CN107058158B

CN107058158B - 一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂及其制备和应用

Info

Publication number: CN107058158B
Application number: CN201611233493.9A
Authority: CN
Inventors: 黄卫强; 张永军
Original assignee: Inner Mongolia Sci Plus Biotech Co ltd
Current assignee: Inner Mongolia Sci Plus Biotech Co ltd
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2036-12-22
Also published as: CN107058158A

Abstract

本发明公开了一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂及其制备和应用，属于复合益生菌剂领域，所述复合益生菌剂由植物乳杆菌KT‑Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P‑8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂以及稀释载体混合复配，其中，四钟菌剂的活菌数量均≥2×10¹¹CFU/g。使用不同活菌含量的复合益生菌剂对不同年龄段的96只犬进行试用60天，能够提高试验犬免疫力，降低腹泻发病率和发病程度，主要表现为：提高犬采食量和生长率，控制血液中白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数，提升血液中四种免疫因子：免疫球蛋白G、白细胞介素6、干扰素α和肿瘤坏死因子α的含量，同时提高了粪便中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的含量。

Description

一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂及其制备和应用

技术领域

本发明属于复合益生菌剂领域，具体涉及一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂及其制备和应用。

背景技术

犬的腹泻病是犬临床疾病中常见的一种，其发病原因较多且复杂，诊断、治疗难，该病可致使幼犬营养不良、生长发育缓慢、存活率低，成年犬和老年犬消化不良、精神不振、体质羸弱。目前，预防和治疗犬腹泻病主要依靠抗生素和化学药物，此类方法在临床上耗资低、见效快，但长期使用必然给公共安全带来严重的威胁，包括耐药菌株种类和数量的日益增多，甚至发生细菌变异或耐药基因水平转移，破坏机体肠道微生态系统，致使机体对新的病原体更加敏感，从而使得腹泻病的治疗难度进一步加大、治疗效果不断降低。因此，找到有效预防和治疗犬腹泻病的方法迫在眉睫。大量研究表明乳酸菌对动物肠道微生态系统具有极其重要的作用，它们通过定植在肠道中成为肠道生理屏障的重要组成部分，维持肠道微生态系统的菌群平衡。并且，这些乳酸菌能够刺激巨噬细胞、诱导产生干扰素、促进细胞分裂、产生抗体，调节机体细胞免疫、体液免疫和肠黏膜局部免疫等，最终提高机体免疫能力。可见，益生乳酸菌制备的微生物制剂是目前世界公认的理想替代品。因此，可以研究开发一种复合益生菌剂，在提高犬免疫力、降低腹泻发病率的前提下也能够实现无毒无副作用、无药物残留、降低环境污染的目标，对犬训练和繁育具有重要的意义。

乳酸杆菌是人和动物肠道内最常见的正常定居者,也是犬源益生菌研究最广泛的一种微生物。乳酸杆菌作为犬的正常菌群,在其生长过程中产生乳酸,使肠道pH值降低,能阻止致病菌在肠道的生长和繁殖,同时乳酸杆菌还可产生天然的抗菌物质,对肠道致病菌有明显的抑制和杀灭作用。乳酸杆菌不仅对致病菌有拮抗作用,而且能粘附于肠道上皮细胞上,起到占位性保护作用。同时乳酸杆菌还可产生非特异性免疫调节因子,刺激肠道局部免疫反应,提高犬的非特异性免疫功能,增强巨噬细胞的活力,提高自然杀伤细胞的活力。

乳酸杆菌作为犬用益生菌制剂菌种的研究最多。自2001年起,犬源乳酸杆菌的分离、筛选和动物试验在国外被陆续报道。从犬肠道和粪便中分离出乳酸菌株,经过筛选、发酵、干燥后,混入犬粮中饲喂幼犬,观察动物的生长状况和对疾病的预防作用。结果显示犬源乳酸杆菌对犬的有益作用,无任何不良反应,能够作为犬用益生菌制剂菌种。据文献报道,给犬饲喂乳酸杆菌后,大肠杆菌的数量显著下降,而有益菌的数量有所上升,犬对食物的消化率也大大提高。文献有报道,给患有胃肠疾病的犬口服分离的乳酸杆菌ADI,能降低血液中高浓度的胆固醇和丙氨酸转氨酶。另据文献报道,给健康犬饲喂嗜酸乳杆菌DSM13241,能改善犬的肠道菌群组成,加强消化道健康,提高免疫功能。

