CN112342160A - 一种植物乳杆菌及其在宠物犬犬粮中的应用 - Google Patents

一种植物乳杆菌及其在宠物犬犬粮中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于微生物育种技术领域，提供了一株植物乳杆菌，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌PLBS002，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16942；本发明还提供了一株植物乳杆菌在宠物犬犬粮中的应用。借此，本发明的植物乳杆菌PLBS002具有较好的热稳定性、酸稳定性，在宠物犬日粮中添加适宜水平的植物乳杆菌PLBS002，能够提高宠物犬的平均日增重，提高血清中TP、ALB含量，降低料重比，降低血清中BUN、TC的含量及ALT、AST的活性，提高宠物犬生长性能和经济效益。

Description

一种植物乳杆菌及其在宠物犬犬粮中的应用
技术领域
本发明涉及微生物育种技术领域，尤其涉及一种植物乳杆菌及其在宠物犬犬粮中的应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，许多家庭都将犬作为首选宠物来驯养。作为生活中的一员，宠物犬具有温和的性格、可爱的外形、聪明等优点，适合于城市单元式楼房及农村饲养，因此，宠物犬成为人们的重要的伴侣动物。家养宠物主要的品种有金毛、拉布拉多、哈巴犬、哈士奇、贵妇犬、博美犬等，其中金毛宠物犬外观漂亮、性格温和、开朗，对老人、小孩儿也很友好，金毛作为重要的宠物犬被广泛养殖。
益生菌主要存在于动物和人的体内消化道等器官组织中一类有益的活性微生物物质，植物乳杆菌是一种源自人类肠道的革兰氏阳性菌，具有抗炎特性和保护肠道屏障作用，能够调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖，同时植物乳杆菌能分泌抗生物素类物质，对肠道致病菌产生拮抗作用，可改善动物肠道微生态平衡、促进生长及预防疾病；还耐受酸和胆汁、消除乳糖不耐症、降低胆固醇、抑制并治疗腹泻及增强机体免疫等。但是，关于植物乳杆菌在宠物犬养殖过程中的应用报道的较少。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌，具有较好的热稳定性、酸稳定性，在宠物犬日粮中添加适宜水平的植物乳杆菌PLBS002，能够提高宠物犬的平均日增重，提高血清中TP、ALB含量，降低料重比，降低血清中BUN、TC的含量及ALT、AST的活性，提高宠物犬生长性能和经济效益。
为了实现上述目的，本发明提供一株植物乳杆菌，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌PLBS002，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.16942。
根据本发明的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌取自牛乳。
根据本发明的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌在宠物犬的基础日粮中的添加量为80～450mg/kg。
根据本发明的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌在宠物犬的基础日粮中的添加量为205～342mg/kg。
根据本发明的植物乳杆菌，本发明还提供一种筛选植物乳杆菌的方法，包括以下步骤：
步骤一 混合菌株的稀释
将牛乳放入MRS固体培养基培养，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液；
步骤二 菌株初筛
采用溶钙圈法，取不同梯度的所述稀释液涂布于MRS初筛培养基中培养，挑取具有透明溶钙圈的单菌落划线，获得形态单一的初筛菌落；
步骤三 菌株复筛
将所述初筛菌落接种于MRS培养基继续培养，收集上清液，用滤膜过滤除菌，制备无菌上清液；
制备指示菌平板，然后在牛津杯中添加所述无菌上清液，预扩散后继续培养，测定抑菌圈大小，筛选抑菌活力高的菌株为复筛菌株。
根据本发明筛选植物乳杆菌的方法，所述MRS固体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，七水硫酸镁0.58g/L，四水硫酸锰0.25g/L，吐温801mlg/L，蒸馏水1L。
根据本发明筛选植物乳杆菌的方法，所述步骤三中，所述滤膜选用0.22μm滤膜。
根据本发明的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌在宠物犬犬粮中的应用。
