CN106135664A

CN106135664A - 一种用于治疗和预防畜禽消化道疾病的微生态制剂及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN106135664A
Application number: CN201610537488.0A
Authority: CN
Inventors: 杜鹏; 赖水明; 李建贵; 李建秋; 陈伟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-04-01
Filing date: 2016-07-08
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明公开了一种用于治疗和预防畜禽消化道疾病的微生态制剂及其制备方法和用途。本发明所述的微生态制剂是由双歧杆菌、乳杆菌、芽孢杆菌经液体发酵，离心，低温冷冻干燥后复配低聚异麦芽糖和益生元后得到的干燥粉剂。该产品富含大量的生物活性物质和多种活菌，可通过直接饲喂、饮水或添加到饲料中的方式用于治疗和预防动物细菌性腹泻和消化不良性腹泻，调节动物消化机能，提高动物机体免疫力和抗应激能力，促进动物生长，提高动物的成活率。本发明的微生态制剂绿色安全，可替代抗生素药物治疗动物肠道疾病，在动物疾病防治领域将具有广阔的应用前景。

Description

一种用于治疗和预防畜禽消化道疾病的微生态制剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种动物微生态制剂及其制备方法和用途，特别涉及一种能够治疗及预防动物肠道疾病、调节动物肠道微生态平衡、增强动物免疫力和抗应激能力的动物微生态制剂及其制备方法和用途。本发明属于饲料研究技术领域。

背景技术

合生元(synbiotics)又称为合生素，是指益生菌和益生元的组合制剂，或再加入维生素、微量元素等。它既可发挥益生菌的生理效应，又可快速增加该菌的数量，使益生菌作用更显著持久。合生元作为新一代微生态调节剂对动物肠道疾病的防治和维护机体的微生态平衡起着至关重要的作用。

随着人们环保意识的增强，社会文明程度和生活水平的提高，安全"优质"无公害"无污染的绿色畜禽产品已成为消费主流，抗生素的长期使用会使细菌产生耐药性，引起畜禽体内菌群失调和二重感染，使畜禽免疫力下降，并在动物产品及环境中残留，同时滥用抗生素加大了饲料成本，降低了经济效益。针对长期使用抗生素添加剂所造成的诸多弊端我们经多年的研究开发出具有生物活性的合生元—治疗和预防畜禽消化道疾病的微生态制剂(幼龄康)，其是一种高效的动物肠道微生态平衡调节剂，作为动物肠道疾病治疗和预防的微生态合生元制剂对绿色养殖具有重要意义。

微生态制剂的发展历程：

微生态制剂应用最早见于日本，上世纪50年代就有“表飞鸣”、“乳酶生”，其成分是粪链球菌。用于治疗人的肠道疾病，随后相继应用于畜禽养殖。美国上世纪70年代开始使用饲用微生物。80年代中期，世界各国，尤其欧洲各国和日本等发达国家纷纷采取有力措施，对饲用抗生素的种类、使用方法、剂量和配伍等方面加以限制，同时大力开展研究药物饲料添加剂代用品，积极鼓励和倡导绿色安全饲料添加剂的研究和推广。这给兽用微生态制剂产业带来了一次难得的发展机遇。全球兽用微生态产业迅猛发展，近十几年来发展更为迅速，每年销售额达到10亿美元。

我国微生态制剂的研究现状：

我国微生态制剂的研究始于上世纪80年代。1998年，国内市场上能找到的微生态制剂产品寥寥几种，2000年产品数量达到1998年的5倍以上，近十几年微生态产品迅速猛增，这在很大程度上反映出微生态制剂市场前景的广阔。目前国内有许多生产厂家研究生产出饲用微生态制剂产品，表现出一定的作用与效果，但毕竟我国的微生态制剂市场起步较晚，研究和开发尚待深入，许多问题尚未完全弄清楚，加之微生态制剂本身的不稳定性，国内从上到下还没有对其形成一个完善的管理机制，尤其是尚没有一个统一的质量标准，因此大多数还处于试验研究阶段。

国外微生态产业发展情况：

最早研究和应用畜禽微生态制剂的历史可以追溯到1947年，蒙哈德首先发现使用乳酸杆菌饲喂仔猪可有效的增加仔猪的体重并改善仔猪的身体健康。20世纪70年代，美国率先使用微生态制剂，使用效果非常明显，显现出抗生素无法比拟的优点。80年代，微生态制剂开始在世界范围内普及，并逐渐被世人所认可。特别是近十年来，微生态制剂的发展尤其迅速。美国FDA规定：允许用作益生素的微生物有42种。我国农业部(2003)公布的可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种有枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳酸球菌和酵母菌等15种。

