CN112779196B

CN112779196B - 一种用于降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112779196B
Application number: CN202110331730.XA
Authority: CN
Inventors: 黄卫强; 高旭; 赵树平
Original assignee: Inner Mongolia Sci Plus Biotech Co ltd
Current assignee: Inner Mongolia Sci Plus Biotech Co ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: CN112779196A

Abstract

本申请提供用于降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂及其制备方法和应用，所述复合益生菌制剂包括乳酸片球菌PA‑19、植物乳杆菌P‑8、动物双歧杆菌乳亚种V9、乳双歧杆菌Probio‑M8，所述复合益生菌制剂中仅包括益生菌及其代谢产物，而不包括其它药用性成分，从而调整猪肠道内菌群平衡、免疫力增强，降低便秘发病率，使妊娠期和哺乳期母猪处于健康状态，进而使得初生仔猪具有良好的健康状况。

Description

一种用于降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于微生物技术领域，特别涉及一种用于降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂及其制备方法和应用。

背景技术

生猪养殖是传统行业，也是现代养殖业中的重要一环。近年现代化生猪养殖蓬勃发展的过程中，部分养殖场滥用抗生素和化学药物，导致动物的肠道内菌群平衡严重紊乱、肠粘膜变薄、免疫力降低，整体处于亚健康状态，因此现代养猪业中，不仅需要规模化、集约化、现代化，更需要绿色化、安全化、无抗化。在养猪生产中，决定生产水平和经济效益的重要环节是妊娠和哺乳母猪的健康养殖，而便秘问题又是妊娠和哺乳母猪的最常见、影响最大的问题，尤其是妊娠中后期，便秘发生率大约为30％～40％，部分养殖场甚至高达60％～70％。便秘会导致妊娠母猪精神、食欲不振，采食量和饮水量下降，分娩过程延长甚至难产，严重者出现死胎或产后泌乳障碍，诱发初生仔猪腹泻率高、健仔率低，给养猪生产造成损失。

发明内容

本申请提供一种能够降低母猪，特别是妊娠期母猪便秘发病率的复合益生菌制剂，所述复合益生菌制剂中仅包括益生菌及其代谢产物，而不包括其它药用性成分，从而调整猪肠道内菌群平衡、肠粘膜厚度适当、免疫力增强，使妊娠期母猪处于健康状态，进而使得初生仔猪具有良好的健康状况。

本发明目的是提供一种用于降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂，所述复合益生菌制剂包括乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9、乳双歧杆菌Probio-M8。

在一种可实现的方式中，所述复合益生菌制剂包括乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉、乳双歧杆菌Probio-M8菌粉和稀释载体，其中，基于所述复合益生菌制剂中稀释载体的重量，每种益生菌粉中活菌数量均≥2×10¹¹CFU/g。

在本申请中，所用术语″菌粉″由菌剂干燥而得，可选地，菌粉中还可以包括食品药品中可接受的辅料。

在本申请中，所述乳酸片球菌PA-19，已于2020年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.19881，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，该菌株分离自奶酪。所述乳酸片球菌PA-19具备优良的益生特性，研究表明该菌株具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道有凝集作用，所述凝集作用包括自凝集作用和它凝集作用，所述乳酸片球菌PA-19还具备抑制常见肠道致病菌生长特性。

所述植物乳杆菌P-8，已于2012年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.6312，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌株是2003年从内蒙古自治区牧民家庭中的自然发酵酸牛奶中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株。采用体外实验、动物模型和人体试验对该菌株的益生功能进行系统评价，并利用基因组学的手段对该菌株的益生机制进行深入剖析。已经证实该菌株具有优异的胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，调节血脂代谢，对肝脏具有保护修复作用，提高机体免疫能力。

所述动物双歧杆菌乳亚种V9，已于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5470，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)。该菌株是2005年分离自内蒙古草原上健康蒙古族儿童肠道中的具有优良益生特性的动物双歧杆菌乳亚种。采用体外实验、动物模型和临床试验对菌株的益生功能进行系统评价，并利用基因组学的手段对菌株的益生机制进行深入剖析。目前已经证实该菌株具有优异的胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，拮抗肠道致病菌，提高肠道抗致病菌感染能力，预防和缓减腹泻、便秘、腹痛、腹胀等肠易激综合症。