目前申请公开的专利中，有针对不同类型犬类提高其免疫力或提高其消化吸收率。

申请号为201110253876.3的专利申请公开了“可改善小型犬肠道微生态的复合益生菌微胶囊”，其制作方法包括以下步骤：A1，将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌制备复合菌剂；A2，制备复合益生菌液；A3，将2-5％的多孔淀粉与复合益生菌液混合，pH值调至6.0，控温25-35℃振荡30min。待充分吸附后，按照重量百分比依次加入以下外层包埋材料：1-3％海藻酸钠、1-5％明胶、1-5％糊精，搅拌均匀，滴入氯化钙溶液固化，冷冻干燥，制得复合益生菌微胶囊。本发明以多孔淀粉为芯材，吸附复合益生菌液，再以海藻酸钠、糊精和明胶为壁材，加工制得复合益生菌微胶囊。

申请号为201610162021.2的专利申请公开了“一种促进贵宾犬消化吸收的益生菌添加剂及其制备方法”，其特征在于该添加剂由嗜酸乳杆菌粉、丁酸梭菌粉、凝结芽孢杆菌粉、水苏糖、灵芝多糖、鸡肝酶解发酵物构成，通过给贵宾犬添加一定比例的益生菌、益生元、鸡肝酶解发酵物，能够帮助贵宾犬提高消化吸收能力。该发明由益生菌、益生素、鸡肝酶三者搭配协调作用，益生菌调理肠道，益生素帮助益生菌定植，发酵酶解鸡肝的主成分之一的功能性小肽可以提高机体免疫能力。

申请号为201510728812.2的专利申请公开了“一种老年犬用保健剂”，其特征在于该老年犬用保健剂由以下质量份数的组分组成：鸡蛋微胶囊粉5-10份，丝兰提取物0.3-1份，小麦水解蛋白5-15份，黄芪多糖0.5-1.5份，益生菌1-2份，膨化燕麦粉15-25份，膨化玉米粉10-20份，维生素C 0.5-1.5份，脱脂奶粉30-40份，鸡肝粉2-5份，葡萄糖3-5份，低聚木糖2-4份，丁酸钠3-5份；本发明的保健产品可改善老年犬肠道消化机能、提高营养物质利用，预防和治疗肠道疾病，提高机体免疫力，减少口臭及排泄物臭味，效果显著，安全、无毒副作用。

但综上专利，并未提供可以广泛应用于对不同类型，不同生长阶段的犬类的复合益生菌剂，在有效提高其免疫力的同时，有效降低其腹泻发病率。

发明内容

本发明目的是提供一种由植物乳杆菌KT-Lp9、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9复配而成的复合益生菌剂，四钟菌剂均具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常见肠道致病菌生长特性，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，可改善机体内的微生态环境，其中植物乳杆菌KT-Lp9还可预防和治疗高脂血症。复合益生菌剂针对犬类，能够有效提高采食量和生长率，控制血液中白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数，不仅有效提升犬类机体内四钟免疫因子：血液中免疫球蛋白G、白细胞介素6、干扰素α和肿瘤坏死因子α的含量，而且有效提高了犬类粪便中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的含量，从而最终提高试验犬免疫力，降低腹泻发病率和发病程度。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂，是由植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂以及稀释载体混合复配，其中，植物乳杆菌KT-Lp9菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，干酪乳杆菌zhang菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌P-8菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g

进一步地，所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂的质量比分别为1-4：1-4：1-4：2-7。

优先选地，所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂的质量比分别为1：1：1：2。

本发明的另一目的在于提供上述提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂的制备：

分别将4株发酵菌种单独进行高密度发酵：分别取一环活化后的植物乳杆菌KT-Lp9、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9的斜面菌体，各自分别接种至MRS培养基中，在相同温度33～37℃，相同转速50～100rpm条件下培养18～24h，分别得到一级种子液；将培养好的一级种子液按接种量3％～10％(v/v)再次转接入MRS培养基进行二次活化，活化时间18～24h后得二级种子液；将二级种子液分别按照相同接种量3％～10％(v/v)分别各自接入到不同的发酵罐培养基中，温度均为33～37℃，转速均为50～100rpm，通风量均为0.3～1L/min，发酵全程调节发酵液相同pH值为5.6～6.2条件下培养8～12小时，分别得到植物乳杆菌KT-Lp9最终发酵液、干酪乳杆菌zhang最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液、动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液，将得到的上述最终发酵液分别经5000～12000rpm，5～15min离心收集菌体；

所述发酵罐培养基(g/L)：蔗糖50～80，酵母粉20～40，大豆蛋白胨8～20，MgSO₄.7H₂O1.5～2.0，MnSO₄.5H₂O 0.08～0.12，吐温-80 0.8～1.0，余量为水，pH7.0。

向经离心后的植物乳杆菌KT-Lp9、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9菌的菌体中分别按照各自菌体与保护剂溶液质量比1：(5～10)的比例添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，分别得到植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂；

(2)复配混合：

将所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂按比例进行混合，并加入稀释载体进行复配，制备活菌总数分别为2×10⁹CFU/g、4×10⁹CFU/g和1×10¹⁰CFU/g三种规格的复合益生菌剂；

