KR20230125552A

KR20230125552A - 인공위장환경에서 생존율이 높은 케피어 유래 프로바이오틱 효모 Kluyveromyces marxianus A4 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20230125552A
Application number: KR1020220022266A
Authority: KR
Inventors: 서건호; 김동현; 윤혜영; 김현진
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2022-02-21
Filing date: 2022-02-21
Publication date: 2023-08-29

Abstract

본 발명은 인공위장환경에서 생존율이 높은 케피어 유래 프로바이오틱 효모 Kluyveromyces marxianus A4 및 그의 용도에 관한 것으로서, 케피어 유래 잠재적 프로바이오틱 효모주 kluyveromyces marxianus A4는 인 공 위장관에서 높은 생존률, 바이오필름 형성, 자기응집능 및 페놀의 대한 내성이 높았으며, 단기 투여만으로도 장내 미생물을 변화를 시킴을 확인 하였다. 또한, 크론병 및 궤양성 대장 염의 유용한 모델인 시트로박터 로테리움(Citrobacter rodentium)의 대한 향균 효과도 확인하였는 바, 프로바이오틱스와 관련된 사업에 유용하게 사용 가능 하다.

Description

인공위장환경에서 생존율이 높은 케피어 유래 프로바이오틱 효모 Kluyveromyces marxianus A4 및 그의 용도{Kefir-derived probiotic yeast Kluyveromyces marxianus A4 with high survival rate in artificial gastrointestinal environment and uses thereof}

본 발명은 인공위장환경에서 생존율이 높은 케피어 유래 프로바이오틱 효모 Kluyveromyces marxianus A4 및 그의 용도에 관한 것이다.

WHO/FAO에 따르면 프로바이오틱스란 적절한 양을 섭취하였을 때 숙주에 건강상의 이로움을 가져오는 살아있는 미생물이다. 주로 락토바실루스 균(Lactobacillus spp.,) 비피더스균(Bifidobacterium spp.,) 락토코쿠스(Lactococcus spp.,) 와 같은 유산균을 중심으로 유일한 프로바이오틱스 효모인 사카로미세스 보울라디(Saccharomyces boulardii)까지 다양한 프로바이오틱스 미생물들의 효능이 널리 연구되어 왔다. 이렇게 프로바이오틱스로 사용할 수 있는 미생물들은 숙주 신체 내에서 생존성과 이로운 기능성 있다.

인간은 많은 미생물과 공생 관계를 이루며 살아가고 있다. 그 중에서도 가장 많은 미생물이 사는 인간의 장 내 환경은 숙주의 대사 및 면역 체계와 깊은 연관을 지닌다. 식습관이 숙주의 장내 미생물 군집에 영향을 미친다는 많은 연구들이 보고되고 있으며, 장내 미생물균총과 인간의 건강과의 밀접한 관계에 대한 관심도가 높아지고 있다.

따라서, 본 발명에서는 숙주의 위장관 내에서 생존이 가능하며, 장내 미생물균총 변화의 기능성을 가지는 잠재적 프로바이오틱스 인자를 발굴하였다.

이에 본 발명자들은 프로바이오틱스 인자는 한국산 케피어에서 분리한 신규한 효모주는 클루이베로마이세스 막시아누스 A4(kluyveromyces marxianus A4)이며, kluyveromyces marxianus A4는 숙주내에서의 생존성과 장내 미생물 균총의 변화 및 항균효과를 확인 하여, 이에 본 발명을 완성 하였다.

본 발명의 목적은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 장 기능 개선 또는 장내 균총 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주을 제공한다.

본 발은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제를 제공한다.

본 발명은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 장 기능 개선 또는 장내 균총 개선용 조성물을 제공한다.

케피어 유래 잠재적 프로바이오틱 효모주 kluyveromyces marxianus A4는 인 공 위장관에서 높은 생존률, 바이오필름 형성, 자기응집능 및 페놀의 대한 내성이 높았으며, 단기 투여만으로도 장내 미생물을 변화를 시킴을 확인 하였다. 또한, 크론병 및 궤양성 대장 염의 유용한 모델인 시트로박터 로테리움(Citrobacter rodentium)의 대한 향균 효과도 확인하였는 바, 프로바이오틱스와 관련된 사업에 유용하게 사용 가능 하다.

