CN107964520B - 一种复合乳酸菌微生态制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种复合乳酸菌微生态制剂及其制备方法与应用，所述复合乳酸菌微生态制剂由植物乳杆菌LP6菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P‑8菌剂、动物双歧杆菌V9菌剂以及稀释载体混合复配，四种菌剂的活菌数均≥2×1011CFU/g。使用活菌含量为1×109CFU/g的复合乳酸菌微生态制剂对不同品种的30只宠物猫进行试用30天，能够提升宠物猫的健康水平，主要表现为：能够有效控制宠物猫腹泻发病率、优化精神状态和皮毛状态、减轻掉毛程度、减少粪便中氨浓度含量、减轻猫砂气味，明显提高采食量和生长率，显著提高宠物猫血液中免疫球蛋白G的含量及粪便中分泌型免疫球蛋白A的含量。

Description

一种复合乳酸菌微生态制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合乳酸菌微生态制剂及其制备方法与应用。
背景技术
随着国民生活水平的日益提高，家庭饲养宠物猫由过去部分高收入人群的小众专享逐渐变得普遍化、大众化，不论是狸花猫、狮子猫、三花猫等本土猫品种，还是短毛猫、波斯猫、巴厘猫和折耳猫等国外猫品种，均能够给不同年龄段的人带来有益的作用，例如小孩饲喂宠物猫能够从小培养他们的爱心、责任心以及独立思考的能力；中年人饲喂宠物猫能够在一定程度上释放工作和生活的压力，放松心情；老年人饲喂宠物猫能够缓减孤独感，充实闲暇生活，提升身心愉悦程度。
作为一种小型杂食性动物，不论是本土猫品种还是国外猫品种均存在体质弱、生长缓慢、免疫力差、肠道问题多、传染病感染率高等特点，最终导致宠物猫死亡率高。大多数宠物医生主要依靠抗生素类药物进行改善和治疗，长期以往必然增加宠物猫肠道种耐药菌株种类和数量增多，同时影响肠道菌群结构和多样性，使得后续的治疗难度变得更大。体质弱的宠物猫采食欲望较差，精神萎靡，皮毛顺滑度相对较差，并且会出现惯性腹泻，根据研究证实乳杆菌和双歧杆菌联用能够刺激动物食欲，提高采食量，增强免疫力，改善腹泻程度。但单一菌种系统性差，不能实现多角度、全方位、多功能调控宠物猫肠道菌群结构。
因此，需要开发一种能够全方向提升宠物健康水平的产品。
发明内容
为解决上述技术问题，本申请提出一种复合乳酸菌微生态制剂及其制备方法与应用，以解决单一菌种系统性差，不能实现多角度、全方位、多功能调控宠物猫肠道菌群结构的问题。
第一方面，提供一株分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP6，其微生物保藏编号CGMCC No.13458。
第二方面，提供一种复合乳酸菌微生态制剂，包括植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LP6，其保藏编号为CGMCC No.13458；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和动物双岐杆菌(Bifidobacterium animalis)。
结合第二方面，在第二方面第一种可能的实现方式中，植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥2.0×1011CFU/g，干酪乳杆菌的有效活菌数≥2.0×1011CFU/g，植物乳杆菌的有效活菌数≥2.0×1011CFU/g，动物双岐杆菌的有效活菌数为≥2.0×1011CFU/g。
结合第二方面第一种可能实现的方式，在第二方面第二种可能的实现方式中，所述复合乳酸菌微生态制剂中总有效活菌数为≥1.0×109CFU/g，优选为2.0×109CFU/g。
结合第二方面第二种可能实现的方式，在第二方面第三种可能的实现方式中，还包括保护剂，所述保护剂组分包括：脱脂乳粉30-35g/L，脱盐乳清粉15-20g/L，工业海藻糖15-20g/L，维生素C 3-4g/L，卵磷脂0.05-0.08g/L，余量为蒸馏水，PH值7.0±0.2；
优选地，所述保护剂组分包括：脱脂乳粉32g/L，脱盐乳清粉18g/L，工业海藻糖18g/L，维生素C 3.5g/L，卵磷脂0.06g/L，余量为蒸馏水，PH值7.0；
和/或，所述复合乳酸菌微生态制剂中保护剂的重量百分含量为8-40％，优选为30％。
结合第二方面至第二方面第三种任一可能实现的方式，在第二方面第四种可能的实现方式中，所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌zhang，其保藏编号为CGMCC No.5469；植物乳杆菌为植物乳杆菌P-8，其保藏编号为CGMCC No.6312；动物双岐杆菌为动物双歧杆菌V9，其保藏编号为CGMCC No.5470。
第三方面，提供一种复合乳酸菌微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌分别进行一级发酵，得到对应的一级种子培养液；
步骤2，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌的一级种子培养液分别进行二级发酵，得到对应的二级种子培养液；
步骤3，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌的二级种子培养液分别接种于不同的发酵培养基中进行三级发酵，得到对应的三级发酵培养液；
步骤4，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌的三级发酵培养液分别离心，得到植物乳杆菌LP6菌体、干酪乳杆菌菌体、植物乳杆菌菌体和动物双岐杆菌菌体；
步骤5，将植物乳杆菌LP6菌体、干酪乳杆菌菌体、植物乳杆菌菌体和动物双岐杆菌菌体分别与保护剂溶液按质量比例1：5-10混合，得到菌悬液，所述菌悬液通过冷冻干燥，得到植物乳杆菌LP6菌剂、干酪乳杆菌菌剂、植物乳杆菌菌剂和动物双岐杆菌菌剂；
步骤6，将植物乳杆菌LP6菌剂、干酪乳杆菌菌剂、植物乳杆菌菌剂和动物双岐杆菌菌剂按质量比例1-4：1-4：1-4：2-7混合，并与稀释载体复配，得到复合乳酸菌微生态制剂。
结合第三方面，在第三方面第一种可能的实现方式中，所述一级种子培养液中植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥2.0×109CFU/g，干酪乳杆菌的有效活菌数≥2.0×109CFU/g，植物乳杆菌的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，动物双岐杆菌的有效活菌数为≥1.0×109CFU/g；
