CN113061547A

CN113061547A - 一种用于降低仔猪腹泻发病率的复合益生菌制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113061547A
Application number: CN202110335482.6A
Authority: CN
Inventors: 黄卫强; 高旭; 乔向前
Original assignee: Inner Mongolia Sci Plus Biotech Co ltd
Current assignee: Inner Mongolia Sci Plus Biotech Co ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: CN113061547B

Abstract

本申请公开了一种用于降低仔猪腹泻发病率的复合益生菌制剂及其制备方法和应用，所述复合益生菌制剂包括乳酸片球菌PA‑19、植物乳杆菌P‑8和动物双歧杆菌乳亚种V9，由述各益生菌菌剂复配而得，所述复合益生菌制剂不含有抗生素类药物，能够调理改善仔猪肠道健康状况，实现无毒无副作用、无药物残留、降低环境污染的目标，能够提高消化率、促进仔猪生长。

Description

一种用于降低仔猪腹泻发病率的复合益生菌制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于复合益生菌剂领域，具体涉及一种用于降低仔猪腹泻发病率的复合益生菌制剂及其制备方法和应用。

背景技术

仔猪腹泻是生猪养殖场普遍存在的问题，也是造成仔猪死亡的主要原因，一般情况下，仔猪腹泻分为病毒性腹泻、细菌性腹泻、营养型腹泻、应激性腹泻和寄生虫性腹泻，其中主要以肠道感染致病性大肠杆菌、魏氏梭菌、轮状病毒最为常见。仔猪发生腹泻后，会导致肠道形态结构和功能受损、肠道屏障通透性增高、免疫力下降、肠道菌群紊乱、生长缓慢、采食量下降等不良后果。养殖场或饲料厂为追求生产效益，常在日粮中添加抗生素、高铜添加剂、高锌添加剂等，用以增强动物机体抗病性，降低腹泻发病率，促进生长。但是，此类物质长期使用会引起畜禽体内药物残留，引发食品安全问题，如果排泄至环境中会造成环境污染，此外，日粮中长期添加抗生素还会引发耐药性问题。因此，寻找安全、绿色的腹泻防控制剂迫在眉睫。研究发现，益生菌、益生元、酶制剂、有机酸、中链脂肪酸及脂肪酸酯、中草药制剂及植物提取物等均具有巨大的潜能。

现有技术存在降低仔猪腹泻率、促进生长的非抗生素添加剂，例如，中国专利申请CN201010274044.5公开了“一种替代抗生素的微生物饲料添加剂及其制备方法”，所述微生物饲料添加剂主要由枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、黑曲霉菌、米曲霉菌等组成；其制备方法为：各菌种的母种由液态发酵而成，生产种由母种固态发酵而成，生产种进一步固态发酵得到菌种，将菌种按一定比例混合即得本微生物饲料添加剂。但是，所述微生物饲料添加剂存在没有进行活菌计数，无法得知益生菌含量，从而无法判断益生菌进入肠道后其功效菌含量，导致效果无法保障。

申请号为201910020786.6的专利申请公开了“一种非抗生素类抗菌促生长的饲料添加剂”，按重量份数计，所述饲料添加剂包括以下组分：氧化锌1-20份，醛基化合物2-35份，填充剂20-80份粘合剂0.1-5份，包衣物10-50份，水8-30份。本发明所述饲料添加剂添加到饲料中的比例低，因此饲料中的氧化锌含量也低，符合标准；本发明所述饲料添加剂通过包被工艺，避免了胃酸的破坏，到达小肠后，缓释衣破裂，达到靶向给药目的；另外，本发明所述饲料添加剂可代替抗生素治疗腹泻，还能提高牲畜的食欲，同时对牲畜的生长也有显著的促进作用。但是氧化锌等物质为非天然添加剂，对幼龄动物肠道具有损害，同时氧化锌长期使用存在污染土地等问题，影响仔猪后续生长。

申请号为201910864779.4的专利申请公开了“一种猪饲料替抗添加剂及其在猪饲料中的应用”，按照重量份数计，该猪饲料替抗添加剂包括以下组分：有机酸600-800份、中链脂肪酸单甘油酯200-350份、水100-200份。本发明通过有机酸和中链脂肪酸单甘油酯的重量配比，有效缓解由肠毒性大肠杆菌诱导的炎症反应，降低仔猪由炎症带来的发热症状，促进仔猪机体蛋白沉积，改善仔猪肠道微生物结构和肠道形态，降低仔猪腹泻，促进仔猪生长发育。因此，可将该猪饲料替抗添加剂用于替代促生长抗生素用于猪饲料中。但是有机酸含量太低无法产生明显效果，太高则易导致肠道过酸化，影响仔猪正常生长。