도 1은 인공적인 위장관 환경에서 Kluyveromyces marxianus A4(Km A4)와 Saccharomyces boulardii(Sb) MYA-796의 생존성 및 성장률을 나타낸 도이다.
도 2a는 Kluyveromyces marxianus A4(Km A4)와 Saccharomyces boulardii(Sb) MYA-796의 바이오필름 형성능을 나타낸 도이다.
도 2b는 Kluyveromyces marxianus A4(Km A4)와 Saccharomyces boulardii(Sb) MYA-796의 자가응집능을 나타낸 도이다.
도 3은 Kluyveromyces marxianus A4(Km A4)와 Saccharomyces boulardii(Sb) MYA-796의 페놀 내성을 나타낸 도이다.
도 4는 Kluyveromyces marxianus A4(Km A4)와 Saccharomyces boulardii(Sb) MYA-796의 Citrobacter rodentium에 대한 항균 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 Kluyveromyces marxianus A4(Km A4)와 Saccharomyces boulardii(Sb) MYA-796의 taxonomy abundance ratio을 나타낸 도이다.

본 발명은 기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주를 제공한다.

상기 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주는 위 장관 내 생존성이 높은 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주는 단기간 미생물 총 균의 변화를 일으키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

상기 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주는 Lactose assimilation (LACa), Xylitol assimilation (XLTa), D-sorbitol assimilation (dSORa), DL-lactate assimilation (LATa), Amygdaline assimilation (AMYa), L-arabinose assimilation (IARAa), D-xylose assimilation (dXYLa) 및 Urease (URE)의 효소 생화학적 활성도가 높은 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주는 페놀에 대한 내성이 높은 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주는 단기간의 미생물 총균의 변화를 일으키는 것이고, 미생물은 장내의 acteroidetes 문, Bacteroidales 목, Bacteroides 속의 미생물이 증가시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 용어, "항균" 또는 "항균 활성"은 세균이나 곰팡이와 같은 미생물에 대해 저항하는 성질을 의미하며, 보다 상세하게는 세균의 성장 또는 증식을 억제하거나 세균 자체를 사멸시키는 특성을 의미한다. 본 발명에서, 상기 항균 또는 항균 활성은 Citrobacter rodentium균주의 성장 또는 증식을 억제하거나 사멸시키는 특성으로서 사용될 수 있다.

상기 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제를 제공한다.

상기 용어, "생균제"는 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 미생물로서, 특정 병리 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있는 미생물 제제를 말한다. 일반적으로 생균제는 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반 증상을 치료하고 개선하는 효과가 있으며, 체내에 투여되면 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해 미생물이 정착하지 못하게 하는 작용을 하고, 유산을 생성하여 장내 pH를 낮추어서 유해 미생물의 증식을 억제한다. 또한, 투여된 생균제는 영양분의 흡수를 담당하는 장융모의 활동을 도와주는 역할을 수행한다.

상기 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 장 관련 질환은 Citrobacter rodentium균에 의하여 유발되는 것일 수 있고, 본 발명의 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주 또는 이의 배양액은 Citrobacter rodentium균에 대한 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.

상기 장 관련 질환은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 및 회장 낭염으로 이루어진 군으로 부터 1종 이상인 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 싸이코트리아 루브라 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

시트로박터 로텐티움(Citrobacter rodentium)은 두 가지 임상적으로 중요한 인간 위장 병원균인 장병원성 대장균(EPEC) 및 장출혈성 대장균(EHEC)과 여러 병원성 기전을 공유하는 마우스의 점막 병원체이다. 따라서, C. rodentium은 생체 내에서 장병원성 대장균(EPEC) 및 장출혈성 대장균(EHEC) 감염의 분자 기반을 이해하기 위한 모델로 오랫동안 사용되어 왔다(Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota_James W. Collins, Kristie M. Keeney, Valerie F. Crepin, Vijay A. K. Rathinam, Katherine A. Fitzgerald, B. Brett Finlay & Gad Frankel_Nature Reviews Microbiology volume 12, pages612-623 (2014))

상기 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

상기 사료첨가제는 항균 활성을 가지고 있어, 가금류 또는 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 세균성 질환을 예방할 수 있고, 이미 발생한 세균성 질환을 개선시킬 수 있다. 사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분 함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며, 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료 또는 섬유질사료가 사용가능하다.