所述二级种子培养液中植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，干酪乳杆菌的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，植物乳杆菌的有效活菌数≥2.0×109CFU/g，动物双岐杆菌的有效活菌数为≥1.0×109CFU/g；
所述三级发酵培养液中植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，干酪乳杆菌的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，植物乳杆菌的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，动物双岐杆菌的有效活菌数为≥1.0×109CFU/g。
结合第三方面，在第三方面第二种可能的实现方式中，所述一级发酵的发酵条件包括：植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌分别在温度33-37℃，转速50-100r/m条件下培养18-24h；
所述二级发酵的发酵条件包括：植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌的一级种子培养液分别在温度33-37℃，转速50-100r/m条件下培养18-24h；
所述三级发酵的发酵条件包括：植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌的二级种子培养液分别在温度均33-37℃，转速50-100r/m，通风量0.3-1L/min，发酵全程调节发酵液相同pH值为5.6-6.2条件下培养8-12h。
第四方面，本申请还提供上述复合乳酸菌微生态制剂在制备宠物饲料或制备宠物饲料添加剂中的应用，或在宠物饲养中非治疗目的的应用。
第五方面，本申请还提供含有上述复合乳酸菌微生态制剂的宠物饲料或宠物饲料添加剂。
本申请中所述的复合乳酸菌微生态制剂具有较强的抗逆性，能够耐受胃酸、胆盐以及高温环境，能够保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达90％以上，其稳定性好，适合宠物应用。
本申请的有益效果：
1、本申请所述的复合乳酸菌微生态制剂由植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9复配而成，四种菌剂均具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常见肠道致病菌生长特性，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，可改善机体内的微生态环境，其中植物乳杆菌LP6还可预防和治疗高脂血症。
2、本申请所述的复合乳酸菌微生态制剂针对宠物猫，能够有效控制腹泻发病率、优化精神状态和皮毛状态、减轻掉毛程度、减少粪便中氨浓度含量、减轻猫砂气味，明显提高采食量和生长率，显著提高宠物猫血液中免疫球蛋白G的含量及粪便中分泌型免疫球蛋白A的含量。
3、本申请所述的复合乳酸菌微生态制剂中各乳酸菌菌株相互协同、相互作用的结果，并非简单的菌株功能的叠加，各原料组分的科学复配和提取，产生的效果远远超过各单一组份功能和效果的叠加，具有较好的先进性和实用性。
附图说明
图1：部分实验组宠物猫试验前后照片；
图2：试验宠物猫粪便氨浓度检测结果；
图3：试验宠物猫采食量检测结果；
图4：试验宠物猫平均体重检测结果；
图5：试验宠物猫血液中免疫球蛋白G的检测结果(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；
图6：试验宠物猫粪便中分泌型免疫球蛋白A的检测结果(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
具体实施方式
下面结合实施例解释本发明，实施案例仅用于说明本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
以下实施例中使用的植物乳杆菌LP6，已于2017年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.13458，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
所述干酪乳杆菌zhang，已于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5469，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。公开号为102851222A的中国发明专利《一种能在豆乳发酵过程中转化异黄酮的干酪乳杆菌》已公开该菌株。
所述植物乳杆菌P-8，已于2012年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.6312，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。公开号为102994422A的中国发明专利《一种植物乳杆菌在改善酒精性肝损伤中的应用》已公开该菌株。
所述动物双歧杆菌V9，已于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5470，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium lactis)。公开号为103421711A的中国发明专利《用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌》已公开该菌株。
实施例1
植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9的菌剂制备及复合乳酸菌微生态制剂的制备
步骤1，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌分别进行一级发酵，得到对应的一级种子培养液。