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌，本发明提供的植物乳杆菌PLBS002，具有较好的热稳定性、酸稳定性，可以较好地抑制革兰氏阳性菌单增李斯特氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌和和革兰氏阴性菌福氏志贺氏菌，但是对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌无抑制作用。在宠物犬日粮中添加适宜水平的植物乳杆菌PLBS002，能够提高宠物犬的平均日增重，提高血清中TP、ALB含量，降低料重比，降低血清中BUN、TC的含量及ALT、AST的活性，提高宠物犬生长性能和经济效益。
附图说明
图1是本发明植物乳杆菌PLBS002的菌落形态图；
图2是本发明植物乳杆菌PLBS002的生长曲线图；
图3是本发明植物乳杆菌PLBS002的热稳定性试验图；
图4是本发明植物乳杆菌PLBS002的酸稳定性试验图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一株植物乳杆菌，拉丁文学名：Lactobacillus plantarum；该植物乳杆菌为植物乳杆菌PLBS002，已于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.16942。
本发明的植物乳杆菌取自牛乳，本发明提供了植物乳杆菌PLBS002的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一 混合菌株的稀释
将牛乳放入MRS固体培养基37℃培养24小时，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液。
MRS固体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，七水硫酸镁0.58g/L，四水硫酸锰0.25g/L，吐温801mlg/L，蒸馏水1L，115℃灭菌20分钟。
步骤二 菌株初筛
采用溶钙圈法，取不同梯度的稀释液涂布于MRS初筛培养基中，37℃培养24～36h，挑取具有透明溶钙圈的单菌落划线，获得形态单一的初筛菌落。
步骤三 菌株复筛
将初筛菌落接种于MRS培养基，37℃培养24h，8000r/min离心10min，收集上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌，制备无菌上清液。
以S.aureus ATCC14458为指示菌，在营养琼脂培养基中添加S.aureus ATCC14458菌液，终浓度为106CFU/mL，制备指示菌平板，采用牛津杯琼脂扩散法，牛津杯中添加无菌上清液50μL，4℃冰箱预扩散10h后于37℃培养14h，测定抑菌圈大小，筛选抑菌活力高的菌株为复筛菌株。
本发明还提供了植物乳杆菌PLBS002的鉴定方法，包括形态学鉴定和基因序列鉴定。
形态学鉴定
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对复筛菌株进行形态观察和生理生化鉴定。
(参见图1)
由图1可知，菌落边缘整齐无锯齿状，呈乳白色，表面光滑不透明。
基因序列鉴定
将复筛菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，根据得到的16S r RNA序列信息与NCBI的16S数据库进行比对，设置参数identify>95。然后选取identify最高的前30条16S r RNA序列(不足则全取)，并利用muscle软件进行序列多重比对后，采用FastTree软件构件系统发育树。结果显示，复筛菌株与已发表的植物乳杆菌Lactobacillusplantarum subsp.plantarum最接近。因此，将复筛菌株归为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌PLBS002。
为了验证本发明的植物乳杆菌PLBS002的菌株性质，本发明进行了菌株性质试验，包括菌株的生长曲线、热稳定性、酸稳定性和抑菌活性试验。
菌株的生长曲线
将复筛菌株接种于MRS培养基上，37℃恒温培养，每隔一定时间取样，分别涂布到平板上，测定活菌数，绘制菌株生长曲线。(参见图2)
由图2可知，植物乳杆菌PLBS002在MRS培养基中生长迅速；在0～24h生长迅速，呈指数增长，24～36h生长缓慢，基本保持稳定；随着培养时间的延长，菌株生长产酸，pH不断降低，36h后菌株数量开始下降。
菌株的热稳定性
将复筛菌株的发酵上清液，分别在4、25、50和100℃处理30min，121℃下处理20min(使用灭菌锅处理)。处理完成后立即进行抑菌试验。(参见图3)
由图3可知，不同温度处理后，复筛菌株的抑菌性无显著性差异。121℃处理20min后，复筛菌株的抑菌性无明显下降。说明植物乳杆菌PLBS002的热稳定性较好，一般的热加工对植物乳杆菌PLBS002的抑菌性影响不大。
菌株的酸稳定性