发明内容

为解决上述问题，本申请提供一种复合益生菌制剂，所述复合益生菌制剂由多种益生菌菌粉复配而得，不含有抗生素类药物，能够调理改善仔猪肠道健康状况，实现无毒无副作用、无药物残留、降低环境污染的目标，能够提高消化率、促进仔猪生长。

本发明目的是提供一种用于降低仔猪腹泻发病率的复合益生菌制剂，所述复合益生菌制剂包括乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8和动物双歧杆菌乳亚种V9。

所述乳酸片球菌PA-19，已于2020年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.19881，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，该菌株分离自奶酪，具备优良的益生特性，研究表明该菌株具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常见肠道致病菌生长特性。

所述植物乳杆菌P-8，已于2012年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.6312，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株是2003年从内蒙古自治区牧民家庭中的自然发酵酸牛奶中分离并筛选出的具有优良益生特性的乳酸菌株，并通过体外实验、动物模型和人体试验对菌株的益生功能进行系统评价，利用基因组学的手段对菌株的益生机制进行深入剖析。目前已经证实菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，调节血脂代谢，对肝脏具有保护修复作用，提高机体免疫能力。

所述动物双歧杆菌乳亚种V9，已于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5470，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)。该菌株是2005年分离自内蒙古草原上健康蒙古族儿童肠道，并通过体外实验、动物模型和临床试验对菌株的益生功能进行系统评价，利用基因组学的手段对菌株的益生机制进行深入剖析。目前已经证实对菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，拮抗肠道致病菌，提高肠道抗致病菌感染能力，预防和缓减腹泻、便秘、腹痛、腹胀等肠易激综合症。

本申请提供的复合益生菌制剂中所用3种菌剂均具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常见肠道致病菌生长特性，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，可改善机体内的微生态环境。复合益生菌剂针对仔猪，能够提高仔猪免疫力，降低腹泻发病率和发病程度，主要表现为：能够提高仔猪免疫力，降低仔猪腹泻发病率，优化毛色和肤色，提高仔猪采食量和平均日增重，降低死亡率，提高血液中免疫球蛋白G(IgG)和粪便中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的含量，降低血清中D-乳酸和二胺氧化酶的含量，降低粪便中氨氮、硫化氢的含量和大肠菌群数。

在一种可实现的方式中，基于所述复合益生菌制剂中稀释载体的重量，所述乳酸片球菌PA-19活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，所述植物乳杆菌P-8活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，所述动物双歧杆菌乳亚种V9活菌数量≥2×10¹¹CFU/g。

在一种可实现的方式中，所述复合益生菌制剂包括乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉和动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉。

在本申请中，所述菌粉可由菌剂制备。

在本申请中，所述菌剂包括死菌菌体、活菌菌体以及益生菌的代谢产物。

进一步地，所述乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉与动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉的重量比为(1～4):(1～4):(2～8)。

优选地，所述乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉与动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉的重量比为1:1:3。

在一种可实现的方式中，所述复合益生菌制剂还可以包括稀释载体。

可选地，所述稀释载体包括脱脂乳粉。

进一步地，基于所述复合益生菌制剂的总重量，所述稀释载体的重量分数为5％～15％，优选为10％。

本发明的另一目的在于提供上述提高仔猪免疫力的复合益生菌剂的制备方法，包括如下步骤：

本发明的另一目的在于提供一种制备上述复合益生菌制剂的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1，制备乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉与动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉；

步骤2，将步骤1制得的乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉与动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉按预设比例进行混合，并加入稀释载体进行复配，制得复合益生菌制剂。

在一种可实现的方式中，步骤1包括以下步骤：

步骤1-1，分别将3株发酵菌种单独进行高密度发酵，获得各益生菌菌剂；

步骤1-2，向发酵经离心后的乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂中添加保护剂，混匀分别获得各菌对应的菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，分别得到乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉和动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉。