一级发酵的发酵条件包括：植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌分别在接种量2％-10％(v/v)，温度33-37℃，转速50-100r/m条件下培养18-24h；优选地，在接种量5％-8％(v/v)，温度35-36℃，转速60-80r/m条件下培养20-22h。
所述一级种子培养液中植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥2.0×109CFU/g，干酪乳杆菌的有效活菌数≥2.0×109CFU/g，植物乳杆菌的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，动物双岐杆菌的有效活菌数为≥1.0×109CFU/g。
A1：取保藏的植物乳杆菌LP6，在MRS平板上分离纯化，挑取长势较好的菌株在MRS斜面上划线培养18h，在无菌操作台里用接种环挑取一环菌接种于100mL MRS液体培养基中，震荡培养18h，然后按照2％接种量接种于一级种子培养基中，培养温度为37℃，转速为100r/m，培养时间为24h，制备得到植物乳杆菌LP6的一级种子培养液(活菌数≥2.0×109CFU/g)。
B1：取保藏的干酪乳杆菌zhang，在MRS平板上分离纯化，挑取长势较好的菌株在MRS斜面上划线培养24h，在无菌操作台里用接种环挑取一环菌接种于100mL MRS液体培养基中，震荡培养24h，然后按照5％接种量接种于一级种子培养基中，培养温度为37℃，转速为80r/m，培养时间为24h，制备得到干酪乳杆菌zhang的一级种子培养液(活菌数≥2.0×109CFU/g)。
C1：取保藏的植物乳杆菌P-8，在MRS平板上分离纯化，挑取长势较好的菌株在MRS斜面上划线培养20h，在无菌操作台里用接种环挑取一环菌接种于100mL MRS液体培养基中，震荡培养18h，然后按照10％接种量接种于一级种子培养基中，培养温度为35℃，转速为50r/m，培养时间为15h，制备得到植物乳杆菌P-8的一级种子培养液(活菌数≥1.0×109CFU/g)。
D1：取保藏的动物双歧杆菌V9，在MRS平板上分离纯化，挑取长势较好的菌株在MRS斜面上划线培养20h，在无菌操作台里用接种环挑取一环菌接种于100mL MRS液体培养基中，震荡培养15h，然后按照8％接种量接种于一级种子培养基中，培养温度为33℃，转速为90r/m，培养时间为18h，制备得到动物双歧杆菌V9的一级种子培养液(活菌数≥1.0×109CFU/g)。
所述植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9的一级种子培养基均为(g/L)：蛋白胨10，牛肉粉5，酵母粉4，葡萄糖20，吐温-80 1mL，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，柠檬酸三铵2，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，琼脂粉15，余量为蒸馏水，PH值6.2。
本发明人发现，在一级发酵阶段，如果体系的培养温度为33-37℃，转速为50-100r/m，培养时间为18-24h范围内，制得的发酵液中乳酸菌活菌数以及对肠道有益的活性物质积累较丰富，因此，本发明选择在一级发酵阶段条件如上。
步骤2，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌的一级种子培养液分别进行二级发酵，得到对应的二级种子培养液。
所述二级发酵的发酵条件包括：植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌的一级种子培养液分别在接种量2％-10％(v/v)，温度33-37℃，转速50-100r/m条件下培养18-24h；优选地，在接种量3％-7％(v/v)，温度34-36℃，转速70-90r/m条件下培养19-21h。
所述二级种子培养液中植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，干酪乳杆菌的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，植物乳杆菌的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，动物双岐杆菌的有效活菌数为≥1.0×109CFU/g。
A2：将培养好的植物乳杆菌LP6的一级种子液按接种量2％(v/v)接种于二级种子培养基中，培养温度为33℃，转速为80r/m，培养时间为24h，制备得到植物乳杆菌LP6的二级种子培养液(活菌数≥1.0×109CFU/g)。
B2：将培养好的干酪乳杆菌zhang的一级种子液按接种量3％(v/v)接种于二级种子培养基中，培养温度为37℃，转速为100r/m，培养时间为20h，制备得到干酪乳杆菌zhang的二级种子培养液(活菌数≥2.0×109CFU/g)。
C2：将培养好的植物乳杆菌P-8的一级种子液按接种量7％(v/v)接种于二级种子培养基中，培养温度为34℃，转速为70r/m，培养时间为19h，制备得到植物乳杆菌P-8的二级种子培养液(活菌数≥2.0×109CFU/g)。
D2：将培养好的动物双歧杆菌V9的一级种子液按接种量10％(v/v)接种于二级种子培养基中，培养温度为35℃，转速为80r/m，培养时间为22h，制备得到动物双歧杆菌V9的二级种子培养液(活菌数≥1.0×109CFU/g)。
所述植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9的二级种子培养基均为(g/L)：蛋白胨10，牛肉粉5，酵母粉4，葡萄糖20，吐温-80 1mL，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，柠檬酸三铵2，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，琼脂粉15，余量为蒸馏水，PH值6.2。
本发明人发现，在二级发酵阶段，如果体系的培养温度为33-37℃，转速为50-100r/m，培养时间为18-24h范围内，制得的发酵液中乳酸菌活菌数以及对肠道有益的活性物质积累较丰富，因此，本发明选择在二级发酵阶段条件如上。
步骤3，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌的二级种子培养液分别接种于不同的发酵培养基中进行三级发酵，得到对应的三级发酵培养液。