상기 사료 첨가제는 추가적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있으며, 예를 들어, 상기 사료 첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있다. 또한, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

상기 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 장기능 또는 장내 균총 개선용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 장내 총균인 Bacteroidetes 문, Bacteroidales 목, Bacteroides 속에 의하여 장기능을 개선시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 효모주에서 클루이베로미세스 막시아누스 A4( Kluyveromyces marxianus A4, Km A4) 분리 및 동정

본 발명자들은 케피어(Kefir)에서 분리된 균주를 동정하였고, 대장내에 Citrobacter rodentium균의 항균 활성을 가지는 균주로서 클루이베로미세스 막시아누스 A4 균주를 확인하고 이를 한국미생물보전센터에 2021년 12월 21일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 13096P를 부여받았다.

한국산 케피어로부터 효모를 분리하였다. 2주 이상 발효시킨 케피어를 멸균 생리식염수를 이용하여 희석한 뒤, 효모용 선택배지(Potato Dextrose Agar)에 희석액을 도말하여 효모 콜로니들을 회수한 뒤 ITS(Internal transcribed spacer) sequencing을 통하여 해당 미생물을 동정하였다. 케피어 분리 Kluyveromyces marxianus A4 효모주와 비교하기 위해 프로바이오틱스 효모로 사용되는 Saccharomyces boulardii ATCC MYA-796(Sb MYA-796)을 ATCC에서 구매하여 효모용 선택배지에 키우고 대조군으로 사용하였다.

시카로미세스 보울라디(Saccharomyces boulardii)는 프로바이오틱스중의 하나로서, 호모균을 의미하며, 효능은 유산균과 매우 비슷하나, 균주가 아니라 호모라는 특징이 있다.

실시예 2. 클루이베로미세스 막시아누스 A4( Kluyveromyces marxianus A4, Km A4)의 위장관 내 생존성 확인.

실시예 1에서 분리된 효모주(Kluyveromyces marxianus A4; Km A4)의 실험전 활력을 회복하기 위해 Potato Dextrose Agar에서 30℃, 24시간 동안 호기 조건 하에서 2번 계대 배양하여 활력을 회복 하였다.

인공적인 위장관 환경에서의 생존성 확인 시험은 논문[Cudennec, B.,외, 2015, Food Res. Int., 78, 238-245; Ceugniez, A.,외, Tomme d'Orchies. Res, icrobiol. 168, 575-582.]을 참고하여 위장관 환경을 설정하고 위 환경은 pH 2.0과 3.0으로, 장 환경은 pH 7.5와 8.5로 맞추었고 인공적인 위장관 환경을 위한 조성물질은 표 1과 같다. 인공적인 위, 장 환경의 용액을 만들어 놓고, 위 환경에 효모주를 접종하여 숙주의 소화 시간을 고려해 위 환경의 용액에서 2시간 배양한 이후 배양액을 장 환경 용액과 1:1로 섞어 24시간 배양하였다. 이후 24시간 동안 배양시킨 효모 수(최종 효모 생균 수)를 확인하여 생균 수를 계수하였고, 0시간 째 효모 수(초기 생균 수)와 비교하여 생존성 또는 성장률을 표현(Fold change)하기 위해 최종 효모 생균 수를 초기 생균 수로 나누었고 1.0 이하와 그 이상의 값은 각각 생존성과 성장률을 나타낸다.

케피어 효모주 (Kluyveromyces marxianus A4; Km A4)와 프로바이오틱스 효모주 시카로미세스 보울라디(Saccharomyces boulardii, Sb) MYA-796는 도 1과 같은 인공 위장관에서의 생존성을 나타냈다. 유일한 프로바이오틱스 Sb MYA-796과 케피어 효모주 (Kluyveromyces marxianus A4; Km A4)의 인공 위장관에서 생존성을 비교해본 결과 모든 환경에서 Km A4의 생존성이 통계적으로 높게 나타내어 본 발명의 Kluyveromyces marxianus A4는 위장관 내에서 생존률이 높은 것을 확인 하였다(도 1, p < 0.05).

실시예 3. 클루이베로미세스 막시아누스 A4( Kluyveromyces marxianus A4, Km A4) 효모주 생존성에 영향을 미치는 인자들 확인

실시예 3-1. 클루이베로미세스 막시아누스 A4( Kluyveromyces marxianus A4, Km A4)의 생화학적 분석

케피어 효모주 (Kluyveromyces marxianus A4; Km A4)와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796은 VITEK 2 system을 통해 효모주의 46가지 생화학적 분석을 확인하였다. 배양한 효모주를 0.45% saline에 희석하고 McFarland 2.0의 탁도를 맞추었고, 이후, YST(Yeast) 카드를 이용하여 VITEK 2 system에 끼우고 이 시스템 안에서 카드는 35.5℃에서 18시간 동안 배양되어 결과를 확인하였다.