进一步地，步骤1-1包括：

步骤1-1-1，分别取一环活化后的乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8和动物双歧杆菌乳亚种V9的斜面菌体，分别接种至MRS培养基中，在第一预设温度下，以第一预设转速条件下培养第一预设时间，分别得到各益生菌的一级种子液。

可选地，所述第一预设温度为33～37℃，所述第一预设转速为50～100rpm，所述第一预设时间为18～24h。

优选地，培养各益生菌的温度相同，和/或，转速相同，和/或，培养时间相同。

步骤1-1-2，将步骤1-1-1培养好的一级种子液按接种量3％～10％(v/v)转接入MRS培养基进行二次活化，活化第二预设时间后得二级种子液。

可选地，所述第二预设时间为18～24h。

优选地，活化各益生菌所用时间相同。

步骤1-1-3，将步骤1-1-2获得的三种二级种子液分别按照相同接种量3％～10％(v/v)各自接入到相应的发酵罐培养基中，在第三预设温度下，以第三预设转速和第三通风量下培养第三预设时间，发酵全程调节发酵液保持为预设pH值，分别得到乳酸片球菌PA-19最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液和动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液，其中，基于所述发酵罐培养基的总体积，所述发酵罐培养基包括以下配比的组分：蔗糖50～80g/L，酵母粉20～40g/L，大豆蛋白胨8～20g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5～2.0g/L，MnSO₄·5H₂O 0.08～0.12g/L，吐温-80 0.8～1.0g/L，余量为水，pH＝7.0。

可选地，所述第三预设温度为33～37℃，所述第三预设转速为50～100rpm，所述第三预设通风量为0.3～1L/min，所述第三预设时间为8～12小时，所述预设pH值为5.6～6.2。

优选地，本步骤中，发酵各益生菌的温度相同，和/或，转速相同，通风量相同，发酵时间相同，体系pH值相同。

在一种可实现的方式中，基于各益生菌最终发酵液的总体积，各益生菌最终发酵液中活菌数量大于10¹⁰CFU/ml。

步骤1-1-4，将步骤1-1-3所得各菌的最终发酵液分别第四预设转速离心第四预设时间，收集各益生菌菌剂，所述益生菌菌剂包括活菌、死菌菌体及其代谢产物。

可选的，所述第四预设转速为5000～12000rpm，所述第四预设时间为5～15min。

优选地，分离各益生菌所用的转速相同，和/或，分离时间相同。

在一种可实现的方式中，基于所述复合益生菌的总重量，所述复合益生菌制剂中，活菌总数大于1×10¹⁰CFU/g。

经粉末包装机充氮气填充将所述复合益生菌剂进行分装，2g/袋。

进一步地，步骤1-1-3中，所述乳酸片球菌PA-19最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液、动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液、乳双歧杆菌Probio-M8最终发酵液的各自活菌数均达到1×10¹⁰CFU/ml以上。

进一步地，所述保护剂的配方包括如下配比的组分(g/L)：

进一步地，所述稀释载体为脱脂乳粉。

在步骤1-2中，各所述菌剂与保护剂的重量比可以分别为1：(5-10)。

本申请还提供所述复合益生菌制用于制备提高仔猪免疫力降低腹泻发病率制品的用途。

可选地，在仔猪饮水中添加所述复合益生菌制剂，可选地，所述复合益生菌制剂的添加量为每天加入2g所述复合益生菌制剂，特别地，所述饮用水不添加漂白粉等杀菌剂。

优选地，每只仔猪灌服所述复合益生菌剂，连续灌服3天。

在另一种可实现的方式中，所述复合益生菌菌剂还可以用于制备其它猪饲料添加剂的原料。

与现有技术相比，本发明提供的复合益生菌剂针对仔猪，能够有效降低仔猪腹泻发病率，提高仔猪采食量和平均日增重，降低死亡率，提高血液中免疫球蛋白G(IgG)和粪便中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的含量，降低血清中D-乳酸和二胺氧化酶的含量，降低粪便中氨氮、硫化氢的含量和大肠菌群数。