所述三级发酵的发酵条件包括：植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌的二级种子培养液分别在接种量2％-10％(v/v)，温度均33-37℃，转速50-100r/m，通风量0.3-1L/min，发酵全程调节发酵液相同pH值为5.6-6.2条件下培养8-12h；优选地，在接种量3％-8％(v/v)，温度为34-36℃，转速60-80r/m，通风量0.5-0.8L/min，发酵全程调节发酵液相同pH值为5.8-6.0条件下培养9-11h。
所述三级发酵培养液中植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，干酪乳杆菌的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，植物乳杆菌的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，动物双岐杆菌的有效活菌数为≥1.0×109CFU/g。
A3：将培养好的植物乳杆菌LP6的二级种子液按接种量2％(v/v)接种于发酵培养基中，培养温度为35℃，转速为70r/m，通风量为0.7L/min，pH值为5.9，培养时间为10h，制备得到植物乳杆菌LP6的三级发酵培养液(活菌数≥1.0×109CFU/g)。
B3：将培养好的干酪乳杆菌zhang的二级种子液按接种量5％(v/v)接种于发酵培养基中，培养温度为37℃，转速为100r/m，通风量为0.8L/min，pH值为6.2，培养时间为12h，制备得干酪乳杆菌zhang的三级发酵培养液(活菌数≥1.0×109CFU/g)。
C3：将培养好的植物乳杆菌P-8的二级种子液按接种量7％(v/v)接种于发酵培养基中，培养温度为34℃，转速为90r/m，通风量为0.5L/min，pH值为5.7，培养时间为9h，制备得植物乳杆菌P-8的三级发酵培养液(活菌数≥1.0×109CFU/g)。
D3：将培养好的动物双歧杆菌V9的二级种子液按接种量10％(v/v)接种于发酵培养基中，培养温度为37℃，转速为800r/m，通风量为0.8L/min，pH值为6.2，培养时间为12h，制备得动物双歧杆菌V9的三级发酵培养液(活菌数≥1.0×109CFU/g)。
本发明人发现，在三级发酵阶段，如果体系的培养温度均33-37℃，转速50-100r/m，通风量0.3-1L/min，发酵全程调节发酵液相同pH值为5.6-6.2条件下培养8-12h范围内，制得的发酵液中乳酸菌活菌数以及对肠道有益的活性物质积累较丰富，因此，本发明选择在三级发酵阶段条件如上。
发酵培养基的组分包括(g/L)：蔗糖50-80，脱盐乳清粉5-15，酵母粉20-40，大豆蛋白胨8-20，MgSO4.7H2O 1.5-2.0，MnSO4.5H2O 0.08-0.12，吐温-80 0.8-1.0ml，余量为水，pH7.0；
优选地(g/L)：蔗糖60，脱盐乳清粉10，酵母粉30，大豆蛋白胨15，MgSO4.7H2O 2.0，MnSO4.5H2O 0.1，吐温-80 1.0ml，余量为水，pH7.0。
本发明人发现，在培养基中加入不同量的乳清粉和酵母粉培养制得的发酵液中乳酸菌的数量显著不同，当按照上述比例进行配比时制得的菌液中乳酸菌的活菌数量最大，因此，本申请选择按照上述配比制备发酵培养基。
步骤4，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双岐杆菌的三级发酵培养液分别离心，得到植物乳杆菌LP6菌体、干酪乳杆菌菌体、植物乳杆菌菌体和动物双岐杆菌菌体；；离心条件为5000-12000r/m，5-15min。
A4：将得到的植物乳杆菌LP6的三级发酵培养液经8000r/m，10min离心，得到植物乳杆菌LP6菌体；
B4：将得到的干酪乳杆菌zhang的三级发酵培养液经10000r/m，12min离心，得到干酪乳杆菌zhang菌体；
C4：将得到的植物乳杆菌P-8的三级发酵培养液经8000r/m，8min离心，得到植物乳杆菌P-8菌体；
D4：将得到的动物双歧杆菌V9的三级发酵培养液经12000r/m，15min离心，得到动物双歧杆菌V9菌体。
步骤5，将植物乳杆菌LP6菌体、干酪乳杆菌菌体、植物乳杆菌菌体和动物双岐杆菌菌体分别与保护剂溶液按质量比1：5-10混合，得到菌悬液，所述菌悬液通过冷冻干燥，得到菌剂。
所述保护剂组分包括(g/L)：脱脂乳粉30-35，脱盐乳清粉15-20，工业海藻糖15-20，维生素C 3-4，卵磷脂0.05-0.08，余量为蒸馏水，pH值7.0±0.2；
优选地，所述保护剂组分包括：脱脂乳粉32，脱盐乳清粉18，工业海藻糖18，维生素C 3.5，卵磷脂0.06，余量为蒸馏水，pH值7.0。
A5：将植物乳杆菌LP6菌体与保护剂溶液按质量比1：5的比例混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，得到植物乳杆菌LP6菌剂；
所述保护剂组分包括(g/L)：脱脂乳粉30，脱盐乳清粉15，工业海藻糖20，维生素C3，卵磷脂0.05，余量为蒸馏水，pH值7.0；
B5：将干酪乳杆菌zhang菌体与保护剂溶液按质量比1：10的比例混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，得到干酪乳杆菌zhang菌剂；
所述保护剂组分包括(g/L)：脱脂乳粉35，脱盐乳清粉20，工业海藻糖20，维生素C4，卵磷脂0.08，余量为蒸馏水，pH值7.0；
C5：将植物乳杆菌P-8菌体与保护剂溶液质量比1：8的比例添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，得到植物乳杆菌P-8菌剂；
所述保护剂组分包括(g/L)：脱脂乳粉32，脱盐乳清粉18，工业海藻糖18，维生素C3.5，卵磷脂0.06，余量为蒸馏水，pH值7.0；
D5：将动物双歧杆菌V9菌体与保护剂溶液质量比1：6的比例添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，得到动物双歧杆菌V9菌剂；
所述保护剂组分包括(g/L)：脱脂乳粉34，脱盐乳清粉17，工业海藻糖16，维生素C3.2，卵磷脂0.07，余量为蒸馏水，pH值7.0。
本发明人发现，上述组分的保护剂与菌体的结合效果好，在能够很好地保护菌体的前提下，保证后续冻干工艺的效率。
步骤6，将植物乳杆菌LP6菌剂、干酪乳杆菌菌剂、植物乳杆菌菌剂和动物双岐杆菌菌剂按质量比1-4：1-4：1-4：2-7混合，并与稀释载体复配，得到复合乳酸菌微生态制剂；