近年来，在养殖业中，由于各地长期、大剂量使用抗生素，不但增加了生产成本，而且其毒副作用和药物残留严重影响到人类健康。美国及西欧一些国家相继禁用或限用抗生素作为饲料添加剂。微生态制剂则可以通过改善动物胃肠微生态环境来促进健康养殖，填补抗生素留下的空白。一些发达国家相继开发研制出一些微生态制剂替代抗生素，在理论及应用方面进行了深人细致的研究，使微生态制剂得到了较快发展。饲用微生态制剂已经广泛应用于畜牧业生产中，形成了微生态制剂产业。

动物微生态制剂原理和功效：

动物微生态制剂的分类：广义地说，微生态制剂包括动物微生态制剂和植物微生态制剂。动物微生态制剂既包括正常微生物成员，尤其是优势种群的活菌制剂，还包括一些能促进正常微生物群生长繁殖的物质所制备的制剂，其能产生一定的生物效应或生长态效应如益生元。动物微生态制剂分类方法较多，但常用的分类有以下几种方式：

根据微生态制剂使用的菌种类型，主要分为单一菌类和复合微生态制剂两大类，其中单一菌类微生态制剂又包括以下四种类型：乳酸菌类微生态制剂：主要有嗜酸乳杆菌、双歧乳杆菌和粪链球菌等，是一种可分解糖类产生乳酸的革兰氏阳性菌，厌氧或兼性厌氧生长。乳酸菌在维持消化道的正常微生物群系的稳定性方面起着决定性的作用，缺点是大部分乳酸菌的耐热能力比较差，易导致产品质量不稳定，进而影响饲喂效果。据报道，乳酸菌不耐高温，经80℃处理5min，将损失70％～80％，但耐酸在pH 3.0～4.5时仍可生长，对胃中的酸性环境有一定耐受性。在动物体内通过生物拮抗降低pH，阻止和抑制致病菌的侵入和定植；降解氨、吲哚及粪臭素等有害物质，维持肠道中正常的生态平衡；活菌体和其代谢产物中含有较高的超氧化物歧化酶(SOD)，能消除氧自由基的不利作用，增强体液免疫和细胞免疫。研究发现，乳酸菌在鱼体肠道定植，可抵抗革兰氏阴性致病菌，增强抗感染能力，增加肠黏膜的免疫调节活性，促进生长。乳酸菌可用于哺乳和断乳期动物的饲料中。

芽孢杆菌类微生态制剂：主要有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等，是一类好氧菌。在一定条件下产生芽孢，由于芽孢的特殊结构使芽孢杆菌对干燥、高温高压、氧化、强酸强碱、挤压等不良环境的抵抗力很强，产品稳定性高，并且具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，在肠道发芽生长具有多种有效的酶促效应。

酵母类微生态制剂：主要有啤酒酵母、产朊假丝酵母、酿酒酵母、红色酵母等，酵母细胞富含蛋白质、核酸、维生素和多种酶，具有增强动物免疫力，增加饲料适口性，促进动物对饲料的消化吸收能力等功能，可提高动物对磷的利用率，可以用来发酵生产饲用单细胞蛋白。

光合细菌类微生态制剂：是一类有光合作用能力的异养微生物，主要利用小分子有机物合成自身生长繁殖所需要的各种养分，富含蛋白质、B族维生素、辅酶Q、抗活性病毒因子等多种生物活性物质及类胡萝卜素、番茄红素等天然色素。光合细菌菌体蛋白中多种必需氨基酸的含量高于酵母菌。光合细菌在改善水体环境，促进水产动物生长，改善色泽等方面有良好的作用

复合微生态制剂：相比较前四种由单一菌种组成的微生态制剂，复合微生态制剂是由多种菌按照一定比例复合配制而成，能适应多种条件和宿主，具有防病治病、促生长、提高饲料转化率等多种功能。

按动物微生态制剂的用途分类，主要分为以下三类：

微生态治疗剂：主要由乳酸菌、双歧杆菌等种、属菌株组成，具有很强地调整消化道内环境和微生物区系平衡的作用，主要用于预防和治疗消化机能紊乱和消化道感染。

微生态促生长剂：主要由真菌、酵母、芽孢杆菌等具有很强消化能力的菌株组成，在消化道中能产生多种消化酶、丰富的B族维生素、维生素K、未知生长因子和菌体蛋白等，可起到辅助消化、促进生长的作用。