经粉末包装机充氮气填充将所述复合益生菌剂进行分装，2g/袋。

进一步地，所述植物乳杆菌KT-Lp9最终发酵液、干酪乳杆菌zhang最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液以及动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液的各自活菌数均达到10¹⁰CFU/ml以上。

进一步地，所述保护剂溶液的配方如下(g/L)：脱脂乳粉30～35，脱盐乳清粉15～20，工业海藻糖15～20，维生素C3～4，卵磷脂0.05～0.08，余量为蒸馏水。

进一步地，所述稀释载体为脱脂乳粉。

进一步地，所述一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的用途，在每只犬的基础日粮中添加所述提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂，选择活菌总数为2×10⁹CFU/g或4×10⁹CFU/g或1×10¹⁰CFU/g复合益生菌剂的三种规格中的任意一种，添加量为2g/天，所述提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂添加温度低于40℃。

优选地，一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的用途，在每只幼犬、训练犬、老年犬的基础日粮中分别对应添加活菌含量为2×10⁹CFU/g、4×10⁹CFU/g和1×10¹⁰CFU/g的所述提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂。

进一步地，所述的一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的用途，在所述幼犬、训练犬、老年犬中，所述提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的添加量为2g/天，添加温度低于40℃。

所述植物乳杆菌KT-Lp9，已于2016年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.12950，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，该菌株分离自传统自然发酵酸牛奶乳中。具备优良的益生特性，研究表明该菌株具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常见肠道致病菌生长特性，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，可改善机体内的微生态环境、预防和治疗高脂血症。。

所述干酪乳杆菌zhang，已于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5469，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。该菌株是2001年分离自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗草原上自然发酵酸马奶(Komiss)中的一株具有优良益生特性的干酪乳杆菌。研究人员采用体外实验、动物模型和人体试验对菌株的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学、蛋白质组学和转录组学的手段对菌株的益生机制进行了深入剖析。目前已经证实菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，从而预防肠道致病菌感染，提高机体细胞免疫、体液免疫和肠黏膜局部免疫，调节血脂代谢、保护修复肝脏，增强机体抗氧化能力，抑制肿瘤细胞的生长，预防糖尿病。

所述植物乳杆菌P-8，已于2012年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.6312，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株是2003年从内蒙古自治区牧民家庭中的自然发酵酸牛奶中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株。研究采用体外实验、动物模型和人体试验对菌株的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学的手段对菌株的益生机制进行了深入剖析。目前已经证实菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，调节血脂代谢，对肝脏具有保护修复作用，提高机体免疫能力。

所述动物双歧杆菌乳亚种V9，已于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5470，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium lactis。Bifidobacterium lactis)。该菌株是2005年分离自内蒙古草原上健康蒙古族儿童肠道中的一株具有优良益生特性的动物双歧杆菌乳亚种。研究人员采用体外实验、动物模型和临床试验对菌株的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学的手段对菌株的益生机制进行了深入剖析。目前已经证实对菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，拮抗肠道致病菌，提高肠道抗致病菌感染能力，预防和缓减腹泻、便秘、腹痛、腹胀等肠易激综合症。

有益效果：

本发明提供的一种复合益生菌剂针对犬类，能够有效提高采食量和生长率，控制血液中白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数，不仅有效提升犬类机体内四钟免疫因子：血液中免疫球蛋白G、白细胞介素6、干扰素α和肿瘤坏死因子α的含量，而且有效提高了犬类粪便中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的含量，从而最终提高试验犬免疫力，降低腹泻发病率和发病程度。

经实验验证，实验组(在原饲料配方的基础上添加一定比例的复合益生菌剂)体温、脉搏、呼吸次数等基础指标均能与对照组保持一致，表明试验期间实验组表观上无副作用；血液中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞含量均呈现低于对照组的趋势，停用一段时间后仍能保持该水平，表明实验组机体炎性感染的程度有所降低；实验组中血液中免疫球蛋白G和干扰素α含量均显著高于对照组，白细胞介素6含量也高于对照组，停用一段时间后上述免疫因子含量仍能保持前述水平，表明实验组机的体液免疫和细胞免疫水平均得到明显提升；粪便中分泌型免疫球蛋白A含量显著高于对照组，该水平在停用一段时间后同样能得到保持，表明肠黏膜局部免疫水平得到明显提升。腹泻发病率及患病程度也均呈现实验组低于对照组。

由植物乳杆菌KT-Lp9、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9复配而成的复合益生菌剂，四钟菌剂均具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常见肠道致病菌生长特性，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，可改善机体内的微生态环境，其中植物乳杆菌KT-Lp9具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达81.57％。同时菌株KT-Lp9具有广谱抑制致病菌的优良特性，且抑菌效果十分显著，可预防和治疗高脂血症，由于植物乳杆菌KT-Lp9的加入，使得复合益生菌剂在高犬免疫力、降低腹泻发病率方面更具有显著性。