所述乳双歧杆菌Probio-M8，已于2019年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.18610，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。该菌株是2017年从母乳中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株，对胃肠消化液具有良好的耐受性，能够以活的状态进入人体和动物肠道并调节菌群结构。

对妊娠及哺乳期母猪进行养殖使用所述复合益生菌制剂，特别地，所述复合益生菌制剂中总活菌含量为5×10¹⁰CFU/g以上，能够降低不同阶段母猪便秘发病率，提高哺乳母猪采食量和饮水量，减少掉膘加快体况恢复并促进泌乳，提高乳仔猪健仔率，降低哺乳期间仔猪腹泻发病率，缩短腹泻治疗天数，降低仔猪死淘率，提高平均日增重。此外还可降低产房氨和硫化氢浓度，优化产房环境。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂，所述复合益生菌制剂包括乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉、乳双歧杆菌Probio-M8菌粉，可选地，还可以包括释载体。

在一种可实现的方式中，基于所述复合益生菌制剂中稀释载体的重量，每种益生菌菌粉中活菌数量均≥2×10¹¹CFU/g。

在本申请中，所述菌剂包括活菌菌体、死菌菌体以及活菌的代谢产物。

进一步地，所述乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉、乳双歧杆菌Probio-M8菌粉的重量比为(1～3)∶(1～3)∶(1～3)∶(1～3)，优选为1∶1∶2∶2。

在一种可实现的方式中，所述复合益生菌制剂中还包括稀释载体，所述稀释载体包括麦芽糊精。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述复合益生菌制剂的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1，制备乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉和乳双歧杆菌Probio-M8菌粉；

步骤2，将步骤1制得的乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉、乳双歧杆菌Probio-M8菌粉按预设比例进行混合，并加入稀释载体进行复配，制得复合益生菌制剂。

在一种可实现的方式中，步骤1包括以下步骤：

步骤1-1，分别将4株发酵菌种单独进行高密度发酵；

步骤1-2，向发酵经离心后的乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂、乳双歧杆菌Probio-M8菌剂的菌体中分别按照各自菌体与保护剂溶液质量比1∶(5-10)的比例添加保护剂，混匀分别获得各菌对应的菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，分别得到乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉、乳双歧杆菌Probio-M8菌粉。

进一步地，步骤1-1包括：

步骤1-1-1，分别取一环活化后的乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9、乳双歧杆菌Probio-M8的斜面菌体，分别接种至MRS培养基中，在第一预设温度下，以第一预设转速条件下培养第一预设时间，分别得到各益生菌的一级种子液。

可选地，所述第一预设温度为33℃～37℃，所述第一预设转速为50rpm～100rpm，所述第一预设时间为18h～24h。

优选地，培养各益生菌的温度相同，和/或，转速相同，和/或，培养时间相同。

步骤1-1-2，将步骤1-1-1培养好的一级种子液按接种量3％～10％(v/v)转接入MRS培养基进行二次活化，活化第二预设时间后得二级种子液。

可选地，所述第二预设时间为18～24h。

优选地，活化各益生菌所用时间相同。

步骤1-1-3，将步骤1-1-2获得的三种二级种子液分别按照相同接种量3％～10％(v/v)各自接入到相应的发酵罐培养基中，在第三预设温度下，以第三预设转速和第三通风量下培养第三预设时间，发酵全程调节发酵液保持为预设pH值，分别得到植物乳杆菌P-8最终发酵液、植物乳杆菌KT-Lp9最终发酵液、乳酸片球菌PA-19最终发酵液，其中，基于所述发酵罐培养基的总体积，所述发酵罐培养基包括以下配比的组分：蔗糖50～80g/L，酵母粉20～40g/L，大豆蛋白胨8～20g/L，MgSO₄·7H₂O1.5～2.0g/L，MnSO₄·5H₂O0.08～0.12g/L，吐温-80 0.8～1.0g/L，余量为水，pH＝7.0。