微生态多功能剂：由多种、属菌株配合而成，具有一定整肠保健、防治疾病作用，又有较好的辅助消化、促进生长等作用。

根据微生态制剂的物质组成，可分为益生素、益生元及合生元；

益生素：是指改善宿主微生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。益生素在动物肠道内通过自身生长繁殖抑制有害细菌的生长，增强非特异性免疫功能，达到防治疾病、促进生长和提高饲料报酬的目的。

益生元又叫化学益生素：是一种不能被宿主消化吸收，也不能被肠道有害菌利用，只能被有益微生物选择性吸收利用或能促进有益菌的活性(或繁殖)的一类化学物质，它能选择性促进肠内有益菌群的活性或生长繁殖，起到增进宿主健康和促进生长的作用。

合生元：是益生菌和益生元按一定比例结合的生物制剂，能同时发挥二者的共同作用，合生元结构合理，效果更加优越，成为微生态制剂开发的主要方向。

动物微生态制剂存在的问题：

微生态制剂应用广泛，兼有养生和保护功能，能起到“已病辅治、未病防病、无病保健”的重要作用。目前，对微生态制剂的开发和研究，国外已进入高潮，并且形成强大的产业，每年的收入相当可观。而我国的微生态制剂发展相对缓慢，较国外有很大差距。导致如此情况有以下几个原因：

我国微生态制剂起步较晚；许多微生态制剂尚处在开发和试验当中，没有投入到批量生产和实际应用当中去，所以市场上成熟的产品种类较少。目前已确定在我国适宜作微生态制剂的菌种种类太少，尚需开发新的菌种，或利用现有分子生物学等方法改良现有菌种，使之具有新的特性。关于微生态制剂作用机制的研究进展缓慢，对于各种畜禽肠道正常菌群的组成和相互关系研究不够清楚，这都将减缓微生态制剂的开发和应用。

微生态制剂的制作和加工工艺手段落后单一：对微生态制剂生产的后处理阶段手段匮乏，很难保证微生态制剂在与饲料混合过程中不被其他有害菌污染，无法保证微生态制剂的安全稳定性，其活性也易受外界环境因素的影响。饲料中添加的抗生素对微生态饲料添加剂的杀灭和抑制作用。

缺少配套的应用推广措施：因为微生态制剂的使用有很严格的要求，使用不当会导致微生态制剂的效果减弱或消失。没有专业措施相配套，给微生态制剂在我国的推广带来很大的困难。

如果严格限制在饲料中添加抗生素，将大大加强人们对微生态制剂的研发力度，加快我国微生态制剂产业的发展速度。就目前国际大环境的影响来看，要想保证我国肉、蛋及奶产品的出口，势必要改善药物残留过高的现状，禁止饲料中添加抗生素势在必行。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提出一种用于治疗和预防畜禽消化道疾病的微生态制剂及其制备方法，本发明的微生物制剂可通过直接饲喂、饮水或添加到饲料中的方式达到治疗和预防动物肠道细菌性腹泻和消化不良性腹泻，提高动物机体免疫力和抗应激能力，增强动物消功能，促进动物生长的目的，绿色安全，可代替动物肠道疾病抗生素等药物的使用，免除了应用抗生素的弊端，同时提高了动物的成活率，降低了生产成本，提高了动物福利。

本发明的一种用于治疗和预防畜禽消化道疾病的微生态制剂，是由双歧杆菌、乳杆菌、芽孢杆菌经液体发酵，离心，低温冷冻干燥后复配低聚异麦芽糖和益生菌后得到的干燥粉剂。该产品富含大量的生物活性物质和多种活菌，本产品直接饲喂、饮水或添加到饲料中可治疗和预防动物细菌性腹泻和消化不良性腹泻，调节消化机能，提高动物机体免疫力和抗应激能力，促进动物生长，可替代抗生素药物治疗动物肠道疾病，提高动物的成活率，降低生产成本。

具体的，本发明的一种用于治疗和预防畜禽消化道疾病的微生态制剂，是通过以下方法制备得到的：

(1)将动物双歧杆菌菌种接种于双歧杆菌固体培养基上，37℃培养36-60小时，挑取双歧杆菌接种于100ml双歧杆菌液体培养基中，37℃培养15-25小时，再将100ml培养液接种于1000ml双歧杆菌液体培养基中，37℃培养10-14小时；