本发明人发现，稀释载体为脱脂乳粉能够使得复配后的微生态制剂具有更好的稳定性，并且在实际使用时较容易溶解和搅拌，同时，宠物猫对脱脂乳粉具有的乳香气味较为喜欢，不会因为载体的因素导致。因此，本申请选择将脱脂乳粉作为稀释载体。
步骤7，经粉末包装机充氮气填充将所述复合乳酸菌微生态制剂进行分装。
植物乳杆菌LP6菌株分离自传统自然发酵的泡菜中。具备优良的益生特性，研究表明该菌株具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常见肠道致病菌生长特性，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，可改善机体内的微生态环境，提高血液和粪便中免疫活性物质的水平。植物乳杆菌LP6具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在PH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达80.04％。同时菌株LP6具有广谱抑制致病菌的优良特性，且抑菌效果十分显著，由于植物乳杆菌LP6的加入，使得复合乳酸菌微生态制剂在高宠物猫免疫力、降低腹泻发病率方面更具有显著性。
干酪乳杆菌zhang是2001年分离自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗草原上自然发酵酸马奶(Komiss)中的一株具有优良益生特性的干酪乳杆菌。研究人员采用体外实验、动物模型和人体实验对菌株的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学、蛋白质组学和转录组学的手段对菌株的益生机制进行了深入剖析。目前已经证实菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，从而预防肠道致病菌感染，提高机体细胞免疫、体液免疫和肠黏膜局部免疫，调节血脂代谢、保护修复肝脏，增强机体抗氧化能力，抑制肿瘤细胞的生长，预防糖尿病。
植物乳杆菌P-8是2003年从内蒙古自治区牧民家庭中的自然发酵酸牛奶中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株。研究采用体外实验、动物模型和人体实验对菌株的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学的手段对菌株的益生机制进行了深入剖析。目前已经证实菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，调节血脂代谢，对肝脏具有保护修复作用，提高机体免疫能力。
动物双歧杆菌V9是2005年分离自内蒙古草原上健康蒙古族儿童肠道中的一株具有优良益生特性的动物双歧杆菌。研究人员采用体外实验、动物模型和临床实验对菌株的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学的手段对菌株的益生机制进行了深入剖析。目前已经证实对菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，拮抗肠道致病菌，提高肠道抗致病菌感染能力，预防和缓减腹泻、便秘、腹痛、腹胀等肠易激综合症。
本发明人发现，上述植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9单独使用均能够发挥菌株独特的优势，具体表现为植物乳杆菌LP6能够发挥广谱抑制致病菌的效果，干酪乳杆菌zhang能够促进机体细胞免疫、体液免疫和肠黏膜局部免疫，从而提升宿主机体免疫水平，植物乳杆菌P-8能够起到保护宿主肝脏的作用，动物双歧杆菌V9能够拮抗宿主肠道致病菌，预防和缓减肠易激综合征，但使用单菌株只能发挥较片面的作用，不能综合调节宿主的肠道菌群。将上述4种菌株进行复配，成为一种新的复合微生态制剂，发挥菌株的系统作用，能够有效控制腹泻发病率、优化精神状态和皮毛状态、减轻掉毛程度、减少粪便中氨浓度含量、减轻猫砂气味，明显提高采食量和生长率，显著提高宠物猫血液中免疫球蛋白G的含量及粪便中分泌型免疫球蛋白A的含量。
实施例2复合乳酸菌微生态制剂的制备
按实施例1相同的方法分别将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9这四株菌分别进行一级、二级种子培养、三级发酵培养，分别进行离心获得这四株菌的菌体，将菌体分别与保护剂溶液按照质量比1：5、1：8、1：5、1：10混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，分别得到菌剂；将所述植物乳杆菌LP6菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌V9菌剂按比例1:1:1:2进行混合，并加入稀释载体进行复配，得到复合乳酸菌微生态制剂，其活菌总数为2.0×109CFU/g；其中，植物乳杆菌LP6有效活菌数为3.0×1011CFU/g、干酪乳杆菌zhang的有效活菌数为2.8×1011CFU/g、植物乳杆菌P-8的有效活菌数为3.5×1011CFU/g、动物双歧杆菌V9的有效活性为3.0×1011CFU/g。
实施例3复合乳酸菌微生态制剂的制备
按实施例1相同的方法分别将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9这四株菌分别进行一级、二级种子培养、三级发酵培养，分别进行离心获得这四株菌的菌体，将菌体分别与保护剂溶液按照质量比1：7、1：10、1：5、1：8混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，分别得到菌剂；将所述植物乳杆菌LP6菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌V9菌剂按比例1:1:1:7进行混合，并加入稀释载体进行复配，得到复合乳酸菌微生态制剂，其活菌总数为3.0×109CFU/g；其中，植物乳杆菌LP6有效活菌数为2.5×1011CFU/g、干酪乳杆菌zhang的有效活菌数为2.5×1011CFU/g、植物乳杆菌P-8的有效活菌数为4.0×1011CFU/g、动物双歧杆菌V9的有效活性为4.5×1011CFU/g。
实施例4复合乳酸菌微生态制剂的制备