可选地，所述第三预设温度为33～37℃，所述第三预设转速为50～100rpm，所述第三预设通风量为0.3～1L/min，所述第三预设时间为8～12小时，所述预设pH值为5.6～6.2。

优选地，本步骤中，发酵各益生菌的温度相同，和/或，转速相同，通风量相同，发酵时间相同，体系pH值相同。

步骤1-1-4，将步骤1-1-3所得各菌的最终发酵液分别第四预设转速离心第四预设时间，收集各益生菌菌剂，所述益生菌菌剂包括活菌、死菌菌体及其代谢产物。

可选的，所述第四预设转速为5000rpm～12000rpm，所述第四预设时间为5min～15min。

优选地，分离各益生菌所用的转速相同，和/或，分离时间相同。

在一种可实现的方式中，基于所述复合益生菌的总重量，所述复合益生菌制剂中，活菌总数大于5×10¹⁰CFU/g。

经粉末包装机充氮气填充将所述复合益生菌剂进行分装，1kg/袋。

进一步地，步骤1-1-3中，所述乳酸片球菌PA-19最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液、动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液、乳双歧杆菌Probio-M8最终发酵液的各自活菌数均达到1×10¹⁰CFU/ml以上。

进一步地，所述保护剂的配方包括如下配比的组分(g/L)：

进一步地，所述稀释载体为麦芽糊精。

本申请还提供所述复合益生菌制用于制备妊娠及哺乳母猪健康养殖制品的用途。

可选地，在妊娠及哺乳母猪饮水中添加所述复合益生菌制剂，可选地，所述复合益生菌制剂的添加量为每吨水加入20g所述复合益生菌制剂，特别地，所述饮用水不添加漂白粉等杀菌剂。

在另一种可实现的方式中，所述复合益生菌制剂还可以用于制备其它猪饲料添加剂的原料。

报道显示，猪肠道内约有30多个属，500多种微生物，主要为需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌，其中，肠道中益生菌大部分以厌氧菌为主，主要有双歧杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属和肠球菌属。本申请提供的复合益生菌制剂能够显著改善母猪肠道菌群，增强机体免疫力，优化健康水平。

与现有技术相比，本申请提供的复合益生菌制剂包括乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉、乳双歧杆菌Probio-M8菌粉以及稀释载体，可用于妊娠及哺乳母猪健康养殖，能够提高母猪生产性能及整体健康养殖水平，主要表现为：降低母猪便秘发病率，改善妊娠和哺乳母猪肠道菌群，降低便秘发病率，提高哺乳母猪采食量和饮水量，减少掉膘促进泌乳，提高母仔猪健康水平，提高乳仔猪健仔率及平均日增重，降低腹泻程度及发病率和死淘率。同时提高哺乳母猪采食量和饮水量，减少掉膘加快体况恢复并促进泌乳，提高乳仔猪健仔率，降低哺乳期间仔猪腹泻发病率，缩短腹泻治疗天数，降低仔猪死淘率，提高平均日增重。并且可降低产房氨和硫化氢浓度，优化产房环境。

附图说明

图1示出母猪便秘情况统计结果；

图2示出3日龄仔猪腹泻情况统计结果；

图3示出乳仔猪腹泻治愈时间统计结果；

图4示出产房氨浓度测定结果；

图5示出产房中硫化氢浓度测定结果；

图6示出母猪饮水过程中水系统中乳酸菌数检测结果；

图7示出粪污中大肠菌群检测结果；

图8示出哺乳母猪饮水量统计结果；

图9示出哺乳母猪采食量统计结果；

图10示出母猪妊娠中后期及产后便秘情况统计结果；

图11示出平均健仔率统计结果；

图12示出乳仔猪腹泻情况统计结果；

图13示出乳仔猪死淘率统计结果；

图14示出乳仔猪平均日增重统计结果。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。

下面通过具体的实施例对本申请提供的用于降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂及其制备方法进行详细阐述。