(2)分别将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌以及干酪乳杆菌菌种接种于乳酸杆菌固体培养基上，37℃培养36-60小时，分别挑取各菌种接种于100ml乳酸杆菌液体培养基中37℃培养15-25小时，再将各菌的100ml培养液分别接种于1000ml乳酸杆菌液体培养基中，37℃培养10-14小时；

(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的全部培养液混合后，按照1％(v/v)的接种量接种于含有增菌培养基的1000升厌氧发酵罐中，37℃增菌培养10-14小时，1000转/分离心5-10分钟，获得双歧杆菌与乳杆菌混合发酵的上清液和菌泥，收集菌泥，加入冻干保护剂，-60℃速冻3-5小时，放入冷冻干燥机中冻干，收集得到双歧杆菌与乳杆菌的混合冻干菌粉；

(4)将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌菌种分别接种于芽孢杆菌固体培养基上，37℃培养15-25小时，分别挑取各菌种接种于100ml芽孢杆菌液体培养基中，放入摇床中，210转/分，37℃培养15-25小时，将各菌的100ml培养液接种于1000ml芽孢杆菌液体培养基，放入中摇床中，210转/分，37℃培养10-14小时；

(5)将步骤(4)得到的全部培养液混合后，按照1％(v/v)的接种量接种于1000升含有芽孢杆菌液体培养基的发酵罐中37℃增菌培养15-25小时，1000转/分离心5-10分钟，获得芽孢杆菌发酵上清液和菌泥，收集菌泥，加入冻干保护剂，-60℃速冻3-5小时，放入冷冻干燥机中冻干，收集得到芽孢杆菌的冻干菌粉；

(6)收集步骤(3)和步骤(5)离心后的发酵上清液，分别进行超滤浓缩，浓缩后按照双歧杆菌与乳杆菌混合发酵的上清液与芽孢杆菌发酵上清液体积比为3-5：1配比混合，再加入低聚异麦芽糖搅拌均匀后，喷雾干燥；

(7)将步骤(3)获得的双歧杆菌和乳酸菌的混合冻干菌粉与步骤(5)获得的芽孢杆菌的冻干菌粉按重量比50-150：1的比例混合，再与步骤(6)所获得的喷雾干燥粉按照重量比1：50-150混合，即为所述的微生态制剂。

在本发明中，优选的，所述的动物双歧杆菌的保藏编号为CICC 21711，所述的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌的保藏编号分别为CICC 22150、CICC 22703、CICC 23609以及CICC 23488，所述的枯草芽孢杆菌的保藏编号分别为CICC 20532，所述的地衣芽孢杆菌包括两种保藏编号不同的菌株，其保藏编号分别为CICC 20083以及CICC20446，以上菌种均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

在本发明中，优选的，所述的双歧杆菌固体培养基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温80 1.0g，K₂HPO₄2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，ZnSO₄·7H₂O 0.25g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，蒸馏水定容至1L，pH 6.2～6.4，121℃20分钟高压灭菌，双歧杆菌液体培养基的配制同固体培养基，但不加琼脂；所述的乳酸杆菌固体培养基按照以下配制：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，CaCO₃ 20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH6.8，121℃20分钟高压灭菌，乳酸杆菌液体培养基的配制同固体培养基，但不加琼脂；所述的芽孢杆菌固体培养基按照以下配制：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0，121℃20分钟高压灭菌。芽孢杆菌液体培养基的配制同固体培养基，但不加琼脂。

在本发明中，优选的，所述的增菌培养基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温80 500ml，K₂HPO₄ 2.0g，乙酸钠5.0g，蒸馏水定容至1L，pH 6.2～6.4，121℃20分钟高压灭菌。

在本发明中，优选的，所述的冻干保护剂为含有18％(w/w)脱脂奶粉、1％乳糖(w/w/)的0.5％(v/v)甘油溶液，所述的冻干保护剂按照体积比为1:1的比例加入到菌泥中。