经实验验证，实验组腹泻发病率和死亡率均低于对照组，采食量和平均日增重均高于对照组，表明该复合益生菌剂不仅起到防控腹泻提高成活率的效果，也起到提高采食量促进生长的作用。血清中免疫球蛋白G的含量高于对照组，表明实验组体液免疫和细胞免疫水平均高于对照组；粪便中分泌型免疫球蛋白A含量显著高于对照组，表明实验组肠黏膜局部免疫水平高于对照组。血清中D-乳酸和二胺氧化酶的含量均低于对照组，表明实验组肠道黏膜损伤更小、完整性更高。粪便中氨氮含量和大肠菌群数均低于对照组，表明外源补充益生菌，能够有效调节仔猪肠道菌群，抑制氨氮、硫化氢产生菌和有害大肠菌群。

由乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9复配而成的复合益生菌剂，3种菌剂均具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常见肠道致病菌生长特性，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，可改善机体内的微生态环境，其中乳酸片球菌PA-19具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达84.66％。同时菌株PA-19具有广谱抑制致病菌的优良特性，由于乳酸片球菌PA-19的加入，使得复合益生菌剂在提高仔猪免疫力、降低腹泻发病率方面更具有显著性。

本申请发现，本申请提供的复合益生菌制剂对动物肠道微生态系统具有极其重要的作用，通过与病原菌竞争粘附位点及代谢产生的抑菌物质抑制病原菌的生长繁殖，提高体液、细胞及粘膜免疫水平，激活幼龄动物肠粘膜免疫系统，消除机体炎症。并提升肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达水平，修复肠道细胞损伤，保持肠道结构和功能的完整性，降低腹泻发病率。此外，通过充分分解结构复杂、分子量较大的蛋白质提高胃肠消化吸收率，促进生长。在提高仔猪免疫力、优化肠道屏障水平，在降低腹泻发病率的前提下，实现无毒无副作用、无药物残留、降低环境污染的目标，能够提高消化率、促进仔猪生长，对生猪健康养殖具有重要的意义。

需要说明的是本发明的一种提高仔猪免疫力降低腹泻发病率的复合益生菌剂及其制备和应用的技术效果是各组分相互协同、相互作用的结果，并非简单的原料功能的叠加，各原料组分的科学复配和提取，产生的效果远远超过各单一组份功能和效果的叠加，具有较好的先进性和实用性。

附图说明

图1示出仔猪血清免疫球蛋白G检测结果；

图2示出仔猪粪便分泌型免疫球蛋白A检测结果；

图3示出仔猪血清二胺氧化酶检测结果；

图4示出仔猪血清D-乳酸检测结果；

图5示出仔猪腹泻发病率统计结果一；

图6示出仔猪出生和断奶体重检测结果；

图7示出仔猪平均日增重计算结果；

图8示出仔猪腹泻发病率统计结果二；

图9示出仔猪死亡率统计结果；

图10示出仔猪毛色和肤色评价结果；

图11示出仔猪腹泻发病率统计结果三；

图12示出圈舍氨浓度检测结果；

图13示出圈舍中硫化氢浓度检测结果；

图14示出粪便中大肠菌群数检测结果。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。

下面通过具体的实施例对本申请提供的降低仔猪腹泻发病率的复合益生菌剂及其制备方法进行详细阐述。

实施例1乳酸片球菌PA-19耐酸、耐胆盐特性及其抑菌特性实验

将冷冻保存的乳酸片球菌PA-19接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养18h，如此传代培养2次得到活化发酵液；

所述的MRS液体培养基包括：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

耐酸、耐胆盐特性：

在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS缓冲液中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液；将活化好的菌株离心收集菌体，加入与培养基等量的pH2.5模拟胃液，37℃培养3h，于0h、3h用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。

在pH8.0(用0.1mol/L NaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液；将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃培养，于4h、8h用MRS琼脂培养基倾注法测活菌数，试验结果见表1：

存活率＝[N1/N0]×100％(N0-0h活菌数；N1-经模拟肠、胃液消化后的活菌数)

表1 PA-19人工模拟胃液和肠液的存活率

抑菌特性：

用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定乳酸片球菌PA-19发酵液的抑菌效果：将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(10⁶CFU/ml)一起倒入平板混匀。待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。

每孔加入100μL乳酸片球菌PA-19发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果见表2：

表2 乳酸片球菌PA-19的抑菌特性

注：打孔器直径为8mm。

由表1、表2试验结果可知，PA-19菌株具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，同时具有广谱抑制致病菌的优良特性。