实施例

实施例1乳酸片球菌PA-19耐酸、耐胆盐特性及其抑菌特性实验

将冷冻保存的乳酸片球菌PA-19接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养18h，如此传代培养2次得到活化发酵液；

所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

耐酸、耐胆盐特性：

在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS缓冲液中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液；将活化好的菌株离心收集菌体，加入与培养基等量的pH2.5模拟胃液，37℃培养3h，于0h、3h用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。

在pH8.0(用0.1mol/L NaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液；将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃培养，于4h、8h用MRS琼脂培养基倾注法测活菌数，试验结果见表1：

存活率＝[N1/N0]×100％(N0-0h活菌数；N1-经模拟肠、胃液消化后的活菌数)

表1 PA-19人工模拟胃液和肠液的存活率

抑菌特性：

用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定乳酸片球菌PA-19发酵液的抑菌效果：将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(106cfu/ml)一起倒入平板混匀。待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。

每孔加入100μL乳酸片球菌PA-19发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果见表2：

表2乳酸片球菌PA-19的抑菌特性

注：打孔器直径为8mm

由表1、表2试验结果可知，PA-19菌株具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，同时具有广谱抑制致病菌的优良特性。

实施例2一种降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂的制备

分别将乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9、乳双歧杆菌Probio-M8单独进行高密度发酵：分别取一环活化后的乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9、乳双歧杆菌Probio-M8的斜面菌体，各自分别接种至MRS培养基中，在相同温度37℃，相同转速100rpm条件下培养24h，分别得到一级种子液；将培养好的一级种子液按接种量10％(v/v)再次转接入MRS培养基进行二次活化，活化时间24h后得二级种子液；将二级种子液分别按照相同接种量3％～10％(v/v)分别各自接入到不同的发酵罐培养基中，温度均为37℃，转速均为100rpm，通风量均为1L/min，发酵全程调节发酵液相同pH值为6.0条件下培养12小时，分别得到乳酸片球菌PA-19最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液、动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液、乳双歧杆菌Probio-M8最终发酵液，将得到的上述最终发酵液分别经12000rpm，10min离心收集菌体；

发酵罐培养基(g/L)：蔗糖50，酵母粉20，大豆蛋白胨10，MgSO₄·7H₂O 1.5，MnSO₄·5H₂O 0.08，吐温-80 0.8，余量为水，pH＝7.0。

向经离心后的乳酸片球菌PA-19、植物乳杆菌P-8、动物双歧杆菌乳亚种V9、乳双歧杆菌Probio-M8菌剂的菌体中分别按照各自菌体与保护剂溶液按照重量比为1∶10的比例添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将菌悬液经冷冻干燥，分别得到乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂、乳双歧杆菌Probio-M8菌剂。

保护剂溶液的配方如下(g/L)：脱脂乳粉30，脱盐乳清粉15，工业海藻糖15，维生素C3，卵磷脂0.05，余量为蒸馏水。

乳酸片球菌PA-19最终发酵液、植物乳杆菌P-8最终发酵液、动物双歧杆菌乳亚种V9最终发酵液、乳双歧杆菌Probio-M8最终发酵液中各自活菌数均达到10¹⁰CFU/ml以上。

基于所述复合益生菌制剂中稀释载体的重量，乳酸片球菌PA-19菌剂中活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌P-8菌剂中活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂中活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，乳双歧杆菌Probio-M8菌剂中活菌数量≥2×10¹¹CFU/g。

实施例3一种降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂的制备

复配混合：将由实施例2制备的乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂、乳双歧杆菌Probio-M8菌剂按照重量比1∶1∶2∶2进行混合，并加入稀释载体脱脂乳粉进行复配，制备复合益生菌制剂，其中，基于所述复合益生菌制剂的总重量，各菌剂中活菌总数分别为5×10¹⁰CFU/g；