在本发明中，优选的，所述的超滤浓缩为采用0.22pm的滤膜进行超滤浓缩。

在本发明中，优选的，步骤(6)中低聚异麦芽糖的终浓度为10％(w/w)。

在本发明中，优选的，步骤(6)中双歧杆菌与乳杆菌混合发酵的上清液与芽孢杆菌发酵上清液按照体积比4：1配比混合，步骤(7)中将步骤(3)获得的双歧杆菌和乳酸菌的混合冻干菌粉与步骤(5)获得的芽孢杆菌的冻干菌粉按重量比100：1的比例混合，再与步骤(6)所获得的喷雾干燥粉按照重量比1：100混合。

在本发明中，优选的，所述的微生态制剂中动物双歧杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌的总菌数≥1010CFU/g，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的总菌数≥10⁷CFU/g。

本发明采用了科学的冷冻干燥技术和发酵代谢生物活性物质的分离喷雾干燥技术，根据动物肠道的生理特点合理配比使用各种益生菌及益生素，使得得到的产品富含大量的生物活性物质(免疫因子、多肽抗菌素、细菌素、促生长物质、多种消化酶类及多种益生菌)，研究表明本发明的微生物制剂能够有效治疗和预防动物细菌性腹泻和消化不良性腹泻，调节消化机能，提高动物机体免疫力和抗应激能力，促进动物生长。

因此，更进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的微生态制剂在制备预防或治疗动物肠道细菌性腹泻和消化不良性腹泻、提高动物机体免疫力和抗应激能力、增强动物消功能以及促进动物生长的饲料添加剂中的用途。

本发明的微生态制剂的推广应用，将规避动物肠道疾病对抗生素的依赖性，推动动物微生态应用技术进步，同时产生巨大社会效益和经济效益。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1用于治疗和预防畜禽消化道疾病的微生态制剂的制备

1、生产菌种和培养基：

1.1动物双歧杆菌(CICC 21711)

双歧杆菌固体培养基配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，ZnSO₄·7H₂O 0.25g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH 6.2～6.4，121℃20分钟高压灭菌。若配制双歧杆菌液体培养基则不加琼脂。

1.2植物乳杆菌(CICC 22703)、干酪乳杆菌(CICC 23488)、乳酸乳球菌(CICC23609)、嗜酸乳杆菌(CICC 22150)

乳酸杆菌固体培养基制作：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，CaCO₃ 20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH6.8，121℃20分钟高压灭菌。若配制乳酸杆菌液体培养基则不加琼脂。

1.3枯草芽孢杆菌(CICC 20532)、地衣芽孢杆菌(CICC 20083)、地衣芽孢杆菌(CICC 20446)

芽孢杆菌培养固体基制作：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0，121℃20分钟高压灭菌。若配制芽孢杆菌液体培养基则不加琼脂。

2、成品生产流程

(1)将动物双歧杆菌(CICC 21711)菌种接种于双歧杆菌固体培养基上，37℃培养48小时，挑取2环接种于100ml双歧杆菌液体培养基中，37℃培养20小时，再将100ml培养液接种于1000ml双歧杆菌液体培养基中，37℃培养12小时。

(2)将嗜酸乳杆菌(CICC 22150)、植物乳杆菌(CICC 22703)、乳酸乳球菌(CICC23609)、干酪乳杆菌(CICC 23488)菌种分别接种于乳酸杆菌固体培养基上，37℃培养48小时，各菌种挑取2环分别接种于100ml乳酸杆菌液体培养基中37℃培养20小时，再将各菌液100ml培养液分别接种于1000ml乳酸杆菌液体培养基中，37℃培养12小时。

(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的全部培养液混合后，按照1％(v/v)的接种量接种于含有增菌培养基(培养基成分：蛋白胨5g，牛肉膏5g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖10g，吐温80 500ml，K₂HPO₄ 2g，乙酸钠5g，蒸馏水定容至1L，pH 6.2～6.4，121℃20分钟高压灭菌)的1000升厌氧发酵罐中，37℃增菌培养12小时，1000转/分离心5分钟，获得双歧杆菌与乳杆菌混合发酵的上清液和菌泥，收集菌泥，按照保护剂与菌泥体积比为1:1的比例加入冻干保护剂(含有18％(w/w)脱脂奶粉、1％乳糖(w/w/)的0.5％(v/v)甘油溶液)，-60℃速冻4小时，放入冷冻干燥机中冻干32小时收集得到双歧杆菌与乳杆菌的混合冻干菌粉。