그 결과, 케피어 효모주 (Kluyveromyces marxianus A4; Km A4)와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796의 46가지 생화학적 분석 시 전체 효소 중 양성 반응을 보인 효소의 수는 Km A4(16/46, 34.78%), Sb MYA-796(11/46, 23.91%)로 나타났다. 그중에서 VITEK 2 system을 이용하여 분석한 Km A4와 Sb MYA-796의 생화학적 활성도(biochemical activity) 차이를 보인 결과는 표 2와 같다.

Bifidobacterium spp. 등이 사용할 수 있는 우레아제(urease)는 위 안의 낮은 pH를 중화시킬 수 있는 능력이 있으므로 숙주의 위장관 내에서 생존성을 높은 것을 수 있음을 나타내므로, 표 2와 같이 Km A4가 Sb MYA-796에 비해 사용할 수 있는 효소의 수가 많고, 우레아제(urease) 등의 효소를 이용할 수 있어서 pH가 낮은 환경에서 Sb MYA-796 보다 생존력 및 성장력 높을 것을 확인 하였다.

실시예 3-2. 클루이베로미세스 막시아누스 A4( Kluyveromyces marxianus A4, Km A4)의 소수성 분석

소수성 특성이 높은 미생물은 장 내에 정착하여 생존할 확률이 높아지므로 프로바이오틱스 인자를 스크리닝할 때 확인이 필요한 요인으로서, 케피어 효모주 Kluyveromyces marxianus A4(Km A4)와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796의 소수성 분석을 위해 MATS(Microbial adhesion to solvent) 실험을 시행하였다. 소수성 용매는 클로로폼(chloroform), 헥사데칸(hexadecane), 데케인(decane)이 사용되었고 효모주는 24시간 동안 37℃에서 배양되었으며 원심분리하여 효모 펠렛을 얻었다. 펠렛은 PBS를 활용하여 세척한 후 같은 용액을 활용하여 대략 10⁵CFU/mL에 맞추어 마이크로플레이트를 활용하여 405nm에서 처음 용액을 측정(A0)하였고, 280ul의 효모주는 각각 40ul의 소수성 용매와 혼합하여 15분간 정치시켰고, 15분 뒤 해당 용액은 두 층으로 나뉘었다. 나뉜 층 중에서 수용성 층은 405nm에서 재측정(A1)되었으며 세포 표면 소수성의 비율은 아래 식을 이용하여 계산되었다.

소수성(%) = (1-A1/A0) x 100%

케피어 효모주 Km A4와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796의 소수성 특성을 분석한 결과는 표 3과 같다.

효모주의 소수성 용매에 대한 친화력 분석 결과 표 3과 같이 Km A4가 Sb MYA-796에 비해 소수성 용매에 반응률이 더 높았고 소수성 특성이 높은 효모주라는 것을 확인 하였다(p < 0.05).

실시예 3-3. 클루이베로미세스 막시아누스 A4( Kluyveromyces marxianus A4, Km A4) 바이오필름 형성 분석

케피어 효모주 Km A4와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796의 바이오필름 형성 능력 분석을 위해 각 효모주는 200ul의 효모 액체배지에 배양하여 McFarland 3.0의 탁도를 맞추었다. 탁도를 맞춘 용액은 96-well plate에 200ul씩 분주하였고 37℃에서 24시간 배양하였다. 24시간 이후, 효모 배양액에서 배지는 버리고 microplate는 PBS를 활용하여 세척하였다. 이후 biofilm을 형성한 cell을 염색시키기 위해 0.1% crystal violet을 넣어 15분간 상온 배양하였다. 이후 다시 PBS로 세척하고 99% ethanol로 염색약을 세척한 후 biofilm 형성능을 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 595nm에서 측정하였다.

그 결과 도 2a와 같이 케피어 효모주 Km A4와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796의 비해 바이오필름 형성능이 통계적으로 유의하게 높음을 확인 하였다(p < 0.05).

실시예 3-4. 클루이베로미세스 막시아누스 A4( Kluyveromyces marxianus A4, Km A4)의 자가응집능 분석

케피어 효모주 Km A4와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796의 자가응집능을 분석하기 위해 각 효모주는 배양 후 펠렛을 만들어 10⁵ CFU/mL로 맞추었고, 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 0시간째 광확 밀도(optical density) 값을 측정(A0)한 후 37℃에서 5시간 배양하였다. 5시간 배양 후 동일한 파장에서 광확 밀도(optical density) 값을 측정(At)하였으며 자가응집능은 아래 식을 이용하여 계산되었다.