需要说明的是本发明的一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂及其制备和应用的技术效果是各组分相互协同、相互作用的结果，并非简单的原料功能的叠加，各原料组分的科学复配和提取，产生的效果远远超过各单一组份功能和效果的叠加，具有较好的先进性和实用性。

附图说明

图1：脉搏测定结果；

图2：呼吸次数测定结果；

图3：体温测定结果；

图4：采食量测定结果；

图5：体重测定结果；

图6：血常规测定结果(白细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞数)，其中图6-1：白细胞数量、6-2淋巴细胞数量、6-3中性粒细胞数量；

图7：血液中免疫球蛋白G检测结果(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)，其中7d为免疫球蛋白G标品浓度；

图8：血液中干扰素α检测结果(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)，其中8d为血液中干扰素α标品浓度；

图9：血液中白细胞介素6检测结果(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)，其中9d为血液中白细胞介素6的标品浓度；

图10：血液中肿瘤坏死因子α检测结果(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)，其中10d为血液中肿瘤坏死因子α的标品浓度；

图11：粪便中分泌型免疫球蛋白A检测结果(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)，其中11d为免疫球蛋白A的标品浓度；

图12：腹泻病发病率；

图13：腹泻病患病程度指数；

其中图1至图13中的a、b、c分别代表幼犬、训练犬、老年犬的数据检测结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1四种益生菌的制备

植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂的制备：

发酵罐培养基(g/L)：蔗糖50～80，酵母粉20～40，大豆蛋白胨8～20，MgSO₄.7H₂O1.5～2.0，MnSO₄.5H₂O 0.08～0.12，吐温-80 0.8～1.0，余量为水，pH7.0。

向经离心后的植物乳杆菌KT-Lp9、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9菌的菌体中分别按照各自菌体与保护剂溶液质量比1：(5～10)的比例添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将菌悬液经冷冻干燥，分别得到植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂。

保护剂溶液的配方如下(g/L)：脱脂乳粉30～35，脱盐乳清粉15～20，工业海藻糖15～20，维生素C 3～4，卵磷脂0.05～0.08，余量为蒸馏水。

植物乳杆菌KT-Lp9最终发酵液、干酪乳杆菌zhang最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液以及动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液的各自活菌数均达到10¹⁰CFU/ml以上。

植物乳杆菌KT-Lp9菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，干酪乳杆菌zhang菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌P-8菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g

实施例2一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的制备

复配混合：将由实施例1制备的植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂按质量比1：1：1：2进行混合，并加入稀释载体脱脂乳粉进行复配，制备活菌总数分别为2×10⁹CFU/g、4×10⁹CFU/g和1×10¹⁰CFU/g三种规格的复合益生菌剂；

经粉末包装机充氮气填充将复合益生菌剂进行分装，2g/袋。

实施例3一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的制备

复配混合：将由实施例1制备的植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂按质量比4：4：4：7进行混合，并加入稀释载体脱脂乳粉进行复配，制备活菌总数分别为2×10⁹CFU/g、4×10⁹CFU/g和1×10¹⁰CFU/g三种规格的复合益生菌剂；

经粉末包装机充氮气填充将复合益生菌剂进行分装，2g/袋。

实施例4一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的制备

复配混合：将由实施例1制备的植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂按质量比2.5：2.5：2.5：4进行混合，并加入稀释载体脱脂乳粉进行复配，制备活菌总数分别为2×10⁹CFU/g、4×10⁹CFU/g和1×10¹⁰CFU/g三种规格的复合益生菌剂；

经粉末包装机充氮气填充将复合益生菌剂进行分装，2g/袋。

实施例5一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的应用

利用实施例2制备的复合益生菌剂，在犬繁殖基地中，在每只犬的基础日粮中添加所述提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂，选择活菌总数为2×10⁹CFU/g复合益生菌剂，按照添加量为2g/只/天的剂量添加到犬的日粮中，每日中午喂食。拌料前从冰柜中取出复合益生菌剂，按照上述剂量直接添加到犬饲料中，充分搅拌后进行饲喂。复合益生菌剂加入时犬饲料温度低于40℃。

实施例6一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的应用

由犬训练和繁育基地选取不同年龄段犬96只，其中幼犬实验组和对照组各13只，训练犬两组各15只，老年犬两组各20只，所有试验犬均分组编号单笼饲养。对照组仍按照原饲料配方饲喂，实验组在原饲料配方中添加由实施例2制备的复合益生菌剂，其添加量为2g/只/天，其中幼犬选择活菌含量为2×10⁹CFU/g规格的复合益生菌剂，训练犬为4×10⁹CFU/g，老年犬为1×10¹⁰CFU/g，具体添加方法为每日早晨喂食时进行添加，拌料前从冰柜中取出复合益生菌剂，按照上述剂量直接添加到犬饲料中，充分搅拌后进行饲喂。复合益生菌剂加入时犬饲料温度低于40℃。

