CN103355656B - 一种益生菌微胶囊产品及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种益生菌微胶囊产品，微胶囊产品为粒径10-1000微米的球形或不规则形微胶囊，其结构分为壁层与内核两部分，其中，壁层由海藻酸盐、壳聚糖、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯高分子材料组成，内核为高密度的益生菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种益生菌微胶囊产品，具体地说是一种能保持细胞高活性的益生菌微胶囊产品。
背景技术
联合国粮农组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)联合专家组2001年给出益生菌的定义为“经适量服用后，就会赋予宿主益生效应的活的微生物”。由于益生菌株为肠道来源，多为厌氧菌或兼性厌氧菌，对氧、pH、温度、消化道酶等胁迫环境非常敏感，在发酵、下游干燥、货架期、胃肠道运输过程中活性极易丧失，导致益生菌活率(益生菌产品的关键参数)显著降低。微囊包封技术，由于保护细胞免受干燥、高温、pH、氧气等不利环境伤害，越来越多的应用到益生菌产品工业中。益生菌微囊的主要材料多为食品级天然聚合物，如：海藻酸盐、壳聚糖、羧甲基纤维素、角叉胶、结冷胶等，其共同特点是易于形成水凝胶来包埋益生菌。但上述材料制备的益生菌微囊对胃酸的阻隔作用都非常有限。
发明内容
针对上述问题，本发明提出将具有抗胃酸性能的甲基丙烯酸与甲基丙烯酸酯共聚物应用到益生菌微囊材料中，用于保持益生菌过胃后的活性。
微胶囊产品为粒径10-1000微米的球形或不规则形微胶囊，微胶囊结构分为壁层与内核两部分：其中，壁层由壳聚糖、海藻酸盐、甲基丙烯酸与甲基丙烯酸酯共聚物组成，内核为含有海藻酸盐及高密度益生菌的混合物。壁层与内核的体积比为1∶100-10∶1
其中，组成产品壁层的壳聚糖、海藻酸盐、甲基丙烯酸与甲基丙烯酸酯共聚物三者的质量比为0∶1∶0.1-10∶1∶10，其中，海藻酸盐材料的分子量10kDa～5000kDa；壳聚糖材料的分子量为1kDa～1000kDa，脱乙酰度50-98％；；甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物的分子量为10kDa～5000kDa。
组成产品内核的海藻酸盐材料的分子量10kDa～5000kDa，内核中益生菌占据内核的体积百分比为10-98％。
产品中益生菌含量在109-1015CFU/g，益生菌种类包括具有益生作用的乳杆菌属类(如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、拟干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、拉曼乳杆菌、弯曲乳杆菌、詹士乳杆菌、保加利亚乳杆菌等)，双歧杆菌属类(如长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、婴儿双歧杆菌，动物双歧杆菌乳酸亚种等)，乳球菌，粪链球菌，中介链球菌，嗜热链球菌，粪肠球菌，尿肠球菌和酵母菌类中的一种或二种以上，每种菌的含量在106-1015CFU/g。
产品的壁层和内核成分中的海藻酸盐为海藻酸的钾盐、钠盐、钙盐、钡盐或锌盐中的一种或二种以上。
产品可通过添加其他辅料继续加工成自由片剂、大胶囊等。也可放入牛奶、酸奶、果冻、酸乳、奶粉等食品中做成含益生菌的功能食品；或添加到畜牧业饲料中，做成功能饲料。
本发明提供的益生菌微胶囊产品的制备步骤为：
(1)制备包埋有益生菌的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；
其中，益生菌的含量为5×106-1013/ml微球；海藻酸盐为海藻酸的钙盐、钡盐、锌盐、中的一种或二种以上；或海藻酸的钙盐、钡盐、锌盐、中的一种或二种以上与钾盐、钠盐的一种或二种的混合盐。
(2)将步骤(1)中的A微球浸入壳聚糖溶液中，A微球与壳聚糖溶液体积比为1∶1～1∶40，反应1-60分钟，此时得到海藻酸钠-壳聚糖微胶囊，称之为B微球，取出用生理盐水洗涤；
壳聚糖溶液的配制方法是：壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为0.01-1.5％(w/v)，脱乙酰度为50-98％；