按实施例1相同的方法分别将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌V9这四株菌分别进行一级、二级种子培养、三级发酵培养，分别进行离心获得这四株菌的菌体，将菌体分别与保护剂溶液按照质量比1：10、1：7、1：5、1：6混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，分别得到菌剂；将所述植物乳杆菌LP6菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌V9菌剂按比例1:4:3:5进行混合，并加入稀释载体进行复配，得到复合乳酸菌微生态制剂，其活菌总数3.4×109CFU/g；其中，植物乳杆菌LP6有效活菌数为2.0×1011CFU/g、干酪乳杆菌zhang的有效活菌数为3.5×1011CFU/g、植物乳杆菌P-8的有效活菌数为3.0×1011CFU/g、动物双歧杆菌V9的有效活性5.5×1011CFU/g。
实施例5复合乳酸菌微生态制剂对宠物猫健康作用的影响
1、实验样品：实施例1制备的复合乳酸菌微生态制剂
由某宠物猫养殖公司随机选取不同品种宠物猫60只，实验组30只，对照组30只，所有试验宠物猫均分组编号分开饲养。对照组按照原日粮配方饲喂，实验组在原日粮配方的基础上添加由实施例1制备的复合乳酸菌微生态制剂，其添加量为2g/只/天，复合乳酸菌活菌总数为1×109CFU/g，具体添加方法为每日早晨喂食时进行添加，拌料前从冰柜中取出复合乳酸菌微生态制剂，按照上述剂量直接添加到宠物猫日粮中，充分搅拌后进行饲喂。复合乳酸菌微生态制剂加入时日粮温度低于40℃。
2、实验方法：
(1)试验宠物猫腹泻病患病状况统计：使用前、试用30天后对所有试验宠物猫腹泻病患病情况进行统计记录。
(2)试验宠物猫精神和皮毛及猫砂气味统计：宠物猫精神和皮毛状态均以某固定宠物医生通过肉眼观察得出的结果为准；猫砂气味由饲养员统计，统计时用取样勺采集猫砂，用手扇闻其味并统计，并拍摄部分试验宠物猫试验前后照片。
(3)测量时，将宠物猫粪便样品进行10倍稀释，然后加入浓度为10mol/L NaOH溶液(离子强度调节剂)，NaOH溶液与粪便样品体积比为1:100，使得粪便样品溶液PH值增大至约11，使铵离子完全转化为氨，通过疏水性高分子透气薄膜扩散进入透气膜与离子选择电极的敏感膜之间的极薄液层内，直到试液和此极薄液层内氨分压相等，通过测量溶液电位得到氨压力，进而得出氨浓度。
(4)试验宠物猫采食量变化统计：试验宠物猫的实际喂量，即饲喂前日粮的重量减去摄食后剩料的重量,每次统计为试验宠物猫全天2-3次采食的总量。
(5)试验宠物猫体重变化统计：检测时，先准备一个轻质称量盒放在体重秤上并去皮，由饲养人员配合将宠物猫固定在体重秤的中央，记录宠物猫的体重。
(6)试验宠物猫血液中免疫因子检测：采用负压采血管抽取试验宠物猫血液样品，离心，转速3000r/m，10min，获取血清，并采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)对血清样品中的免疫球蛋白G的含量进行检测。
(7)试验宠物猫粪便样品中免疫因子的检测：采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)对试验宠物猫粪便样品中的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的含量进行检测。
3、实验样品采集：
试验前对参加实验的60只宠物猫进行采样，并统计上述指标。采样后实验组在原日粮配方的基础上按照上述方法添加本申请所述的复合乳酸菌微生态制剂进行饲喂，对照组仍采用原日粮配方进行饲喂，持续试验15天后进行第二次采样，持续试验30天后进行第三次采样。血液样品采集前试验宠物猫禁食一夜，采血前，宠物医生佩戴医用手套和口罩将宠物猫采血部位的毛剪掉，清除入针处皮上污物，用酒精进行消毒，并用洁净纸巾擦拭干净。采用普通采血管采集血液约2毫升，拔下普通采血管静置。使用止血带进行止血并对血液样品进行编号。采血后对血样进行离心获取血清，并进行上述免疫因子含量检测。粪便样品采样前，采样人员佩戴医用手套和口罩，在试验宠物猫排便后立刻用一次性塑料小勺进行采集，采集时均匀采集粪便表面和内部部分，用力将粪便甩到采样管底部，共采集粪便样品8-10mL，加入适量保护剂后充分摇晃混匀，并对样品进行编号，置于液氮中速冻后暂存于-20℃冷柜，尽快送回实验室进行免疫因子检测。
4、实验结果：
(1)试验宠物猫腹泻病患病状况统计结果
结果显示在试验过程中，实验组与对照组宠物猫的腹泻病患病率均有降低，但是实验组的降低程度明显大于对照组，试验前实验组和对照组腹泻病患病率分别为60％和55％；试验30天后，实验组和对照组分别变为10％和50％，结果如表1所示。
表1试验宠物猫腹泻发病率统计结果
Figure BDA0001528985420000131
(2)试验宠物猫精神和皮毛及猫砂气味统计结果
结果显示试验前实验组和对照组宠物猫均呈现精神状态差，皮毛光泽度差、顺滑度差、打结率高，且掉毛严重，猫砂气味重；试验30天后，实验组宠物猫精神旺盛、活泼，皮毛光泽度和顺滑度良好、无打结，掉毛明显减轻，猫砂气味减轻，对照组宠物猫则仍基本保持试验前的状态，结果如表2所示。图1所示为实验组宠物猫试验前和试验后的照片，可以直观展示试验30天的效果。
表2试验宠物猫精神和皮毛状态及猫砂气味统计结果
Figure BDA0001528985420000132
(3)试验宠物猫粪便中氨浓度的检测结果
结果显示试验前实验组和对照组宠物猫粪便氨浓度分别为28和27.5mg/dL；试验15天后，实验组和对照组粪便氨浓度分别为18.3和26.8mg/dL，实验组显著低于对照组(p<0.01)；试验30天后，实验组和对照组宠物猫粪便氨浓度分别为13.0和22.3mg/dL，实验组显著低于对照组(p<0.01)。说明复合乳酸菌微生态制剂能够显著降低宠物猫粪便中氨浓度，从而降低臭味，结果见图2所示。
(4)试验宠物猫采食量检测结果
结果显示，试验宠物猫的实验组和对照组平均采食量分别为67.13和69.88g/只/天；试验15天，实验组和对照组平均采食量分别为73.00和70.05g/只/天，实验组高于对照组；试验30天，实验组和对照组平均采食量分别为81.63和75.75g/只/天，实验组高于对照组，说明复合乳酸菌微生态制剂能够改善宠物猫食欲，进而提高宠物猫采食量。结果如图3所示。
(5)试验宠物猫体重检测结果