实施例7一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的应用效果实验例

1实验方法：

(1)试验犬腹泻病患病状况统计：使用前、试用期间和停用后一段时间对所有试验犬腹泻病患病情况进行统计记录。

(2)试验犬采食量变化统计：试验犬的实际喂量，即饲喂前饲料的重量减去摄食后剩料的重量。每次统计为试验犬全天2次采食的总量。

(3)试验犬体重变化统计：检测时，由训练员和饲养员配合将犬固定在体重称中央，记录犬体重。

(4)试验犬体温检测：在犬安静的状态下使用电子检温器检测犬的体温，检测部位为犬的耳蜗或后肢根部，检测员将电子检温器固定在检测部位约10秒，按下检测按钮进行检测并记录。

(5)试验犬脉搏检测：在犬安静的状态下进行检测，检测时，将犬适当的固定后，检测员位于犬的后侧方，一手握住后肢，一手伸入股内侧，用手指轻压股动脉检测，记录犬脉搏。

(6)试验犬呼吸次数检测：在犬安静的状态下进行检测，检测时，检测员站在犬胸部的前侧方观察犬胸部的起伏动作，一起一伏为一次呼吸，记录犬呼吸次数。

(7)试验犬血常规及血液中免疫因子检测：利用全自动流式血细胞计数仪进行血常规检测。离心，转速3000rpm，10min，获取血清，并采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对血清样品中的免疫球蛋白G、白细胞介素6、干扰素α和肿瘤坏死因子α，共4种免疫因子的含量进行检测。

(8)试验犬粪便样品采集及研究：采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对粪便样品中的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量进行检测。

2试验样品采集：

试验前对参加试验的96只犬进行采样，并统计上述指标。采样后实验组在原饲料配方的基础上按照上述方法添加本发明复合益生菌剂进行饲喂，对照组仍采用基地一直使用的饲料配方进行饲喂，持续食用30天后进行第二次采样，持续食用60天后进行第三次采样，停止添加使用复合益生菌剂，停用后10天后对训练犬实验组和对照组进行采样，停用后15天对幼犬和老年犬实验组和对照组进行采样。血液样品采集前试验犬禁食一夜，采血前，采样员佩戴医用手套和口罩将犬采血部位的毛剪掉，清除入针处皮上污物。用酒精进行消毒，并用洁净纸巾擦拭干净。采用抗凝采血管采集血液2-3毫升，迅速拔下抗凝采血管，保留采血针，插入普通采血管继续采集血液约2毫升，拔下普通采血管静置。将抗凝采血管交予另一个实验员上下颠倒血样管8-10次，使血液与抗凝剂充分混合，注意不能振动或用手指弹抗凝管。使用止血带进行止血并对2份血液样品进行编号。采血后立刻对抗凝采血管中的血样进行血常规检测，普通采血管血样进行离心获取血清，并进行上述免疫因子含量检测。粪便样品采样前，采样人员佩戴医用手套和口罩，在试验犬排便后立刻用一次性塑料小勺进行采集，采集时均匀采集粪便表面和内部部分，用力将粪便甩到采样管底部，共采集粪便样品20-25mL，加入适量保护剂后充分摇晃混匀，并对样品进行编号，置于液氮中速冻后暂存于-20℃冷柜，尽快送回实验室进行免疫因子检测。

3试验结果：

(1)脉搏测定

结果显示(图1)在试验过程中，训练犬和老年犬脉搏实验组和对照组并无明显差异，幼犬实验组脉搏数向成年犬水平靠近的趋势较快于对照组。并且，随着试验的推进，幼犬和训练犬脉搏均呈现降低的趋势，老年犬无明显变化。

(2)呼吸次数测定

结果显示(图2)在试验过程中，幼犬、训练犬和老年犬呼吸次数实验组和对照组均无明显差异。并且，随着试验的推进，幼犬和训练犬呼吸次数均呈现降低的趋势，老年犬无明显变化。

(3)体温测定

结果显示(图3)在试验过程中，幼犬、训练犬和老年犬组和对照组均无明显差异，并且随着试验的推进，犬体温较试验前也无明显变化。

(4)采食量测定

结果显示(图4)试验前幼犬、训练犬、老年犬的实验组和对照组平均采食量分别为1.51和1.22Kg/只/天；1.45和1.78Kg/只/天；1.31和1.25Kg/只/天。随着试验的推进，幼犬、训练犬和老年犬的平均采食量一直保持实验组高于对照组的趋势(试验30天，训练犬实验组低于对照组)。自实验前至复合微生物菌剂停用后15天的整个过程，实验组中，幼犬、训练犬的整体采食量均呈现上升趋势，而对照组则呈现出先上升后下降的不稳定趋势。说明复合微生物菌剂不仅显著提高幼犬、训练犬的采食量，而且使犬的采食量呈现稳定增长的趋势。