经粉末包装机充氮气填充将复合益生菌剂进行分装，1kg/袋。

实施例4一种降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂的制备

复配混合：将由实施例1制备的乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂、乳双歧杆菌Probio-M8菌剂按质量比1∶1∶1∶1进行混合，并加入稀释载体脱脂乳粉进行复配，制备复合益生菌制剂，其中，基于所述复合益生菌制剂的总重量，各菌剂中活菌总数分别为5×10¹⁰CFU/g；

经粉末包装机充氮气填充将复合益生菌剂进行分装，1kg/袋。

实施例5一种降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂的制备

复配混合：将由实施例1制备的乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂、乳双歧杆菌Probio-M8菌剂按质量比2∶2∶1∶1进行混合，并加入稀释载体脱脂乳粉进行复配，制备复合益生菌剂，其中，基于所述复合益生菌制剂的总重量，各菌剂中活菌总数为5×10¹⁰CFU/g；

经粉末包装机充氮气填充将复合益生菌剂进行分装，1kg/袋。

实施例6一种降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂的应用

利用实施例3制备的复合益生菌剂，选择活菌总数为5×10¹⁰CFU/g复合益生菌剂，对母猪进行饮水食用，添加量为每吨水20g、25g和30g。

实施例7复合益生菌制剂对围产母猪便秘及其乳仔猪腹泻的影响验证实验

(1)复合益生菌剂的使用方法：

选取胎次、体况一致的145头妊娠90天大约克×长白母猪，其中实验组74头、对照组71头，实验组饮水添加上述实施例3制备的复合益生菌制剂进行养殖，对照组按原饲养方式养殖，具体方法为：将复合益生菌制剂用10倍重量的饮用水进行充分溶解后，添加到试验母猪饮水箱中，添加量为每吨饮用水添加复合益生菌制剂20克。

(2)研究方法：

母猪便秘率情况统计：分别在妊娠90天，妊娠110天，临产，产后10天，产后20天5个时间点，统计实验组和对照组母猪便秘情况并记录；

仔猪腹泻情况统计：统计实验组和对照组母猪全部分娩结束后，仔猪3日龄的腹泻情况，并统计所有腹泻仔猪的平均治疗天数。

(3)试验结果：

母猪便秘情况统计结果如图1所示，妊娠90天实验组和对照组母猪便秘率分别为28％和26％，组间差异较小；妊娠110天实验组和对照组母猪便秘率分别为17％和28％，组间差异显著(P＜0.05)；临产时实验组和对照组母猪便秘率分别为9％和32％，组间差异显著(P＜0.01)；产后10天实验组和对照组母猪便秘率分别为11％和23％，组间差异显著(P＜0.05)；产后20天实验组和对照组母猪便秘率分别为7％和16％，组间差异显著(P＜0.05)。可见，母猪饮水添加复合益生菌制剂，能够显著降低妊娠期和哺乳期母猪便秘发病率。

3日龄仔猪腹泻情况统计结果如图2所示，实验组和对照组仔猪腹泻率分别为30.7％和51.4％，组间差异显著(P＜0.001)。可见，母猪饮水添加复合益生菌制剂，可帮助新生仔猪尽快建立成熟的肠道菌群，增强新生仔猪免疫力，进而降低新生仔猪腹泻率。

进一步，试验过程中所有腹泻仔猪均使用抗生素治疗(头孢每头0.6毫升肌肉注射，恩诺沙星每头0.5毫升肌肉注射)，实验组和对照组平均治愈时间分别为2.4和3.2天，可见，母猪饮水添加复合益生菌，或可通过改善母猪肠道菌群、提升母猪乳汁中的免疫活性物质，并通过哺乳过程将更多地有益微生物和免疫物质垂直传递到仔猪肠道中，从而促进仔猪提早建立成熟肠道菌群及免疫系统，进而降低乳仔猪腹泻发病率或腹泻程度，提高头孢、恩诺沙星等治疗腹泻抗生素的效价，缩短治疗天数。