结果显示，试验宠物猫的实验组和对照组平均采食量分别为2.14和2.33kg/只/天；试验15天，实验组和对照组平均采食量分别为2.73和2.64kg/只/天，实验组高于对照组；试验30天，实验组和对照组平均采食量分别为3.20和2.95kg/只/天，实验组高于对照组，说明复合乳酸菌微生态制剂能够提高宠物猫生长率。结果如图4所示。
(6)血液中免疫因子的含量测定
采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)对试验宠物猫血液样品中的免疫球蛋白G的含量进行检测。结果显示，试验前实验组和对照组中免疫球蛋白G的含量分别为5.84和6.00mg/mL；试验15天后，实验组和对照组分别变为8.91mg/mL和6.24mg/mL，组间差异显著(p<0.001)；试验30天后，实验组和对照组分别变为10.26mg/mL和7.07mg/mL，组间差异显著(P<0.001)，说明复合乳酸菌微生态制剂能够显著提高宠物猫血液中免疫球蛋白G的含量。结果如图5所示。
(7)血液中免疫因子的含量测定
采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)对试验宠物猫粪便样品中的分泌型免疫球蛋白A的含量进行检测。结果显示，试验前实验组和对照组中分泌型免疫球蛋白A的含量分别为766.57和779.92mg/mL；试验15天后，实验组和对照组分别变为1126.35mg/mL和801.65mg/mL，组间差异显著(p<0.01)；试验30天后，实验组和对照组分别变为1343.98mg/mL和862.12mg/mL，组间差异显著(P<0.001)，说明复合乳酸菌微生态制剂能够显著提高宠物猫粪便中分泌型免疫球蛋白A的含量。结果如图6所示。
需要说明的是：本申请实施例2-4制备的复合乳酸菌微生态制剂同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大。
以下对植物乳杆菌LP6进行进一步说明。
植物乳杆菌LP6菌株分离自传统自然发酵的泡菜中，革兰氏阳性无芽孢直杆菌，1.1vtm*6.0μm，无鞭毛，可运动，兼性厌氧，表面菌落直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，白色，25℃可以生长繁殖，最适生长温度为35～37℃。该菌株具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在PH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在PH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达80.04％。同时菌株LP6具有广谱抑制致病菌的优良特性，抑菌效果显著。该菌株于2017年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.13458，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
植物乳杆菌LP6耐酸、耐胆盐及其抑菌性能测定
将冷冻保存的植物乳杆菌LP6接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养18h，如此传代培养2次得到活化发酵液；
所述的MRS液体培养基组成如下((g/L))：蛋白胨10、牛肉膏5、酵母浸粉4、葡萄糖20、磷酸氢二钾2、乙酸钠5、柠檬酸三钠2、吐温-80 1mL、硫酸镁0.2、硫酸锰0.05，加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。
1、耐酸、耐胆盐性能测定
在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS缓冲液中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液；将活化好的菌株离心收集菌体，加入与培养基等量的pH2.5模拟胃液，37℃培养3h，于0h、3h用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。
在pH8.0(用0.1mol/L NaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液；将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃培养，于4h、8h用MRS琼脂培养基倾注法测活菌数，实验结果如表3所示。
存活率＝[N1/N0]×100％(N0－0h活菌数；N1－经模拟肠、胃液消化后的活菌数)
表3植物乳杆菌LP6人工模拟胃液和肠液的存活率
Figure BDA0001528985420000151
2、抑菌性能测定
用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定植物乳杆菌LP6发酵液的抑菌效果，将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(106cfu/ml)一起倒入平板混匀，待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。
每孔加入100μL植物乳杆菌LP6发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果如表4所示：
表4植物乳杆菌LP6发酵液中苯乳酸含量及抑菌特性
项目 测定结果
苯乳酸(mg/L) 50.22±1.05
大肠杆菌0517：H7(mm) 37.13±1.84
鼠伤沙门氏菌(mm) 22.77±1.88
弗氏志贺氏菌(mm) 21.57±2.06
金黄色葡萄球菌(mm) 20.07±1.30
注：打孔器直径为8mm