(5)体重测定

结果显示(图5)试验前幼犬、训练犬、老年犬的实验组和对照组平均体重分别为16.8和16.6Kg；25.3和26.0Kg；36.8和34.9Kg。随着试验的推进，幼犬和训练犬的平均体重一直呈现实验组高于对照组，幼犬更为明显；老年犬实验组和对照组平均体重变化较小。

(6)血常规测定

利用全自动流式血细胞计数仪对其血常规进行测定。临床上认为白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数与机体的免疫系统密切相关，能够反映机体炎性感染的情况。测定结果显示(图6)，随着试验的推进，幼犬、训练犬和老年犬实验组血液中白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数均低于对照组的趋势，说明实验组犬的炎性感染程度较弱于对照组。

(7)免疫因子的含量测定

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对试验犬血液样品中的免疫球蛋白G、白细胞介素6、干扰素α和肿瘤坏死因子α，粪便样品中的分泌型免疫球蛋白A共5种免疫因子的含量进行检测。

血液中免疫球蛋白G含量检测结果显示(图7)，试验前幼犬、训练犬、老年犬的实验组和对照组中免疫球蛋白G的含量分别为10.80mg/mL和10.76mg/mL；12.53mg/mL和12.45mg/mL；11.22mg/mL和11.56mg/mL。试验30天后，幼犬的实验组和对照组分别变为12.81mg/mL和11.04mg/mL；训练犬变为13.95mg/mL和12.45mg/mL；老年犬变为12.58mg/mL和11.71mg/mL。试验60天后，幼犬的实验组和对照组分别变为16.56mg/mL和11.10mg/mL，组间差异极显著(***P<0.001)；训练犬变为17.3mg/mL 6和13.41mg/mL，组间差异极显著(***P<0.001)；老年犬变为15.36mg/mL和12.65mg/mL，组间差异极显著(**P<0.01)。停止使用复合益生菌剂后N天后(训练犬N＝10；幼犬、老年犬N＝15)，幼犬的实验组和对照组分别变为16.62mg/mL和13.11mg/mL，组间差异极显著(**P<0.01)；训练犬变为16.74mg/mL和13.23mg/mL，组间差异极显著(***P<0.001)；老年犬变为14.62mg/mL和12.42mg/mL，组间差异显著(*P<0.05)。

干扰素α含量检测结果显示(图8)，试验前幼犬、训练犬、老年犬的实验组和对照组中干扰素α的含量分别为132.58mg/mL和133.09pg/mL；207.60mg/mL和210.11pg/mL；164.62mg/mL和163.27pg/mL。试验30天后，幼犬的实验组和对照组分别变为156.19mg/mL和141.62pg/mL；训练犬变为228.23mg/mL和212.46pg/mL；老年犬变为169.85mg/mL和164.41pg/mL。试验60天后，幼犬的实验组和对照组分别变为180.57mg/mL和154.59pg/mL；训练犬变为237.92mg/mL和193.32pg/mL，组间差异极显著(**P<0.01)；老年犬变为171.66mg/mL和159.91pg/mL。停止使用复合益生菌剂后N天后(训练犬N＝10；幼犬、老年犬N＝15)，幼犬的实验组和对照组分别变为195.72mg/mL和170.69pg/mL；训练犬变为228.20mg/mL和191.42pg/mL，组间差异显著(*P<0.05)；老年犬变为166.85mg/mL和156.91pg/mL。

白细胞介素6含量检测结果显示(图9)，试验前幼犬、训练犬、老年犬的实验组和对照组中白细胞介素6的含量分别为242.25mg/mL和247.02pg/mL；279.58mg/mL和292.04pg/mL；272.05mg/mL和270.78pg/mL。试验30天后，幼犬的实验组和对照组分别变为244.20mg/mL和253.48pg/mL；训练犬变为279.58mg/mL和292.04pg/mL；老年犬变为259.01mg/mL和265.91pg/mL。试验60天后，幼犬的实验组和对照组分别变为269.45mg/mL和259.62pg/mL；训练犬变为304.29和284.28pg/mL，组间差异显著(*P<0.05)；老年犬变为274.01mg/mL和262.62pg/mL。停止使用复合益生菌剂后N天后(训练犬N＝10；幼犬、老年犬N＝15)，幼犬的实验组和对照组分别变为264.91mg/mL和258.35pg/mL；训练犬变为292.33mg/mL和280.60pg/mL；老年犬变为269.09mg/mL和263.96pg/mL。