实施例8复合益生菌制剂对围产母猪产房有害气体浓度，饮水及粪污中微生物的影响验证实验

(1)复合益生菌剂的使用方法：

选取胎次、体况一致的179头产前1周的长白×大约克母猪，实验组89头，对照组90头，实验组饮水添加上述实施例3制备的复合益生菌制剂进行养殖，对照组按原饲养方式养殖，具体方法为：将复合益生菌制剂用10倍重量的饮用水进行充分溶解后，添加到试验母猪饮水箱中，添加量为每吨饮用水添加复合益生菌制剂20克。此外，设置两个辅助实验组，分别为每吨饮用水添加复合益生菌制剂25克和30克。

(2)研究方法：

氨浓度测定结果：采用固定式氨气检测仪检测产房中氨浓度。

硫化氢浓度测定结果：参照中华人民共和国国家标准GB/T 14678-1993，采用火焰光度检测法测定产房硫化氢浓度。

乳酸菌数检测：参照中华人民共和国国家标准GB 4789.35-2016，采用微生物培养的方法测定母猪饮水添加复合益生菌制剂10分钟、30分钟、1小时、3小时4个时间点样品中的乳酸菌活菌数。

大肠菌群数检测：参照中华人民共和国行业标准NYT555-2002，采用微生物培养的方法测定产房粪池的粪污样品中的大肠菌群数。

(3)试验结果：

产房氨浓度测定结果如图4所示，产后1周，实验组和对照组产房氨浓度分别为7.7±0.7和8.9±0.8ppm，实验组显著低于对照组(P＜0.05)，产后3周，实验组和对照组圈舍氨浓度分别为8.4±0.8和11.2±0.7ppm，实验组显著低于对照组(P＜0.001)。其中，每吨饮用水添加25克和30克组只统计产后1周数据，产房氨浓度分别为7.6±0.8和7.7±0.2ppm，实验组显著低于对照组(P＜0.05)。可见，母猪饮水添加复合益生菌制剂，能够显著降低产房中氨浓度。

产房中硫化氢浓度测定结果如图5所示，产后1周，实验组和对照组圈舍硫化氢浓度分别为3.8±0.6和4.6±0.6ppm，实验组低于对照组。产后3周，实验组和对照组产房硫化氢浓度分别为4.1±0.6和5.5±0.7ppm，实验组显著低于对照组(P＜0.05)。其中，每吨饮用水添加25克和30克组只统计产后1周数据，产房硫化氢浓度分别为3.9±0.8和3.8±0.3ppm，实验组均低于对照组。可见，母猪饮水添加复合益生菌制剂，能够有效降低产房中硫化氢浓度。

经观察2.5-3小时内母猪可喝完饮水系统中的水，因此最长检测时间设置为3小时。检测母猪饮水添加复合益生菌制剂10分钟、30分钟、1小时、3小时四个时间点样品中的乳酸菌活菌数，结果如图6所示，四个时间点饮水中乳酸菌数分别为5.65±0.21，5.65±0.28，5.63±0.24，5.61±0.26lg CFU/g，对照组饮水中未检测到乳酸菌活菌。每吨水添加25克和30克组别未做统计。可见，饮水系统中添加益生菌10分钟后可均匀分散到水相中，并且母猪饮水期间，益生菌可持续保持活性，即母猪在饮水过程中可将预定量的复合益生菌活菌摄入体内。

粪污中大肠菌群检测结果如图7所示产后1周，实验组和对照组产房粪污中大肠菌群的数量分别为5.24±0.32和6.05±0.43lg CFU/g，实验组显著低于对照组(P＜0.05)。产后3周，实验组和对照组产房粪污中大肠菌群的数量分别为5.19±0.36和6.26±0.31lgCFU/g，实验组显著低于对照组(P＜0.05)。每吨水添加25克和30克组别未做统计。可见，母猪饮水中添加复合益生菌制剂，能够显著降低产房粪污中大肠菌群数，进而改善产房微生态环境。