(4)将枯草芽孢杆菌(CICC 20532)、地衣芽孢杆菌(CICC 20083)、地衣芽孢杆菌(CICC 20446)菌种分别接种于芽孢杆菌固体培养基上，37℃培养20小时，各菌种挑取2环分别接种于100ml芽孢杆菌液体培养基中，放入摇床中，210转/分，37℃培养12小时，分别取100ml培养液接种于1000ml芽孢杆菌液体培养基，放入中摇床中，210转/分，37℃培养12小时。

(5)将步骤(4)得到的全部培养液混合后，按照1％(v/v)的接种量接种于1000升含有芽孢杆菌液体培养基的发酵罐中37℃增菌培养12小时，1000转/分离心5分钟，获得芽孢杆菌发酵上清液和菌泥，收集菌泥，按照冻干保护剂与菌泥体积比为1:1的比例加入冻干保护剂(含有18％(w/w)脱脂奶粉、1％乳糖(w/w/)的0.5％(v/v)甘油溶液)，-60℃速冻4小时，放入冷冻干燥机中冻干32小时收集得到芽孢杆菌的冻干菌粉。

(6)收集步骤(3)和步骤(5)离心后的发酵上清液，分别采用0.22pm的滤膜超滤浓缩，浓缩后按照双歧杆菌与乳杆菌发酵上清液与芽孢杆菌发酵上清液体积比4：1配比混合，再加入10％(w/w)的低聚异麦芽糖搅拌均匀后，喷雾干燥。

(7)将步骤(3)获得的双歧杆菌和乳酸菌的混合冻干菌粉与步骤(5)获得的芽孢杆菌的冻干菌粉按重量比100：1的比例混合，再与步骤(6)所获得的喷雾干燥粉按照重量比1：100混合，即为本发明所述的微生态制剂。

本发明得到的微生态制剂中动物双歧杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌的总菌数≥10¹⁰CFU/g，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的总菌数≥10⁷CFU/g。

实施例2本发明的微生态制剂对保育猪生长的影响

1、试验材料

微生态制剂干燥粉剂，按照实施例1方法制备。

2、实验方法：

选择同一批断奶的仔猪，分成三组，各自将病仔猪挑出。分别是对照组，微生态制剂组，抗生素组(使用的抗生素药物是：康泰欣)。三组日粮成分相同，饲喂方法：三组均常规饲喂，微生态制剂组将微生态制剂5g，用水稀释200ml，在每日的6点、17点，两个时间定量加入饲料中，每天10点清理粪便，记录相应的采食量，粪便情况，疾病情况)。

3、试验结果

微生态制剂对保育猪生长性能的影响如下表1所示，保育猪增重耗料成本预算如下表2所示：

表1微生态制剂对保育猪生长性能的影响

表2保育猪增重耗料成本预算

从表1结果可以看出，微生态制剂组与对照组和抗生素组相比，腹泻率明显降低，在初始重量较低的情况每日增重水平均高于对照组，并且料肉比下降显著，证明该微生态制剂的使用提高了饲料转化率，粪便成型，猪舍臭味明显降低，饲养环境得到良好改善。

从表2结果可以看出，保育猪饲喂微生态制剂31天，节省饲料成本比对照组少56.48元，比抗生素组少47.36元，给养殖户带来明显经济效益。

实施列3母猪饲喂微生态制剂的效果及对仔猪生长的影响

1、试验材料

微生态制剂干燥粉剂，按照实施例1方法制备。

2、试验方法及结果

选择8头母猪，随机分成2组，分别是对照组，微生态制剂组，2组日粮成相同，饲喂方法：2组均常规饲喂，微生态制剂组将微生态制剂4g，用水稀释200ml，在每日的6点、17点，两个时间定量加入饲料中，每天10点清理粪便，记录仔猪粪便、疾病等情况)，结果如下表3所示。

表3母猪饲喂微生态制剂对仔猪生长的影响

从表3结果可以看出，使用微生态制剂饲喂母猪，对仔猪生长影响明显，无论在降低腹泻还是增重上都有显著效果。

实施列4饲喂微生态制剂菌制剂对鸡生长的影响

1、试验材料

微生态制剂干燥粉剂，按照实施例1方法制备。

2、试验方法及结果

2.1肉鸡饲喂微生态制剂菌制剂的效果

选择9005只肉鸡土随机分成2组，分别是对照组，微生态制剂组，2组日粮成相同，饮水方法：1000只鸡每日用量1克，将微生态制剂干燥粉剂加入葡萄糖盐水(糖1％,盐0.2％，)中稍微搅拌均匀后加入饮水容器中供鸡饮用(加水量在3小时内饮用完)，连续饮水14天即可。14天后每天各2天饮用一次。观察鸡生长情况。结果如下表4所示。