(3)将步骤(2)中的B微球浸入金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，F微球与金属螯合剂溶液体积比范围为1∶1～1∶40，反应1-60分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的C微球；其中，金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠或50-200mmol/L的EDTA，此时C微球中的海藻酸盐为海藻酸的钠盐或钾盐中的一种或二种。
(4)将步骤(1)得到的A微球或步骤(2)得到的B微球或步骤(3)得到的C微球放入益生菌培养液中培养，使益生菌在微囊内增殖到109-1013/ml微球的细胞密度后，得到D微球；
(5)将A微球、B微球、C微球或培养增殖后的D微球经干燥处理后获得E微球；
(6)在A微球、B微球、C微球、D微球或E微球表面被覆喷涂甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物，即得到益生菌微囊产品；
甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物中，甲基丙烯酸与甲基丙烯酸酯的摩尔比为1∶10-10∶1，共聚物浓度在2-80％(质量百分比)。
上述步骤(1)用于制备A微球的方法包括同向/轴流动制备技术，静电雾化制备技术，振动效应制备技术，离心力场制备技术，微通道阵列制备技术，乳化-外部凝胶化技术，乳化-内部凝胶化技术及膜乳化技术等。
上述步骤(5)的干燥方法包括冷冻干燥、真空干燥等，且在干燥过程中添加海藻糖、水苏糖、半乳糖、甘油、蔗糖、脱脂乳、谷氨酸钠等保护剂中的一种或二种以上。
上述步骤(6)的表面被覆喷涂方法包括喷涂法，流化包衣法，滚转包衣法等。
本发明的有益效果：
1、本发明的益生菌微胶囊产品，能实现益生菌的高包埋率和高活性。
2、本发明的益生菌微胶囊产品的制备过程条件温和，制备工艺过程有利于细胞的活性保持。
3、本发明的益生菌微囊产品对胃酸、干燥等胁迫环境具有显著的耐受性。
附图说明
图1AC微囊化鼠李糖乳杆菌(倒置显微镜照片，放大倍数100倍)。
图2干燥后的AC微囊化长双歧杆菌(体式显微镜照片，放大倍数24倍)。
图3乳化-外部凝胶化工艺制备的微囊化酵母菌(倒置显微镜照片，放大倍数100倍)。
具体实施方式
以下实施例中，用到的工艺都是该领域中的技术人员较熟悉的工艺方法，这些技术在文献中有详细的说明。如：制备A微球的方法包括同向/轴流动制备技术(A.M.Ganan-Calvo.Generationofsteadyliquidmicrothreadsandmicron-sizedmonodispersespraysingasstreams.Physicalreviewletters，1998，80(2)：285-288)，静电雾化制备技术(B.Bugarski，Q.L.Li，M.F.A.Goosen，etal.Electrostaticdropletgeneration-mechanismofpolymerdropletformation.AicheJournal，1994，40(6)：1026-1031)，振动效应制备技术(H.H.Lee，O.J.Park，J.M.Park，etal.Continuousproductionofuniformcalciumalginatebeadsbysoundwaveinducedvibration.JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology，1996，67(3)：255-259)，离心力场制备技术(C.P.Champagne，N.Blahuta，F.Brion，C.Gagnon.AVortex-Bow1DiskAtomizerSystemfortheProductionofAlginateBeadsina1500-LiterFermentor.BiotechnologyandBioengineering，2000，68(6)：681-688)，微通道阵列制备技术(S.Sugiura，T.Oda，Y.Izumida，etal.Sizecontrolofcalciumalginatebeadscontaininglivingcellsusingmicro-nozzlearray.Biomaterials，2005，26