实施例9复合益生菌制剂对围产母猪便秘及其乳仔猪腹泻的影响验证实验

(1)复合益生菌剂的使用方法：

选取胎次、体况一致的462头长白×大约克妊娠母猪，其中实验组233头、对照组229头，实验组饮水添加上述复合益生菌制剂进行养殖，对照组按原饲养方式养殖，具体方法为：将复合益生菌制剂用10倍重量的饮用水进行充分溶解后，添加到试验母猪饮水系统中，添加量为每吨饮用水添加复合益生菌制剂20克，此外，还设计两个辅助实验组，复合益生菌添加量分别为每吨饮用水添加25克和30克，并统计部分数据。

(2)研究方法：

哺乳母猪饮水量和采食量统计：通过记录水表和称料器，统计参试母猪哺乳期间每日饮水量和采食量。

母猪便秘率情况统计：分别在产前4周，产前3周，产前2周，产前1周，产前1天，产后1周，产后2周，产后3周8个时间点，统计实验组和对照组母猪便秘情况并记录；

初生仔猪平均健仔率统计：分别在产前4周，产前3周，产前2周，产前1周，产前1天，产后1周，产后2周，产后3周8个时间点，统计实验组和对照组母猪便秘情况并记录；

乳仔猪腹泻情况统计：统计实验组和对照组仔猪3日龄和21日龄断奶前的腹泻情况；

断奶前乳仔猪死淘率统计：统计实验组和对照组乳仔猪死淘率；

断奶前乳仔猪平均日增重统计：统计实验组和对照组乳仔猪平均日增重。

(3)试验结果：

哺乳母猪饮水量统计结果如图8所示，实验组和对照组母猪哺乳期间平均饮水量分别为23.4±1.0kg/头/天和22.8±0.9kg/头/天，实验组高于对照组2.63％。母猪哺乳期间采食量统计结果如图9所示，实验组和对照组母猪哺乳期间平均采食量分别为7.3±0.2kg/头/天和6.9±0.3kg/头/天，实验组高于对照组5.80％。可见，母猪饮水添加复合益生菌制剂，可提高哺乳母猪饮水量和采食量，促进奶水分泌，并有助于产后母猪减少掉膘加快恢复体况。

母猪妊娠中后期及产后便秘情况统计结果如图10所示，产前4周实验组和对照组母猪便秘率分别为32.8和33.2％，组间差异较小；产前3周实验组和对照组母猪便秘率分别为19.8％和32.7％，组间差异显著(P＜0.05)；产前2周实验组和对照组母猪便秘率分别为12.0％和36.6％，组间差异显著(P＜0.01)；产前1周实验组和对照组母猪便秘率分别为11.8％和42.8％，组间差异显著(P＜0.001)；产前1天实验组和对照组母猪便秘率分别为7.2％和54.0％，组间差异显著(P＜0.001)；产后1周实验组和对照组母猪便秘率分别为9.7％和47.2％，组间差异显著(P＜0.001)；产后2周实验组和对照组母猪便秘率分别为5.4％和18.1％，组间差异显著(P＜0.01)；产后3周实验组和对照组母猪便秘率分别为4.2％和14.6％，组间差异显著(P＜0.01)。此外，每吨水添加25克和30克的辅助实验组只统计了产前4周、产前1天的数据，其中，添加25克产前4周实验组和对照组便秘率分别为32.8％和33.2％，产前1天便秘率分别为7.6％和52.0％，组间差异显著(P＜0.001)；添加30克产前4周实验组和对照组便秘率分别为32.8％和33.2％，产前1天便秘率分别为7.1％和54.0％，组间差异显著(P＜0.001)。均与每吨水添加20克的实验效果无明显差异。可见，母猪饮水添加复合益生菌制剂，能够显著降低妊娠中后期和哺乳期母猪便秘发病率。

平均健仔率统计结果如图11所示，实验组和对照组平均健仔率分别为91.2％和87.6％，组间差异显著(P＜0.05)。可见，母猪饮水添加复合益生菌制剂，可综合提升母猪及其仔猪的健康水平。

