变小。严重者排出稀软粪便，颗粒不成形或带有胶冻样物质。
图2为复合益生菌肠道形态图。注：腹泻兔肠道鼓气，肠道积液，结肠粪便变小且大小不均，粪便有少量黏液包裹，多段肠管空虚，偶见肠套叠现象，肠壁变薄呈透明状，蚓突可见大量白色突起，触摸有明显颗粒感。
图3为不同组动物的肠道切片，其中N为对照组；A为抗生素组；T为益生菌组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1抗腹泻复合益生菌产品的制备
1.1菌株来源
本发明所使用的菌株均从花鸟市场、健康宠物粪便样品中分离获得。粪便样品共采集53份，其中所有采样对象在被采样前的至少一个月时间内未出现腹泻等胃肠道疾病。其中植物乳杆菌ZY08，屎肠球菌ZJUIDS-R1，动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2已于均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为：植物乳杆菌ZY08为CGMCCNO.14847；屎肠球菌ZJUIDS-R1为CGMCC NO.24376；动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2为CGMCCNO.24560。
1.2菌株的培养
将植物乳杆菌ZY08，屎肠球菌ZJUIDS-R1，动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2菌株从-80℃冰箱取出，放于室温溶解，分别挑取少量甘油管菌液于LB培养基上活化，24h后挑取LB培养基上的指示菌株单菌落再划线传代3次。将最后一次活化的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃静置培养24小时后取出，4℃离心机8000rmp，离心15min，弃去上清液保存下层菌体沉淀并重悬，使活菌数达到分别达到109CFU/mL。
1.3复合菌液的制备
将植物乳杆菌ZY08，屎肠球菌ZJUIDS-R1，动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2的菌液(109CFU/mL)按照1:1:1的比例混合菌均匀，用于后续测定。
实施例2复合益生菌产品抗腹泻能力的确认
1.复合益生菌菌液的制备
参考实施例1的益生菌及组合进行菌液产品的制备。
2.体外抗菌能力的测定
2.1指示菌株培养
将四种指示菌株(大肠杆菌ATCC 25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、金黄色葡萄球菌CMCC 26003、单核细胞增生李斯特菌CMCC5400)从-80℃冰箱取出，放于室温溶解，分别挑取少量甘油管菌液于LB培养基上活化，24h后挑取LB培养基上的指示菌株单菌落再划线传代3次。将最后一次活化的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃静置培养24小时后取出，4℃离心机8000rmp，离心15min，弃去上清液保存下层菌体沉淀并重悬，使活菌数达到108CFU/mL。
2.2琼脂扩散法
采用国际通用琼脂扩散法测量乳酸菌代谢产物的抑菌活性。
使用光口锥形瓶配置LB固体培养基，待培养基灭菌后置于55℃水浴保温，等温度降下来后放于超净台中，将指示菌菌液按照1％的量接入锥形瓶中，摇晃至混合菌液，将指示菌悬液与LB固体培养基混合好后倒入已经放置牛津杯的平皿中制成15mL/皿的LB平板。待LB平板凝固后，用无菌镊子轻轻拔掉牛津杯。每孔定量加入200μL，以恩诺沙星溶液为阳性对照，接入乳酸菌悬液和发酵上清液，将接好液体的平板放于37℃，培养24h。培养结束后，用游标卡尺测量抑菌圈直径并记录。
表1.复合益生菌对病原菌抑制能力的结果
表1的结果显示，复合益生菌对常见的致病菌都有较好的抗菌效果，其中对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗菌效果最好。
实施例3复合益生菌的耐酸性、耐胆盐性和疏水性的确认
复合益生菌酸耐受性的测定