实施例2 3种益生菌的制备

乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂的制备：

分别将4株发酵菌种单独进行高密度发酵：分别取一环活化后的乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9的斜面菌体，各自分别接种至MRS培养基中，在相同温度33～37℃，相同转速50～100rpm条件下培养18-24h，分别得到一级种子液；将培养好的一级种子液按接种量3％～10％(v/v)再次转接入MRS培养基进行二次活化，活化时间18～24h后得二级种子液；将二级种子液分别按照相同接种量3％～10％(v/v)分别各自接入到不同的发酵罐培养基中，温度均为33～37℃，转速均为50～100rpm，通风量均为0.3～1L/min，发酵全程调节发酵液相同pH值为5.6-6.2条件下培养8-12小时，分别得到乳酸片球菌PA-19最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液、动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液，将得到的上述最终发酵液分别经5000-12000rpm，5～15min离心收集菌体；

发酵罐培养基(g/L)：蔗糖50-80，酵母粉20-40，大豆蛋白胨8-20，MgSO₄·7H₂O1.5-2.0，MnSO₄·5H₂O 0.08-0.12，吐温-80 0.8-1.0，余量为水，pH7.0。

向经离心后的乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9菌的菌体中分别按照各自菌体与保护剂溶液质量比1：(5-10)的比例添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将菌悬液经冷冻干燥，分别得到乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂。

保护剂溶液的配方如下(g/L)：脱脂乳粉30～35，脱盐乳清粉15～20，工业海藻糖15～20，维生素C 3～4，卵磷脂0.05～0.08，余量为蒸馏水。

乳酸片球菌PA-19最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液以及动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液的各自活菌数均达到10¹⁰CFU/ml以上。

乳酸片球菌PA-19菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌P-8菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g。

实施例3一种提高仔猪免疫力降低腹泻发病率的复合益生菌剂的制备

复配混合：将由实施例2制备的乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂按质量比1：1：3进行混合，并加入稀释载体脱脂乳粉进行复配，制备活菌总数分别为1×10¹⁰CFU/g的复合益生菌剂；

经粉末包装机充氮气填充将复合益生菌剂进行分装，2g/袋。

实施例4一种提高仔猪免疫力降低腹泻发病率的复合益生菌剂的制备

复配混合：将由实施例2制备的乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂按质量比1：1：1进行混合，并加入稀释载体脱脂乳粉进行复配，制备活菌总数为1×10¹⁰CFU/g的复合益生菌剂；

经粉末包装机充氮气填充将复合益生菌剂进行分装，2g/袋。

实施例5一种提高仔猪免疫力降低腹泻发病率的复合益生菌剂的制备

复配混合：将由实施例2制备的乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂按质量比3：1：1进行混合，并加入稀释载体脱脂乳粉进行复配，制备活菌总数为1×10¹⁰CFU/g的复合益生菌剂；

经粉末包装机充氮气填充将复合益生菌剂进行分装，2g/袋。

实施例6一种提高仔猪免疫力降低腹泻发病率的复合益生菌剂的应用

利用实施例2制备的复合益生菌剂，对试验仔猪进行灌服，选择活菌总数为1×10¹⁰CFU/g复合益生菌剂，灌服量2g/头/天，连续灌服3天。

实施例7一种提高仔猪免疫力降低腹泻发病率的复合益生菌剂应用效果实验例

1.实验方法：

随机选取0日龄杜长大三元仔猪96头，实验组49头，对照组47头，实验组按照上述方法灌服实施例2制备的复合益生菌，连续灌服3天，哺乳过程中，统计参试仔猪腹泻发病率。分别于21日龄，检测参试仔猪血清中的免疫球蛋白G、二胺氧化酶和D-乳酸，粪便中的分泌型免疫球蛋白A。

(1)血清和粪便中免疫因子检测：采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对血清样品中的免疫球蛋白G(IgG)的含量进行检测，对粪便样品中的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量进行检测。

(2)血清肠道屏障指标检测：采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对血清样品中的二胺氧化酶的含量进行检测。采用酶学分光光度法进行血清中D-乳酸含量检测。