자가응집능(%) = (1-At/A0) x 100%

그 결과 도 2b와 같이, 케피어 효모주 Km A4와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796의 비해 자가응집능이 통계적으로 유의하게 높음을 확인 하였다(p < 0.05).

실시예 4. 클루이베로미세스 막시아누스 A4( Kluyveromyces marxianus A4, Km A4)의 페놀(phenol)에 대한 내성 확인

페놀은 세균이 분해되면서 형성되는 물질로 장 내에서 세균의 성장을 억제하고 대사 활동에 영향을 미치므로 장 내에서 페놀을 견디는 능력은 미생물의 생존의 중요한 요인으로서, 케피어 효모주 Km A4와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796의 페놀에 대한 내성을 확인하기 위해, 하루 전 배양한 효모주는 0.2%와 0.5% phenol에 배양한 후 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)의 620nm 파장에서 광학밀도(optical density) 값을 측정하여 내성률을 확인하였다.

그 결과 도 3과 같이 페놀 내성 실험 시, Km A4는 Sb MYA-796보다 유의적으로 높은 내성률을 확인 하였다(도 3) (p < 0.05).

실시예 5. 클루이베로미세스 막시아누스 A4( Kluyveromyces marxianus A4, Km A4)의 시트로박터 로텐티움( Citrobacter rodentium) 에 대한 항균 효과 확인

Citrobacter rodentium은 설치류에 감염되는 병원균으로 사람의 장 내 대장균 감염(EPEC, EHEC 등), 크론병 및 궤양성 대장염을 포함한 인체의 장 질환을 조사하는 데 유용한 모델로서, 케피어 효모주 Km A4와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796의 Citrobacter rodentium(C. rodentium ATCC 51459를 ATCC에서 구매)에 대한 항균 효과를 확인하기 위해, Citrobacter rodentium의 초기 균수는 10⁶ CFU/mL, Km A4와 Sb MYA-796은 10⁵ CFU/mL로 맞추어 사용하였다. 그룹은 C. rodentium만 배양한 그룹(Cit), C. rodentium에 Km A4를 1:1로 함께 배양한 그룹(Cit+Km A4), Citrobacter rodentium에 Sb MYA-796을 1:1로 함께 배양한 그룹(Cit+Sb MYA-796)을 사용하였다. 각 그룹에 맞게 24시간 동안 배양시킨 후 Citrobacter rodentium의 생균 수(최종 생균 수)를 확인하여 계수하였고, 초기 접종한 Citrobacter rodentium 생균 수와 비교하여 생존성을 표현(Fold change)하기 위해 최종 생균 수를 초기 생균 수로 나누었고 1.0 이하의 값은 생존성을 나타낸다.

케피어 효모주 Km A4와 Sb MYA-796의 Citrobacter rodentium에 대한 항균 효과는 도 4와 같다. 초기 균수를 1로 잡았을 때 Citrobacter rodentium만 24시간 배양시킨 후 균의 양은 14.68배 증가했고, 같은 양의 Citrobacter rodentium에 Km A4를 함께 배양했을 때 균의 수는 0.49로, 초기 균수 대비 50% 정도의 균수가 생존함을 확인할 수 있었다. 마찬가지로 Citrobacter rodentium에 Sb MYA-796을 함께 배양했을 때 24시간 후 Citrobacter rodentium의 균수는 0.82로 초기 균수 대비 80% 정도의 균수가 생존함을 확인함으소써, 케피어 효모주 Km A4의 항균 효과를 확인 하였다(도 4).

실시예 6. 클루이베로미세스 막시아누스 A4( Kluyveromyces marxianus A4, Km A4)의 동물실험을 통한 장내 미생물균총 변화 확인

본 발명의 케피어 효모주 Km A4의 장내 미생균총 변화를 확인하기 위해, 케피어 효모주 Km A4와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796는 4주령 암컷 BABL/c 마우스에 2주간 경구투여했다. 실험에 들어가기 전 동물은 1주일간 순화시켰으며 온도는 20-25℃, 조명은 12시간 주기로 조절해주었다. 급이기 및 급수병은 식이량과 식수량을 측정하여 매주 세척, 교환해주었고 마우스의 스트레스 저감화를 위해 케이지에 페이퍼 타올을 넣어주었다. 대조군 및 Km A4, Sb MYA-796을 실험군으로 하여 실험이 진행되었으며 실험군별로 네 마리의 마우스가 사용되었다.