参考实施例一制备复合益生菌，以10％(v/v)的量将活菌数为108CFU/mL的复合益生菌菌悬液接种于pH为1.5的MRS液体配培养基中(液体培养基pH使用1M的NaOH与HCl调节)，分别在试验进行的0h、3h采样。为保证数值准确，使用倾注法进行活菌数的计数。取100μL的复合益生菌菌悬液注入15mL的55℃左右的MRS固体培养基内，冷却至平皿内培养基定型，37℃静置培养培养24h后计数，并基于所得数值分别计算复合益生菌3h后的酸耐受率，酸耐受计算公式如下：
酸耐受率(％)＝A3/A0×100
A3＝经酸处理3h的乳酸菌株的活菌数；A0＝乳酸菌株初始溶液的活菌数
复合益生菌胆盐耐受性的测定
参考实施例1制备复合益生菌，以10％(v/v)的量将活菌数为108CFU/mL的复合益生菌菌悬液接种于0.3％牛胆盐(v/v)的MRS液体配培养基中，分别在试验进行的0h、3h采样。为保证数值准确，使用倾注法进行活菌数的计数。取100μL的乳酸菌菌悬液注入15mL的55℃左右的MRS固体培养基内，冷却至平皿内培养基定型，37℃静置培养培养24h后计数，并基于所得数值分别计算乳酸菌3h后的胆盐耐受率，胆盐耐受计算公式如下：
胆盐耐受率(％)＝T3/T0×100
T3＝胆盐处理3h的益生菌的活菌数；T0＝益生菌初始溶液的活菌数。
乳酸菌疏水性的测试
取2mL复合益生菌菌悬液和2mL二甲苯彻底混合，37℃水浴充分震荡5min，并在2h后测量水相的吸光值，益生菌疏水性计算公式如下：
疏水作用力(％)＝(A0-A2)/A0×100
A0＝益生菌菌株0h的吸光值；A2＝益生菌菌株处理后2h的吸光值。
表2.复合益生菌对酸、胆盐耐受性和疏水性结果
菌株 酸耐受率(％) 胆盐耐受率(％) 疏水性(％)
复合益生菌 89.9 2.36 45.7
益生菌必须能够耐受胃肠道中胃酸和胆汁等一系列不良环境而活着才能发挥其益生作用。本发明提供的复合益生菌产品在pH 1.5的条件下能够生长增殖，其能顺利通过胃中的酸性环境到达小肠。同时，复合益生菌能耐受胆盐，在肠道内存活，进而能有效地预防腹泻的作用。复合益生菌产品疏水率为45.7％，说明益生菌在肠道可以较好的聚集在一起，抵抗减少损失。
实施例5抗腹泻复合益生菌对宠物兔腹泻的预防作用
1、试验动物和试验设计
试验动物选取30只体重接近、健康程度一致的30日龄新西兰大白兔，随机分为3组，每组雌雄各半，分别记为N(空白对照)组、A(抗生素饲喂)组、T(复合益生菌饲喂)组。试验周期28天，前三周，N组、A组和T组分别饲喂无菌生理盐水、抗生素(恩诺沙星)、复合益生菌，最后一周饲喂常见肠道致病菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌)，初步探索复合益生菌对细菌性腹泻的预防作用。
2、基础日粮与饲养管理
本实验断奶幼兔采用笼养方式，每天饲喂2次，根据幼兔日龄调整饲喂量，每晚将未吃完的饲料进行称量，自由饮水，每天打扫兔舍的卫生，保证幼兔良好的生活环境。其中A组为基础日粮+生理盐水；B组为基础日粮+拜有利(3mg/Kg/d)；T组为基础日粮+复合益生菌(1mL/kg/d，1×108cfu/mL)。其他按照日常管理进行。
基础日粮的原料有：玉米、麸皮、豆粕、苜蓿草粉、碳酸钙、氯化钠、鱼粉、复合维生素、复合微量元素等。基础日粮营养成分见表4。
表4基础日粮营养成分表
营养成分 单位 含量 判定合格界限
粗蛋白 ％ 14.12 12.4-17.0
粗灰分 ％ 10.4 ≤12.5
水分 ％ 10.1 ≤13.9
钙 ％ 1.14 0.45-1.4
总磷 ％ 0.76 ≥0.3
黄曲霉毒素B1 Μg/kg 未检出(＜1.0) ≤26
注：表中营养成分均为实测值。
3、测定指标
在试验周期内按时记录兔的采食量、体重，试验结束时，每只断奶幼兔进行耳源静脉采血，取1mL放入肝素钠采血管，取1.5mL放于无菌空白EP管。随后，对断奶幼兔进行剖检取样，取内脏器官肝脏、脾脏和肾脏；每段肠管取样三份；取样前，快速测量兔蚓突长度。试验结束后从兔生长性能、血液生化、血液炎症、血液抗体浓度等指标分析饲喂抗生素和复合益生菌对宠物兔的影响。
(1)腹泻发生率
试验后期，断奶幼兔饲喂肠道致病菌后，观察并记录断奶幼兔腹泻发生情况，拍照记录腹泻幼兔粪便形态，计算各组断奶幼兔腹泻发生率。图1为腹泻兔子的粪便形状图。