(3)腹泻发病情况统计：试验过程中，统计实验组和对照组各单元龄仔猪腹泻发病率。

2.试验结果：

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对试验仔猪血清样品中的免疫球蛋白G和白细胞介素-6及仔猪粪便样品中的分泌型免疫球蛋白A的含量进行检测。免疫因子免疫球蛋白G检测结果如图1所示，实验组和对照组断奶仔猪血清中免疫球蛋白G的平均含量分别为23.7和21.0ug/mL，组间差异显著(**P<0.01)。表明仔猪灌服复合益生菌剂能够提高断奶仔猪血清中免疫球蛋白G的含量，进而增强仔猪的免疫力，理论上可提高仔猪对各类疾病的抵抗能力。免疫因子分泌型免疫球蛋白A的检测结果如图2所示，实验组和对照组断奶仔猪粪便中分泌型免疫球蛋白A的平均含量分别为46.6和42.7ug/g，组间差异显著(*P<0.05)。表明仔猪灌服复合益生菌剂能够提高断奶仔猪粪便中分泌型免疫球蛋白A的含量，进而增强仔猪的肠粘膜免疫水平，从而降低仔猪患黄、白痢风险。

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对血清样品中的二胺氧化酶(DAO)的含量进行检测，结果如图3所示，实验组和对照组断奶仔猪血清中二胺氧化酶(DAO)的平均含量分别为15.3和12.5pg/mL，组间差异显著(*P<0.05)。采用酶学分光光度法进行血清中D-乳酸含量检测，结果如图4所示，实验组和对照组断奶仔猪血清中D-乳酸的平均含量分别为747.8和609.3pg/mL，组间差异显著(**P<0.01)。表明，仔猪灌服复合益生菌剂能够降低断奶仔猪血清中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸的含量，提高仔猪的肠道屏障水平，进而降低病原菌入侵的风险。

腹泻发病情况统计结果如图5所示，试验过程中，实验组和对照组平均腹泻率分别为2.2和9.8％，组间差异显著(***P＜0.001)。

综上所述，实验组仔猪灌服复合益生菌后，其血清中免疫球蛋白G和粪便中分泌型免疫球蛋白A的含量均显著高与对照组，表明实验组仔猪的体液免疫、细胞免疫和肠黏膜免疫水平得到明显提升。实验组血清样品中的二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸的含量均显著低于对照组，表明实验组仔猪肠道屏障水平优于对照组。提高仔猪免疫力和肠道屏障水平，有利于降低腹泻病发病率。

实施例8一种提高仔猪免疫力降低腹泻发病率的复合益生菌剂应用效果实验例

随机选取0日龄长大二元仔猪260头，实验组和对照组各130头，实验组按照上述方法灌服实施例2制备的复合益生菌，连续灌服3天，哺乳过程中，统计参试仔猪出生重和断奶重，并计算平均日增重。试验过程中统计参试仔猪腹泻发病率和死亡率。

1.实验方法：

(1)体重统计：试验过程中，统计哺乳仔猪出生重和断奶体重。检测时，由饲养员配合将仔猪固定在体重称中央，记录体重。并计算平均日增重。

(2)腹泻发病情况统计：试验过程中，分别在1日龄、3日龄、5日龄、14日龄、21日龄仔猪腹泻发病情况。并统计仔猪死亡率。

2.试验结果：

参试仔猪出生和断奶体重检测结果如图6所示，实验组和对照组平均出生体重分别为1.62kg/头和1.65kg/头，断奶平均体重分别为7.85kg/头和7.27kg/头。进一步计算仔猪平均日增重，结果如图7所示，实验组和对照组平均日增重分别为311.7g/头/天和280.8g/头/天，组间差异显著(*P＜0.05)。

腹泻发病情况统计结果如图8所示，1日龄实验组和对照组腹泻率分别为25％和22％，3日龄实验组和对照组腹泻率分别为9％和23％，5日龄实验组和对照组腹泻率分别为8％和19％，14日龄实验组和对照组腹泻率分别为3％和15％，21日龄实验组和对照组腹泻发病率分别为1％和12％。

死亡率统计结果如图9所示，实验组和对照组仔猪死亡率分别为3.1％和5.5％。

综上所述，实验组仔猪灌服复合益生菌后，平均日增重显著高与对照组。仔猪腹泻发病率持续低于对照组，死亡率低于对照组。

实施例9一种提高仔猪免疫力降低腹泻发病率的复合益生菌剂应用效果实验例

1.实验方法：

随机选取0日龄长大二元仔猪228头，实验组112头，对照组116头，实验组按照上述方法灌服实施例2制备的复合益生菌，连续灌服3天，试验过程中，对仔猪毛色和肤色进行评价，统计参试仔猪腹泻发病率，对圈舍氨和硫化氢浓度进行检测，对粪便中大肠菌群数进行检测。