表4肉鸡土饲喂微生态制剂20天后的结果

从表4可以看出每1000羽节省饲料34斤，死亡率降低1.6％，出栏单只母鸡增重195g，公鸡单只增重125g。

2.2麻鸡饲喂微生态制剂菌制剂的效果

选择8000只麻鸡随机分成2组，分别是对照组，微生态制剂组，2组日粮成相同，饮水方法：1000只鸡每日用量1克，将微生态制剂干燥粉剂加入葡萄糖盐水(糖1％,盐0.2％，)中稍微搅拌均匀后加入饮水容器中供鸡饮用(加水量在3小时内饮用完)，连续饮水14天即可。14天后每天各2天饮用一次。观察鸡生长情况。结果如下表5所示。

表5麻鸡饲喂微生态制剂结果

从表5可以看出每1000羽节省饲料5kg，死亡率降低1.8％，出栏单只增重100g，死亡率也明显下降，出栏重量比对照组显著提高，鸡粪便降氨方面有所明显改善。

综上所述，本发明提供了一种能够有效地治疗及预防动物肠道疾病、调节动物肠道微生态平衡、增强动物免疫力和抗应激能力的微生态制剂，本发明的微生态制剂通过直接饲喂、饮水或添加到饲料中可治疗和预防动物细菌性腹泻和消化不良性腹泻，调节消化机能，提高动物机体免疫力和抗应激能力，促进动物生长，成本低见效快，可替代抗生素药物治疗动物肠道疾病，提高动物的成活率，降低生产成本。

Claims

1.一种用于治疗和预防畜禽消化道疾病的微生态制剂，其特征在于通过以下方法制备得到：

2.如权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于所述的动物双歧杆菌的保藏编号为CICC 21711，所述的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌的保藏编号分别为CICC 22150、CICC 22703、CICC 23609以及CICC 23488，所述的枯草芽孢杆菌的保藏编号分别为CICC 20532，所述的地衣芽孢杆菌包括两种保藏编号不同的菌株，其保藏编号分别为CICC 20083以及CICC 20446，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

3.如权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于所述的双歧杆菌固体培养基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，ZnSO₄·7H₂O 0.25g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，蒸馏水定容至1L，pH 6.2～6.4，121℃20分钟高压灭菌，双歧杆菌液体培养基的配制同固体培养基，但不加琼脂；所述的乳酸杆菌固体培养基按照以下配制：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，CaCO₃ 20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH6.8，121℃20分钟高压灭菌，乳酸杆菌液体培养基的配制同固体培养基，但不加琼脂；所述的芽孢杆菌固体培养基按照以下配制：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0，121℃20分钟高压灭菌，芽孢杆菌液体培养基的配制同固体培养基，但不加琼脂。

4.如权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于所述的增菌培养基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温80 500ml，K₂HPO₄2.0g，乙酸钠5.0g，蒸馏水定容至1L，pH 6.2～6.4，121℃20分钟高压灭菌。

5.如权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于所述的冻干保护剂为含有18％(w/w)脱脂奶粉、1％乳糖(w/w/)的0.5％(v/v)甘油溶液，所述的冻干保护剂按照体积比为1:1的比例加入到菌泥中。

6.如权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于所述的超滤浓缩为采用0.22pm的滤膜进行超滤浓缩。

7.如权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于步骤(6)中低聚异麦芽糖的终浓度为10％(w/w)。

8.如权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于步骤(6)中双歧杆菌与乳杆菌混合发酵的上清液与芽孢杆菌发酵上清液按照体积比4：1配比混合，步骤(7)中将步骤(3)获得的双歧杆菌和乳酸菌的混合冻干菌粉与步骤(5)获得的芽孢杆菌的冻干菌粉按重量比100：1的比例混合，再与步骤(6)所获得的喷雾干燥粉按照重量比1：100混合。

9.如权利要求1-8任一项所述的微生态制剂，其特征在于所述的微生态制剂中动物双歧杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌的总菌数≥10¹⁰CFU/g，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的总菌数≥10⁷CFU/g。

10.权利要求1-9任一项所述的微生态制剂在制备预防或治疗动物肠道细菌性腹泻和消化不良性腹泻、提高动物机体免疫力和抗应激能力、增强动物消化功能以及促进动物生长的饲料添加剂中的用途。