由表5可以看出，N组的腹泻率在所有分组中最高，且明显高于A组、T组的腹泻率，而A组、T组腹泻率基本无差异。即给断奶幼兔饲喂抗生素和ZJUIDS-R1均能降低幼兔的腹泻率。
表5益生菌对断奶幼兔腹泻率的影响
腹泻发生率(100％)
N组 50.0
A组 10*
T1组 10*
*代表差异显著；
(2)生长性能
通过计算每组断奶幼兔的采食量、日增重和饲料转化率初步评估益生菌对断奶幼兔生长性能的影响。
从表6结果可以看出，N组日采食量与A组存在明显差异，N组日采食量最高，其次是T组、A组；在3个分组中，N组平均日增重最多，其次是A组和T组，但3组之前无显著性差异；计算饲料转化率后发现，A组饲料转化率最高，其次是N组、T组。即在试验期间，N组日采食量最高，同样日增重也最高，但A组料重比最低，益生菌对断奶幼兔生长性能无显著性影响。
表6益生菌对断奶幼兔生长性能的影响
测定指标 日采食量(g) 日增重(g) 饲料转化率
N组 139.0±10.6a 36.1±3.3a 3.9±0.26a
A组 114.3±6.9b 31.9±5.6a 3.7±0.74a
T组 127.0±8.3ab 33.3±4.9a 4.7±0.59b
注：同一列未共用同一上表字母的均值间存在显著差异(P＜0.05)。
(3)血液生化指标
试验结束时，每只断奶幼兔采集血液，使用爱德士全自动生化仪测定血浆葡萄糖(GLU)、血液肌酐(CREA)、血液尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白球比(ALB/GLOB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALKP)等生化指标。
由表7可知，不同处理下N组、A组、T组这3组GLU、BUN、TP、ALB、GLOB、ALT、ALKP等生化指标均无显著性差异(P＞0.05)。但与N组对比分析发现，N、A两组血液内的GLU、BUN、TP、ALB降低，CREA增高。
表7益生菌对断奶幼兔血液生化的影响的影响
检测项目 单位 N组 A组 T组
葡萄糖GLU mg/dL 108.20±28.03 95.67±26.90 87.33±31.49
肌酐CREA mg/dL 0.94±0.09b 1.23±0.29a 1.14±0.15ab
尿素氮BUN mg/dL 22.4±7.16 20.00±10.14 19.77±8.59
尿素氮/肌酐BUN/CREA 17.80±4.44a 10.35±4.89b 11.22±3.33b
总蛋白TP g/dL 34.94±37.51 26.28±30.39 27.85±25.44
白蛋白ALB g/dL 18.62±19.63 14.78±17.22 15.67±11.69
球蛋白GLOB g/dL 16.48±18.55 11.65±13.46 13.22±10.18
白球比ALB/GLOB 1.28±0.22a 1.25±0.08a 1.02±0.27b
谷丙转氨酶ALT U/L 61.4±30.53 68.67±15.59 59.77±10.49
碱性磷酸酶ALKP U/L 119.80±45.32 119.17±29.53 109.65±29.89
注：同一列未共用同一上表字母的均值间存在显著差异(P＜0.05)。
(4)血液炎症指标
试验结束时，每只断奶幼兔进行耳源静脉采血，取1.5mL放于无菌空白EP管内，空白管里的血液，3000r离心10min，分离出上层的血清，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清里的C反应蛋白(CRP)指标。
由表8可知，T组CRP显著低于N、A两组(P＜0.05)，A组CRP相对N组出现下降，但两组差异不显著(P＞0.05)。总体而言，A组、T组都呈下降趋势，即断奶幼兔饲喂抗生素与复合益生菌均能降低幼兔全身炎症指标，且复合益生菌降低全身炎症的效果明显好于抗生素。
表8益生菌对断奶幼兔血清C反应蛋白的影响
CRP(mg/L)
N组 8.51±0.73a
A组 8.15±0.73a
T组 6.31±0.58b
注：同一列未共用同一上表字母的均值间存在显著差异(P＜0.05)。
(5)血液抗体指标