(1)毛色和肤色评分：21日龄，对断奶仔猪毛色和肤色进行评分。

(2)腹泻发病情况统计：试验过程中，统计实验组和对照组各单元龄仔猪腹泻发病率。

(3)圈舍氨浓度检测：参照中华人民共和国标准HJ 536-2009，采用水杨酸分光光度法测定粪便中氨氮的含量。

(4)圈舍硫化氢浓度测定结果：参照中华人民共和国国家标准GB/T 14678-1993，采用火焰光度检测法测定硫化氢浓度。

(5)粪便大肠菌群数检测：参照中华人民共和国国家标准GB 4789.3-2016，采用微生物培养的方法测定粪便中大肠菌群数。

2.试验结果：

参试仔猪毛色和肤色评价结果如图10所示，实验组和对照组毛色评分分别为3.88和3.64，肤色评分分别为3.69和3.54。可见，实验组仔猪的健康水平高于对照组。

腹泻发病情况统计结果如图11所示，试验过程中，实验组和对照组平均腹泻率分别为3.5％和16.7％，组间差异显著(P＜0.001)。

圈舍氨浓度测定结果如图12所示，仔猪5日龄，实验组和对照组圈舍氨浓度分别为7.3ppm和8.6ppm。仔猪21日龄，实验组和对照组圈舍氨浓度分别为9.1ppm和11.8ppm，实验组显著低于对照组(P＜0.01)。可见，仔猪灌服复合益生菌剂后，可降低圈舍中氨浓度。

圈舍中硫化氢浓度测定结果如图13所示，仔猪5日龄，实验组和对照组圈舍硫化氢浓度分别为3.7ppm和5.3ppm，实验组显著低于对照组(P＜0.05)，仔猪21日龄，实验组和对照组圈舍硫化氢浓度分别为4.5ppm和6.8ppm，实验组显著低于对照组(P＜0.01)。可见，仔猪灌服复合益生菌剂后，可降低圈舍中硫化氢浓度。

粪便中大肠菌群数检测结果显示：仔猪5日龄，实验组和对照组粪便中大肠杆菌平均数量分别为4.4lg CFU/g和5.3lg CFU/g，实验组低于对照组。仔猪21日龄，实验组和对照组粪便中大肠杆菌平均数量分别为5.1lg CFU/g和5.9lg CFU/g，实验组低于对照组。可见，仔猪灌服复合益生菌剂后，能够控制肠道中大肠菌群的数量，从而降低大肠菌群引起腹泻的风险。

综上所述，实验组仔猪灌服复合益生菌后，可以改善毛色和肤色评分，降低氨和硫化氢浓度，控制粪便中大肠菌群，降低腹泻发病率。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims

1.一种用于降低仔猪腹泻发病率的复合益生菌制剂，其特征在于，所述复合益生菌制剂包括乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8和动物双歧杆菌乳亚种V9，其中，所述乳酸片球菌PA-19，保藏号为CGMCC No.19881，所述植物乳杆菌P-8，保藏号为CGMCC No.6312，所述动物双歧杆菌乳亚种V9，保藏号为CGMCC No.5470。

2.根据权利要求1所述的复合益生菌制剂，其特征在于，基于所述复合益生菌制剂的总重量，所述乳酸片球菌PA-19活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌P-8活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9活菌数量≥2×10¹¹CFU/g。

3.根据权利要求1或2所述的复合益生菌制剂，其特征在于，所述乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉与动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉的重量比为(1～4):(1～4):(2～8)。

4.一种制备权利要求1到3任一项所述复合益生菌制剂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1，制备乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉和动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉；

步骤2，将步骤1制得的乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉和动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉按预设比例进行混合，并加入稀释载体进行复配，制得复合益生菌制剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1包括以下步骤：

步骤1-1，分别将3株发酵菌种单独进行高密度发酵，制得各益生菌菌剂；

步骤1-2，向发酵离心后的乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂和动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂中分别添加保护剂，混匀分别获得各菌对应的菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，分别得到乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉和动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉。

6.权利要求1至3任一项所述复合益生菌制用于制备降低仔猪腹泻发病率制品的用途。

7.权利要求1至3任一项所述复合益生菌菌剂用于制备其它猪饲料添加剂的原料。