(16)：3327-3331)，乳化-外部凝胶化技术(T.Takei，M.Yoshida，Y.Hatate，etal.Preparationoflacticacidbacteria-enclosingalginatebeadsinemulsionsystem：effectofpreparationparametersonbeadcharacteristics.PolymerBulletin，2009，63(4)：599-607)，乳化-内部凝胶化技术(一种乳化/内部凝胶化制备海藻酸钙凝胶珠的方法，刘群，马小军，刘袖洞，中国发明专利，ZL01109449.4)及膜乳化技术(一种制备海藻酸钙凝胶珠的膜乳化/内部凝胶化耦合技术，刘袖洞，马小军，刘群，中国发明专利ZL01104365.2，A.M.Chuah，T.Kuroiwa，I.Kobayashi，etal.Preparationofuniformlysizedalginatemicrospheresusingthenovelcombinedmethodsofmicrochannelemulsificationandexternalgelation.ColloidsandSurfacesa-PhysicochemicalandEngineeringAspects，2009，351(1-3)：9-17)等。
再如表面被覆喷涂方法包括喷涂法(离心喷涂法生产营养强化米的工艺研究，农产品加工(创新版)，2009年07期，73-74)，流化床包衣法(挤出滚圆-流化床包衣法制备决明子微丸的研究，中国现代应用药学，2011，，1：1010-1013)，滚转包衣法(滚转包衣技术在小丸制备工艺中的应用，黑龙江中医药，2010，4：48)。
实施例1
1)无菌条件下通过同向/轴流动技术制备包埋有鼠李糖乳杆菌的海藻酸钙凝胶微球，细胞接种密度1×107/ml海藻酸钙凝胶微球。
2)将微球浸入壳聚糖(壳聚糖分子量50kDa，脱乙酰度98％)溶液(浓度5g/L)中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后，制备成AC微囊化乳杆菌。
3)将AC微胶囊用55mM柠檬酸钠溶液液化10分钟，制备成内部为液体环境AC微囊化乳杆菌。
4)将AC微囊化乳杆菌放入MRS基础培养基中，37℃培养24小时到对数生长期末，微囊内细胞密度达到5×1011/ml微胶囊(图1)。
5)将步骤4)制备的微囊加入保护剂((按重量计)1％海藻糖，8％脱脂乳粉、2％甘油、1.5％谷氨酸钠(W/V，g/ml)，余量为水)，经冷冻干燥(-40℃，12小时)后得到益生菌微囊颗粒，平均粒径100微米。
6)将上述干燥微囊经流化床包衣甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯共聚物(购买商业化的S100，配制成质量百分比为20％的浓度，甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯摩尔比例1∶2)，包衣参数：鼓风流量127L/min，雾化气压力0.18mPa，包衣液流量0.9mL/min，流化温度37℃。制得最终的益生菌微囊产品，产品中鼠李糖乳杆菌含量1013/g微囊产品(图2)。甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物包衣增重3％。
7)将上述产品经体外模拟胃液(pH＝1的盐酸溶液)处理后，再经模拟肠液(pH7.4的磷酸氢钠、磷酸氢二钠缓冲液)处理后，微囊溶解释放出鼠李糖乳杆菌，经稀释平板法测定产品中活微生物，含量保持5×109/g微囊产品。
实施例2
1)无菌条件下，在厌氧工作站中，通过乳化-内部凝胶化技术制备包埋有长双歧杆菌的海藻酸钙凝胶微球，细胞接种密度1×107/ml海藻酸钙凝胶微球。
2)将微球浸入壳聚糖(壳聚糖分子量100kDa，脱乙酰度90％)溶液(浓度2g/L)中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后，制备成AC微囊化长双歧杆菌。
3)将AC微胶囊用55mM柠檬酸钠溶液液化10分钟，制备成内部为液体环境AC微囊化长双歧杆菌。
4)将AC微囊化长双歧杆菌放入培养基(配方(按重量计)：大豆蛋白胨1.67％，酪蛋白胨0.83％，乳糖1.0％，酵母浸出粉0.5％，低聚糖0.5％，肝浸液15％，余量为水)中，37℃培养24小时到对数生长期末，微囊内细胞密度达到5×1011/ml微胶囊。