使用上述分离得到的血清，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清抗体浓度(IgG、IgM、IgA)。由表9可知，T组的三种抗体水平都显著高于N组和A组(P＜0.05)。即断奶幼兔补充复合益生菌能显著提高血液内IgA、IgG和IgM抗体水平。
表9生菌对断奶幼兔血清抗体浓度的影响
注：同一列未共用同一上表字母的均值间存在显著差异(P＜0.05)。
(6)益生菌对断奶幼兔盲肠菌群的影响
由表10可知，各分组的coverage指数都等于0.99，表明各组之间样本中序列被测出的概率一样高，同样表明本次测序结果可以代表样本中微生物的真实情况。
通过对比不同分组间的四个指数发现，A组OTU、chaos、Shannon指数最高，T组Simpson指数最低。三组之间α多样性指数无显著性差异。
表10益生菌对断奶幼兔肠道菌群α多样性的影响
注：同一列未共用同一上表字母的均值间存在显著差异(P＜0.05)。
断奶幼兔盲肠内菌群在门水平的变化如表11所示。在所有分组中厚壁菌门(Firmicutes)丰度最高，其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。饲喂益生菌后，T组中的Bacteroidetes、Bacteroidetes、Actinobacteria增加，与N组相比，疣微菌门(Verrucomicrobia)、单糖菌门(Saccharibacteria)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)等数量增加，表明饲喂益生菌后肠道菌群有所改善。
表11断奶幼兔盲肠菌群在门水平的变化
N组 A组 T组
Firmicutes 40811 36755 40062
Bacteroidetes 7003 7918 7894
Actinobacteria 902 1767 1698
Proteobacteria 472 1463 898
Verrucomicrobia 252 409 439
Saccharibacteria 55 140 161
Tenericutes 125 45 122
Cyanobacteria 38 89 137
(7)十二指肠组织切片
图2为兔子腹部剖开图，不同组的肠道组织切片见图3，图中可以看下益生菌组在组织切片的效果接近与抗生素组，显著优于空白组，表明益生菌处理可以缓解对组织的损伤。
绒毛高度(VH)越高，与肠道内容物的接触面积越大；隐窝深度(CD)越浅表明细胞的成熟度越好，分泌功能和吸收功能也越好；绒毛高度与隐窝深度比值(V/C值)与动物的生长速度呈正相关。由表12可以看出，与N组相比，益生菌组均显著提高了断奶幼兔十二指肠VH和V/C，降低了CD(P＜0.05)，其作用程度与抗生素组无显著性差异。上述结果表明益生菌对断奶幼兔十二指肠发育存在有益作用。
表12益生菌对断奶幼兔十二指肠的影响
VH(mm) CD(mm) V/C
N组 950.44±75.12b 290.34±19.32a 3.27±0.05b
A组 1381.20±209.60a 252.95±22.08b 5.44±0.45a
T组 1399.24±218.77a 201.09±18.56b 5.99±0.36a
实施例6利用抗腹泻复合益生菌制备预防腹泻菌粉
1.复合益生菌菌泥的制备
挑取单菌落接种于50mL MRS液体培养基中，放置37℃培养箱中培养24h。再次按5％的接种量于250mL MRS液体培养基中活化，放置37℃培养箱中培养24h。最后将活化好的单菌以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、pH 6.8的条件下培养24h。之后在8000r/min、4℃条件下离心15min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0)漂洗菌体2次，可制的单菌菌泥。
按照1:1:1的比例将3个单菌的菌泥混合均匀后用于后续制备
2.保护剂的制备
冻干保护剂含有15％的脱脂乳粉，5％的海藻糖，3％的谷氨酸钠，1％的甘油，0.5％的半胱氨酸盐酸盐。水作为溶剂。于110℃灭菌备用。