肿瘤坏死因子α含量检测结果显示(图10)，试验前幼犬、训练犬、老年犬的实验组和对照组中肿瘤坏死因子α的含量分别为28.39mg/mL和28.53pg/mL；34.45mg/mL和34.93pg/mL；33.12mg/mL和33.18pg/mL。试验30天后，幼犬的实验组和对照组分别变为29.07mg/mL和29.54pg/mL；训练犬变为35.33mg/mL和34.69pg/mL；老年犬变为32.23mg/mL和32.30pg/mL。试验60天后，幼犬的实验组和对照组分别变为33.84mg/mL和30.32pg/mL；训练犬变为33.29mg/mL和33.87pg/mL；老年犬变为28.94mg/mL和29.42pg/mL。停止使用复合益生菌剂后N天后(训练犬N＝10；幼犬、老年犬N＝15)，幼犬的实验组和对照组分别变为32.83mg/mL和30.02pg/mL；训练犬变为33.68mg/mL和33.23pg/mL；老年犬变为29.04mg/mL和29.00pg/mL。

粪便中分泌型免疫球蛋白A含量检测结果显示(图11)，试验前幼犬、训练犬、老年犬的实验组和对照组中免疫球蛋白G的含量分别为15.56mg/mL和15.00mg/mL；25.19mg/mL和24.58mg/mL；22.23mg/mL和22.16mg/mL。试验30天后，幼犬的实验组和对照组分别变为21.27mg/mL和19.78mg/mL，组间差异极显著(**P<0.01)；训练犬变为28.74mg/mL和27.52mg/mL，组间差异显著(*P<0.05)；老年犬变为24.14mg/mL和22.27mg/mL，组间差异极显著(**P<0.01)。试验60天后，幼犬的实验组和对照组分别变为32.82mg/mL和23.93mg/mL，组间差异极显著(***P<0.001)；训练犬变为47.65mg/mL和35.08mg/mL，组间差异极显著(***P<0.001)；老年犬变为24.71mg/mL和21.05mg/mL，组间差异极显著(***P<0.001)。停止使用复合益生菌剂后N天后(训练犬N＝10；幼犬、老年犬N＝15)，幼犬的实验组和对照组分别变为33.69mg/mL和25.14mg/mL，组间差异极显著(***P<0.001)；训练犬变为48.58mg/mL和35.13mg/mL，组间差异极显著(***P<0.001)；老年犬变为23.52mg/mL和21.10mg/mL，组间差异极显著(***P<0.001)。可见，随着试验的推进，幼犬、训练犬和老年犬实验组犬粪便中分泌型免疫球蛋白A的含量均显著高于对照组。

(8)犬腹泻发病情况统计

犬腹泻发病情况统计结果显示(图12)，试验前幼犬、训练犬、老年犬的实验组和对照组腹泻发病率分别为58％和58％；73％和26％；40％和40％。试验30天后，幼犬的实验组和对照组分别变为17％和50％；训练犬变为20％和32％；老年犬变为0％和40％，即实验组腹泻患病老年犬已全部康复。试验60天后，幼犬的实验组和对照组仍保持试验30天的腹泻发病率；训练犬变为7％和16％；老年犬的实验组和对照组仍保持试验30天的腹泻发病率。停止使用复合益生菌剂后N天后(训练犬N＝10；幼犬、老年犬N＝15)，实验组和对照组仍保持试验60天的腹泻发病率。此外，对照组55号幼犬患习惯性腹泻、104号训练犬患急性肠道痉挛，均在试验中期死亡；实验组犬无死亡情况。为了对实验组和对照组犬整体患病程度进行进一步比较，我们将每只犬的患病程度转化为数字(即：无腹泻0；轻度腹泻1；中度腹泻2；重度腹泻3)，并进行组内累加，将得出的值暂称为腹泻患病指数，结果显示(图13)：试验前幼犬、训练犬、老年犬的实验组和对照组腹泻患病指数分别为13和9；16和9；10和9。试验30天后，幼犬的实验组和对照组分别变为2和8；训练犬变为4和10；老年犬变为0和7。试验60天后，幼犬的实验组和对照组仍为2和8；训练犬变为1和5；老年犬变为0和3。停止使用复合益生菌剂后N天后(训练犬N＝10；幼犬、老年犬N＝15)，幼犬的实验组和对照组仍为2和7；训练犬仍为1和5；老年犬仍为0和3。

综上所述，实验组(在原饲料配方的基础上添加一定比例的复合益生菌剂)体温、脉搏、呼吸次数等基础指标均能与对照组保持一致，表明试验期间实验组表观上无副作用；血液中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞含量均呈现低于对照组的趋势，停用一段时间后仍能保持该水平，表明实验组机体炎性感染的程度有所降低；血液中免疫球蛋白G和干扰素α含量均显著高于对照组，白细胞介素6含量也高于对照组，停用一段时间后上述免疫因子含量仍能保持前述水平，表明实验组机的体液免疫和细胞免疫水平均得到明显提升；粪便中分泌型免疫球蛋白A含量显著高于对照组，该水平在停用一段时间后同样能得到保持，表明肠黏膜局部免疫水平得到明显提升。腹泻发病率及患病程度也均呈现实验组低于对照组。