투여물질은 대조군에는 멸균된 생리식염수를, 케피어 효모주 Km A4와 프로바이오틱스 효모주 Sb MYA-796에는 효모주를 1.0 x 10⁶ CFU/mL 또는 1.0 x 10⁸ CFU/mL의 농도로 나누어 매일 16시에 1회 경구투여하였다. 2주간 경구투여 후 장내 미생물균총 변화를 보기 위해서 실험 종료일에 분변을 받아 DNA를 추출하여 NGS 분석을 시행하였다. 동물실험은 건국대학교 동물실험윤리위원회의 승인에 따라 이루어졌다(KU20075).

케피어 효모주 Km A4와 Sb MYA-796를 2주간 마우스에 경구투여하였을 때, 체중의 감소 및 피모의 관능적 악화, 행동학적 이상, 섭식량 및 음수량의 변화 등은 나타나지 않는 것을 확인 하였다. 이를 바탕으로, 동물실험에 사용한 효모주가 동물의 건강에 급성 독성 효과를 지니지 않은 것으로 판단하였다.

도 5는 마우스에 2주간 Km A4와 Sb MYA-796를 고농도와 저농도로 나누어 경구투여한 뒤 분변을 받아 문(phylum), 속(genus), 종(species) 수준에서 장내 미생물 균총을 확인한 결과이다. Km A4는 고농도로 투여했을 때에만 장내 미생물 균총의 변화가 일어났으며, Sb MYA-796은 고농도와 저농도 투여 그룹 전부에서 유의적인 장내 미생물균총의 변화가 일어나지 않았다. Km A4의 문(Phylum), 목(order), 속(genus) 단계에서 Bacteroidetes, Bacteroidales, Bacteroides의 증가됨을 확인하였다. Km A4가 숙주 장 내에 들어갔을 때 Km A4에 의해 제공되는 효소, RNA, free nucleotide, 비타민 B 복합체 또는 아미노산 등의 공급으로 인한 결과라고 파악된다. Bacteroidales는 소화기관 내에서 장내 유익균을 위한 단쇄지방산과 같은 영양분이 될 수 있고, Bacteroidales가 생산한 단쇄지방산은 질병의 완화에 중요한 역할을 하며, 장 상피세포가 사이토카인을 만들도록 자극시켜 인터루킨 10을 발현하도록 하였다.

결과적으로, 해당 효모주(Km A4)는 숙주의 신체에서 높은 생존성/성장률과 단기 투여만으로 장내 미생물균총의 변화가 있었으므로 새로운 프로바이오틱스 효모 인자로서 본 발명의 케피어 효모주 Km A4가 사용할 수 있을 것으로 확인 하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM13096P

20211221

Claims

기탁번호 KCCM 13096P로 수탁된 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) A4 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 케피어(Kefir)에서 분리된 것인, 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 항균 활성을 가지는 것인, 균주.
제 3항에 있어서,
상기 항균은 대장내에 Citrobacter rodentium균의 항균 효과인 것인, 균주
제 1항에 있어서,
상기 균주는 Lactose assimilation (LACa), Xylitol assimilation (XLTa), D-sorbitol assimilation (dSORa), DL-lactate assimilation (LATa), Amygdaline assimilation (AMYa), L-arabinose assimilation (IARAa), D-xylose assimilation (dXYLa) 및 Urease (URE)의 효소 생화학적 활성도가 높은 것인, 균주.
제 1항에 있어서,
상기 균주는 페놀에 대한 내성이 높은 것인, 균주.
제 1항에 있어서,
상기 균주는 위장관 내 생존성이 높은 것인, 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 단기간 미생물 총균의 변화를 일으키는 것인, 균주.
상기 8항에 있어서,
상기 미생물은 장내의 Bacteroidetes 문, Bacteroidales 목, Bacteroides 속의 미생물이 증가시키는 것인, 균주.
제 1 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
제 1 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 생균제.
제 1 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 12항에 있어서,
상기 장 관련 질환은 Citrobacter rodentium균의 의한 것인, 장 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 13항에 있어서,
상기 장 관련 질환은 크론병, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 및 회장 낭염 및 베체트병에 수반되는 장 병변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 장 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물.
제 1 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 장 기능 또는 장내 균총 개선용 조성물.
제 16항에 있어서,
상기 조성물은 장내 총균인 Bacteroidetes 문, Bacteroidales 목, Bacteroides 속에 의하여 장기능을 개선시키는 것인, 조성물.