3.复合益生菌菌粉的制备
将上述制备的复合菌菌体沉淀按1:5的比例与保护剂溶液充分混匀。于-40℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上，然后进行真空冷冻干燥，干燥18～20h后，即可得到复合益生菌菌粉。用生理盐水复水后，洗涤两次，测得复合益生菌菌粉中活菌数为1.0×1011～5×1011CFU/g。
实施例7利用抗腹泻复合益生菌制备预防宠物腹泻草粉
复合益生菌预防宠物腹泻提摩西草粉的步骤如下：
(1)原料准备：提摩西草收割后，保证清洁，无腐败变质，将其切断至1～2cm，再打磨成粉；
(2)将实施例6所制备的复合益生菌菌粉按0.02‰接种量接种到原料中，混合均匀；
(3)储藏条件：避光保存，温度为15～25℃，时间为2年。
实施例8利用抗腹泻复合益生菌制备预防兔腹泻滴剂
预防兔腹泻滴剂，由以下质量比的原料制备而成：低聚半乳糖1％、油酸1％、植物油10％、卵磷脂1％、维生素2％、ZJUIDS-R1菌粉、纯净水35％、丙三醇50％。
将实施例6所制备的动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2菌粉按1％的比例添加进去，混合后活菌数达到1.0×108CFU/ml以上。产品密封、避光低温保存，保质期为1年。
实施例9利用抗腹泻复合益生菌制备防腹泻宠物奶粉
宠物专用防腹泻奶粉，包括以下百分比的原料：羊奶粉65-70％、混合植物油25％，复合益生菌(活菌数>108CFU/g)，矿物质2％，预混剂(维生素、微量元素等)2％、葡萄糖和麦芽糊精3％。上述防腹泻奶粉可增强机体免疫力，从根源上解决断奶幼兔肠道功能不适、肠道致病菌感染等引起的腹泻问题。
实施例10利用抗腹泻复合益生菌制备犬猫胃肠道处方膏
主要包括以下百分比的原料：麦芽糖15％、茯苓10％、陈皮15％、山楂5％、白术(炒)5％、鸡内金5％、预混剂(维生素和微量元素等)5％、纯净水35％，复合益生菌(活菌数>108CFU/mL)，制备成牙膏状。本产品可以促进肠道免疫，增加机体抵抗力，适用于犬猫疫苗或驱虫不完善、消化不良、食欲不振等。使用方法：体重小于5kg：每天两次，每次3mL；体重5-15kg：每天两次，每次4mL；体重大于15kg：每天两次，每次5mL。本产品可直接饲喂，可拌在粮食内混合饲喂，也可涂抹在爱宠鼻子上让其舔食。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种抗宠物腹泻复合益生菌，其特征在于，所述复合益生菌由植物乳杆菌ZY08（Lactobacillus plantarum）、屎肠球菌ZJUIDS-R1（Enterococcus Faecium）、动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2（Ligilactobacillus animalis）按照等比例组合，所述植物乳杆菌ZY08保藏号为CGMCC NO. 14847；屎肠球菌ZJUIDS-R1保藏号为CGMCC NO. 24376，动物联合乳杆菌ZJUIDS-R2保藏号为 CGMCC NO. 24560。
2.权利要求1所述的复合益生菌在制备预防宠物腹泻产品中的应用，其特征在于，所述产品为有抗腹泻功能的药品、宠物饲料或宠物零食。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药品是有抗腹泻功能的活菌制剂或菌液，该活菌制剂或菌液中复合益生菌的活菌数为1.0×1010~5.0×1010 CFU/g。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的宠物饲料由复合益生菌单独或与其他菌株混合发酵制备。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的宠物饲料为有预防腹泻功能的草粉混合物。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述宠物为犬、猫、兔、豚鼠、龙猫、仓鼠。
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