仔猪腹泻情况统计结果如图12所示，3日龄实验组和对照组仔猪腹泻率分别为25.7％和38.5％，组间差异显著(P＜0.01)；断奶前实验组和对照组仔猪腹泻率分别为12.9％和17.7％，组间差异显著(P＜0.05)。其中，添加25克3日龄实验组和对照组仔猪腹泻率分别为24.5％和32.0％，组间差异显著(P＜0.01)；断奶前实验组和对照组仔猪腹泻率分别为12.2％和16.3％，组间差异显著(P＜0.05)。添加30克3日龄实验组和对照组仔猪腹泻率分别为25.8％和35.8％，组间差异显著(P＜0.01)；断奶前实验组和对照组仔猪腹泻率分别为13.0％和18.5％，组间差异显著(P＜0.05)。均与每吨水添加20克的实验效果无明显差异。可见，母猪饮水添加复合益生菌制剂，可帮助新生仔猪尽快建立成熟的肠道菌群，增强新生仔猪免疫力，进而降低仔猪初生及其断奶前腹泻率。

平均死淘率统计结果如图13所示，实验组和对照组哺乳期间平均健仔率分别为91.2％和87.6％，组间差异显著(P＜0.05)。可见，母猪饮水添加复合益生菌制剂，可提升初生仔猪体质和应激抗性，进而降低仔猪哺乳期间死淘率。添加25克和30克组未统计平均死淘率。

平均日增重统计结果如图14所示，实验组母猪对应的仔猪哺乳期间平均日增重为0.248±0.035kg/头/天，对照组仔猪0.215±0.048kg/头/天，实验组高于对照组0.033kg/头/天，组间差异显著(P＜0.01)，表明母猪饮水添加益生菌可增进母猪消化道健康，促进哺乳期泌乳，进而促进仔猪生长，提高断奶仔猪平均日增重。添加25克和30克组未统计平均日增重。

由此可见，饮水添加复合益生菌剂养殖妊娠及哺乳母猪，能够提高母猪生产性能及整体健康养殖水平，主要表现为：改善妊娠和哺乳母猪肠道菌群，降低便秘发病率，提高哺乳母猪采食量和饮水量，减少掉膘加快体况恢复并促进泌乳，提高乳仔猪健仔率，降低哺乳期间仔猪腹泻发病率，缩短腹泻治疗天数，降低仔猪死淘率，提高平均日增重。同时，可降低产房氨和硫化氢浓度，优化产房环境。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims

1.一种用于降低母猪便秘发病率的复合益生菌制剂，所述复合益生菌制剂由乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉、乳双歧杆菌Probio-M8菌粉和稀释载体组成，其中，所述乳酸片球菌PA-19的微生物保藏编号为CGMCC No.19881；所述植物乳杆菌P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312；动物双歧杆菌乳亚种V9的微生物保藏编号为CGMCC No.5470；乳双歧杆菌Probio-M8的微生物保藏编号为CGMCC No. 18610，基于所述复合益生菌制剂中稀释载体的重量，每种益生菌的活菌数量均≥2×10¹¹CFU/g；

其中，乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉、乳双歧杆菌Probio-M8菌粉的重量比为（1~3）:（1~3）:（1~3）:（1~3）。

2.一种制备权利要求1所述复合益生菌制剂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1包括以下步骤：

步骤1-1，分别将4株发酵菌种单独进行高密度发酵，并进行离心，分别获得乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂、乳双歧杆菌Probio-M8菌剂；

步骤1-2，向发酵离心后的乳酸片球菌PA-19菌剂、植物乳杆菌P-8菌剂、动物双歧杆菌乳亚种V9菌剂、乳双歧杆菌Probio-M8菌剂的菌体中分别按照各自菌体与保护剂溶液重量比1：（5-10）的比例添加保护剂，混匀分别获得各菌对应的菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥，分别得到乳酸片球菌PA-19菌粉、植物乳杆菌P-8菌粉、动物双歧杆菌乳亚种V9菌粉、乳双歧杆菌Probio-M8菌粉。

4.权利要求1所述复合益生菌制剂用于制备母猪饲料添加剂的用途。

5.权利要求1所述复合益生菌制剂用于制备降低母猪便秘发病率制品的用途。