用3mol/L NaOH溶液将复筛菌株的发酵上清液pH调节至4.0、5.0、6.0和7.0，并保持30min，处理结束后采用打孔法测试抑菌活性。(参见图4)
由图4可知，随着pH的逐渐升高，复筛菌株发酵上清液的抑菌性逐渐下降，在pH中性条件下，复筛菌株发酵上清液仍有良好的抑菌性，说明植物乳杆菌PLBS002的发酵上清液具有良好的酸稳定性。
菌株的抑菌活性
分别以单增李斯特氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为指示菌做抑菌试验，验证复筛菌株对食品中常见革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌效果。(参见表一)
该复筛菌株产生的抑菌物质对7株指示菌中的4株有抑制作用，可以较好地抑制革兰氏阳性菌单增李斯特氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌和和革兰氏阴性菌福氏志贺氏菌，但是对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌无抑制作用。
表一 复筛菌株的抑菌普
Figure BDA0002766951980000061
抑菌圈直径+++为19～24mm，++为15～18mm，+为10～14mm，—为无抑菌效果。
由于植物乳杆菌PLBS002具有较好的热稳定性、酸稳定性，因此，本发明将植物乳杆菌PLBS002应用于宠物犬犬粮中，为了验证本发明的植物乳杆菌PLBS002在宠物犬犬粮中的应用价值，本发明还提供一株植物乳杆菌在宠物犬犬粮中的应用方法。
一、试验动物及饲养管理
试验采用完全随机分组设计，选用体重相近的2月龄金毛宠物犬60只，随机分为4组(对照组和三个试验组)。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮基础上添加植物乳杆菌PLBS002。
试验期间金毛宠物犬15min内自由采食、自由饮水，每日7：30和14：30，定期打扫卫生，定期对金毛宠物犬驱虫和疫苗免疫。预试验为7d，试验期28d。
基础饲粮参照AAFCO(2008)生长犬营养需要配比基础日粮，配制基础日粮。
二、犬粮配方
在宠物犬的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS002，添加量为80～450mg/kg。
三、测定指标
生长性能的测定：在试验期间，对试验宠物犬空腹称重，记录试验宠物犬的试验初始重、试验末重、饲料的耗料量。计算各个试验组的宠物犬的平均日增重和饲料转化率等。
血清生化指标的测定：在试验结束断料12h，每个试验组随机抽取5只宠物犬采集血液3mL，分离血清，测定血清中的总蛋白TP、白蛋白ALB、谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST、总胆固醇TC、尿素BUN等生化指标含量。
为了进一步验证本发明的植物乳杆菌PLBS002在宠物犬犬粮中的应用价值，本发明以上述应用方法饲养宠物犬，设置如下若干实施例，并对各实施例中宠物犬的相关指标进行测定。各实施例中宠物犬的饲养管理方法相同，仅改变实施例中植物乳杆菌PLBS002的添加量，因此，各实施例中相同的内容不再列出。
各实施例中植物乳杆菌PLBS002的添加量见表二；各实施例中宠物犬的相关指标结果见表三、表四。
对比例
在宠物犬的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS002，添加量为0。
养殖完成后，测得宠物犬的平均日增重为46.28g，料重比为2.91；测得宠物犬血清中TP的含量为45.13g/L，ALB的含量为15.83g/L，ALT和AST的活性分别为8.23mmol/L、173.64mmol/L，BUN的含量为0.78mmol/L，TC的含量为5.78mmol/L。
实施例1
在宠物犬的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS002，添加量为205mg/kg。
养殖完成后，测得宠物犬的平均日增重为78.57g，料重比为2.60；测得宠物犬血清中TP的含量为48.13g/L，ALB的含量为17.44g/L，ALT和AST的活性分别为6.23mmol/L、152.69mmol/L，BUN的含量为0.59mmol/L，TC的含量为4.82mmol/L。
实施例2
在宠物犬的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS002，添加量为267mg/kg。
养殖完成后，测得宠物犬的平均日增重为82.14g，料重比为2.62；测得宠物犬血清中TP的含量为49.06g/L，ALB的含量为17.17g/L，ALT和AST的活性分别为6.47mmol/L、155.84mmol/L，BUN的含量为0.62mmol/L，TC的含量为4.75mmol/L。
实施例3