由表3、表4实验结果可知，植物乳杆菌LP6菌株具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达80.04％。同时植物乳杆菌LP6菌株具有广谱抑制致病菌的优良特性，且抑菌效果十分显著，加入复合乳酸菌微生态制剂能够对宠物猫肠道菌群具有优良的调节作用。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种复合乳酸菌微生态制剂，其特征在于，由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LP6，其微生物保藏编号为CGMCC No.13458、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei) zhang，其保藏编号为CGMCC No.5469、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) P-8，其保藏编号为CGMCC No.6312和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis) V9，其保藏编号为CGMCC No.5470组成；其中植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥2.0×1011CFU/g，干酪乳杆菌zhang的有效活菌数≥2.0×1011CFU/g，植物乳杆菌P-8的有效活菌数≥2.0×1011CFU/g，动物双歧杆菌V9的有效活菌数为≥2.0×1011CFU/g。
2.根据权利要求1所述的复合乳酸菌微生态制剂，其特征在于，所述复合乳酸菌微生态制剂中总有效活菌数为≥1.0×109CFU/g。
3.根据权利要求2所述的复合乳酸菌微生态制剂，其特征在于，还包括保护剂，所述保护剂组分包括：脱脂乳粉30-35g/L，脱盐乳清粉15-20g/L，工业海藻糖15-20g/L，维生素C3-4g/L，卵磷脂0.05-0.08g/L，余量为蒸馏水，PH值7.0±0.2；所述复合乳酸菌微生态制剂中保护剂的重量百分含量为8-40％。
4.根据权利要求2所述的复合乳酸菌微生态制剂，其特征在于，还包括保护剂，所述保护剂组分为：脱脂乳粉32g/L，脱盐乳清粉18g/L，工业海藻糖18g/L，维生素C 3.5g/L，卵磷脂0.06g/L，余量为蒸馏水，PH值7.0；和/或，所述复合乳酸菌微生态制剂中保护剂的重量百分含量为30％。
5.权利要求1-4任一项所述的复合乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8和动物双歧杆菌V9分别进行一级发酵，得到对应的一级种子培养液；
步骤2，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8和动物双歧杆菌V9的一级种子培养液分别进行二级发酵，得到对应的二级种子培养液；
步骤3，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8和动物双歧杆菌的二级种子培养液分别接种于不同的发酵培养基中进行三级发酵，得到对应的三级发酵培养液；
步骤4，将植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8和动物双歧杆菌V9的三级发酵培养液分别离心，得到植物乳杆菌LP6菌体、干酪乳杆菌zhang菌体、植物乳杆菌P-8菌体和动物双歧杆菌V9菌体；
步骤5，将植物乳杆菌LP6菌体、干酪乳杆菌zhang菌体、植物乳杆菌P-8菌体和动物双歧杆菌V9菌体分别与保护剂溶液按质量比例1：5-10混合，得到菌悬液，所述菌悬液通过冷冻干燥，得到植物乳杆菌LP6菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂和动物双歧杆菌V9菌剂；
步骤6，将植物乳杆菌LP6菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂和动物双歧杆菌V9菌剂按质量比1-4：1-4：1-4：2-7混合，并与稀释载体复配，得到复合乳酸菌微生态制剂。
6.根据权利要求5所述的复合乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述一级种子培养液中植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥2.0×109CFU/g，干酪乳杆菌zhang的有效活菌数≥2.0×109CFU/g，植物乳杆菌P-8的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，动物双歧杆菌V9的有效活菌数为≥1.0×109CFU/g；
所述二级种子培养液中植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，干酪乳杆菌zhang的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，植物乳杆菌P-8的有效活菌数≥2.0×109CFU/g，动物双歧杆菌V9的有效活菌数为≥1.0×109CFU/g；
所述三级发酵培养液中植物乳杆菌LP6的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，干酪乳杆菌zhang的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，植物乳杆菌P-8的有效活菌数≥1.0×109CFU/g，动物双歧杆菌V9的有效活菌数为≥1.0×109CFU/g。
7.根据权利要求5所述的复合乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述一级发酵的发酵条件包括：植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8和动物双歧杆菌V9分别在温度33-37℃，转速50-100r/m条件下培养18-24h；
所述二级发酵的发酵条件包括：植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8和动物双歧杆菌V9的一级种子培养液分别在温度33-37℃，转速50-100r/m条件下培养18-24h；
所述三级发酵的发酵条件包括：植物乳杆菌LP6、干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌P-8和动物双歧杆菌V9的二级种子培养液分别在温度均33-37℃，转速50-100r/m，通风量0.3-1L/min，发酵全程调节发酵液相同pH值为5.6-6.2条件下培养8-12h。
8.根据权利要求1-4任一项所述复合乳酸菌微生态制剂在制备宠物饲料或制备宠物饲料添加剂中的应用。
9.含有权利要求1-4任一项所述复合乳酸菌微生态制剂的宠物饲料或宠物饲料添加剂。
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