需要说明的是：本发明实施例3-4制备的一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大。

实施例8植物乳杆菌KT-Lp9耐酸、耐胆盐特性及其抑菌特性实验

将冷冻保存的植物乳杆菌KT-Lp9接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养18h，如此传代培养2次得到活化发酵液；

所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

耐酸、耐胆盐特性：

在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS缓冲液中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液；将活化好的菌株离心收集菌体，加入与培养基等量的pH2.5模拟胃液，37℃培养3h，于0h、3h用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。

在pH8.0(用0.1mol/L NaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液；将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃培养，于4h、8h用MRS琼脂培养基倾注法测活菌数，试验结果见表1：

存活率＝[N₁/N₀]×100％(N₀－0h活菌数；N₁－经模拟肠、胃液消化后的活菌数)

表1KT-Lp9人工模拟胃液和肠液的存活率

抑菌特性：

用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定植物乳杆菌KT-Lp9发酵液的抑菌效果：将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(10⁶cfu/ml)一起倒入平板混匀。待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。

每孔加入100μL植物乳杆菌KT-Lp9发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果见表2：

表2KT-Lp9发酵液中苯乳酸、4-羟基苯乳酸含量和抑菌特性

注：打孔器直径为8mm

由表1、表2试验结果可知，KT-Lp9菌株具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达81.57％。同时菌株KT-Lp9具有广谱抑制致病菌的优良特性，且抑菌效果十分显著。

Claims

1.一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂，由植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂以及稀释载体混合复配，其中，植物乳杆菌KT-Lp9菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，干酪乳杆菌zhang菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌P-8菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g；所述植物乳杆菌KT-Lp9，保藏号为CGMCC No.12950，所述干酪乳杆菌zhang，保藏号为CGMCC No.5469，所述植物乳杆菌P-8，保藏号为CGMCC No.6312，所述动物双歧杆菌乳亚种V9，保藏号为CGMCC No.5470。

2.如权利要求1所述的一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂，其特征在于：所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂的质量比分别为1-4：1-4：1-4：2-7。

3.如权利要求1所述的一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂，其特征在于：所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂的质量比分别为1：1：1：2。

4.如权利要求1-3任一所述的一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂的制备：

分别将4株发酵菌种单独进行高密度发酵：分别取一环活化后的植物乳杆菌KT-Lp9、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9的斜面菌体，各自分别接种至MRS培养基中，在相同温度33~37℃，相同转速50~100rpm条件下培养18～24h，分别得到一级种子液；将培养好的一级种子液按接种量3%~10%（v/v）再次转接入MRS培养基进行二次活化，活化时间18~24h后得二级种子液；将二级种子液分别按照相同接种量3%~10%（v/v）分别各自接入到不同的发酵罐培养基中，温度均为33~37℃，转速均为50~100rpm，通风量均为0.3~1L/min，发酵全程调节发酵液相同pH值为5.6～6.2条件下培养8～12小时，分别得到植物乳杆菌KT-Lp9最终发酵液、干酪乳杆菌zhang最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液、动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液，将得到的上述最终发酵液分别经5000～12000rpm，5~15min离心收集菌体；

所述发酵罐培养基（g/L）：蔗糖50～80，酵母粉20～40，大豆蛋白胨8～20，MgSO₄·7H₂O1.5～2.0，MnSO₄·5H₂O 0.08～0.12，吐温-80 0.8～1.0，余量为水，pH7.0；

向经离心后的植物乳杆菌KT-Lp9、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9菌的菌体中分别按照各自菌体与保护剂溶液质量比1：（5～10）的比例添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，分别得到植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂；

（2）复配混合：

将所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂按比例进行混合，并加入稀释载体进行复配，制备活菌总数分别为2×10⁹CFU/g、4×10⁹ CFU/g和1×10¹⁰ CFU/g三种规格的复合益生菌剂；

经粉末包装机充氮气填充将所述复合益生菌剂进行分装。

5.如权利要求4所述一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于：所述植物乳杆菌KT-Lp9最终发酵液、干酪乳杆菌zhang最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液以及动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液的各自活菌数均达到10¹⁰CFU/ml以上。

6.如权利要求4所述一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于：所述保护剂溶液的配方如下(g/L)：脱脂乳粉30~35，脱盐乳清粉15~20，工业海藻糖15~20，维生素C 3~4，卵磷脂0.05~0.08，余量为蒸馏水。

7.如权利要求4所述一种提高宠物犬免疫力的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于：所述稀释载体为脱脂乳粉。