在宠物犬的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS002，添加量为342mg/kg。
养殖完成后，测得宠物犬的平均日增重为81.43g，料重比为2.58；测得宠物犬血清中TP的含量为48.51g/L，ALB的含量为17.36g/L，ALT和AST的活性分别为5.95mmol/L、153.07mmol/L，BUN的含量为0.60mmol/L，TC的含量为4.80mmol/L。
由于各实施例的实施过程均相同，因此，其他实施例的具体过程不再列出，仅列出上述三个效果较好的实施例。
表二 各实施例中植物乳杆菌PLBS002的添加量mg/kg
Figure BDA0002766951980000091
表三 宠物犬的生长性能
Figure BDA0002766951980000092
表四 宠物犬的血清生化指标
Figure BDA0002766951980000101
由上述实施例可以看出，在宠物犬的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS002，能够提高宠物犬的平均日增重，降低料重比，说明植物乳杆菌PLBS002能够抑制需氧性致病菌群的生长繁殖，促进食物在宠物犬肠道内的消化吸收，提高饲料转化率，促进宠物犬生长，提高宠物犬的经济效益。
由上述实施例可以看出，在宠物犬的基础日粮中添加本发明的植物乳杆菌PLBS002，能够提高宠物犬血清中TP、ALB含量，降低血清中BUN、TC的含量及ALT、AST的活性，说明植物乳杆菌PLBS002能够降低肝、肾损伤，提高肝、肾代谢功能，提高营养物质在动物体内的代谢水平，尤其饲料中的蛋白质和脂肪的代谢水平。
另外，通过上述实施例可以看出，在宠物犬的基础日粮中添加植物乳杆菌PLBS002的添加量为205～342mg/kg时，宠物犬平均日增重最高，料重比最低，血清中TP、ALB含量较高，BUN、TC的含量及ALT、AST的活性较低，因此，在宠物犬的基础日粮中，植物乳杆菌PLBS002的最适添加量为205～342mg/kg。
综上所述，本发明提供的植物乳杆菌PLBS002，具有较好的热稳定性、酸稳定性，可以较好地抑制革兰氏阳性菌单增李斯特氏菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌和和革兰氏阴性菌福氏志贺氏菌，但是对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌无抑制作用。在宠物犬日粮中添加适宜水平的植物乳杆菌PLBS002，能够提高宠物犬的平均日增重，提高血清中TP、ALB含量，降低料重比，降低血清中BUN、TC的含量及ALT、AST的活性，提高宠物犬生长性能和经济效益。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一株植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌PLBS002，于2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO.16942。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌取自牛乳。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌在宠物犬的基础日粮中的添加量为80～450mg/kg。
4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌在宠物犬的基础日粮中的添加量为205～342mg/kg。
5.一种筛选权利要求1所述的植物乳杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一混合菌株的稀释
将牛乳放入MRS固体培养基培养，并进行菌株的梯度稀释，得到不同梯度的稀释液；
步骤二菌株初筛
采用溶钙圈法，取不同梯度的所述稀释液涂布于MRS初筛培养基中培养，挑取具有透明溶钙圈的单菌落划线，获得形态单一的初筛菌落；
步骤三菌株复筛
将所述初筛菌落接种于MRS培养基继续培养，收集上清液，用滤膜过滤除菌，制备无菌上清液；
制备指示菌平板，然后在牛津杯中添加所述无菌上清液，预扩散后继续培养，测定抑菌圈大小，筛选抑菌活力高的菌株为复筛菌株。
6.根据权利要求5所述的筛选所述植物乳杆菌的方法，其特征在于，所述MRS固体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，七水硫酸镁0.58g/L，四水硫酸锰0.25g/L，吐温801mlg/L，蒸馏水1L。
7.根据权利要求5所述的筛选所述植物乳杆菌的方法，其特征在于，所述步骤三中，所述滤膜选用0.22μm滤膜。
8.一种根据权利要求1所述的植物乳杆菌在宠物犬犬粮中的应用。
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