5)将步骤4)制备的微囊加入保护剂(1％海藻糖，8％脱脂乳粉、2％甘油、1.5％谷氨酸钠(W/V，g/ml))，余量为水，经冷冻干燥(-40℃，12小时)后得到益生菌微囊颗粒，平均粒径100微米。
6)将上述干燥微囊经流化床包衣甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯共聚物(购买商业化的S100，配制成质量百分比为20％的浓度，甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯摩尔比例1∶2)，包衣参数：鼓风流量127L/min，雾化气压力0.18mPa，包衣液流量0.9mL/min，流化温度37℃。制得最终的益生菌微囊产品，产品中长双歧杆菌含量1013/g微囊产品(图2)。甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物包衣增重10％。
7)将上述产品经体外模拟胃液(pH＝1的盐酸溶液)处理后，再经模拟肠液(pH7.4的磷酸氢钠、磷酸氢二钠缓冲液)处理后，微囊溶解释放出长双歧杆菌，经稀释平板法测定产品中活微生物，含量保持5×108/g微囊产品。
实施例3
1)无菌条件下通过乳化-外部凝胶化技术制备包埋有益生酵母菌的海藻酸钙凝胶微球，细胞包埋密度2×109/ml海藻酸钙凝胶微球(图3)。
2)将微球浸入壳聚糖(壳聚糖分子量20kDa，脱乙酰度98％)溶液(浓度5g/L)中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤后，制备成AC微囊化酵母菌。
3)将上述微囊加入保护剂((按重量计)3％半乳糖，8％脱脂乳粉、5％甘油、1.5％谷氨酸钠(W/V，g/ml)，余量为水)，经冷冻干燥(-40℃，12小时)后得到益生菌微囊颗粒，平均粒径100微米。
4)将上述干燥微囊经经体外模拟胃液(pH＝1的盐酸溶液)处理后，再经模拟肠液(pH7.4的磷酸氢钠、磷酸氢二钠缓冲液)处理后，微囊溶解释放出酵母菌，经稀释平板法测定产品中活微生物，含量为105/g微囊产品。
实施例4
1)无菌条件下通过离心力场制备技术技术制备包埋有粪球菌的海藻酸钙凝胶微球，细胞包埋密度5×1011/ml海藻酸钙凝胶微球。
2)将上述微球加入保护剂((按重量计)3％半乳糖，8％脱脂乳粉、5％甘油、1.5％谷氨酸钠(W/V，g/ml)，余量为水)，经冷冻干燥(-40℃，12小时)，得到益生菌微囊颗粒，平均粒径300微米。
3)(购买商业化的S100，配制成质量百分比为20％的浓度，甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯摩尔比例1∶2)，包衣参数：鼓风流量127L/min，雾化气压力0.18mPa，包衣液流量0.9mL/min，流化温度37℃。制得最终的益生菌微囊产品，产品中粪球菌含量1013/g微囊产品。甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物包衣增重5％。
4)将上述干燥微囊经经体外模拟胃液(pH＝1的盐酸溶液)处理后，再经模拟肠液(pH7.4的磷酸氢钠、磷酸氢二钠缓冲液)处理后，微囊溶解释放出粪球菌，经稀释平板法测定产品中活微生物，含量保持109/g微囊产品。
Claims (8)
1.一种益生菌微胶囊产品，其特征在于:微胶囊产品为粒径10-1000微米的球形或不规则形微胶囊，微胶囊结构分为壁层与内核两部分：其中，壁层壳聚糖、海藻酸盐、甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物组成，组成产品壁层的壳聚糖、海藻酸盐、甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物三者的质量比为0.1:1:0.1-10:1:10；
内核为含有海藻酸盐及益生菌的混合物，内核中益生菌占据内核的体积百分比为10-98％，壁层与内核的体积比为1:100-10:1；
微胶囊具体制备步骤如下，
(1)制备包埋有益生菌的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；
其中，益生菌的含量为5×106-5×1013/ml微球；海藻酸盐为海藻酸的钙盐、钡盐、锌盐中的一种或二种以上；
(2)将步骤(1)中的A微球浸入壳聚糖溶液中，A微球与壳聚糖溶液体积比为1:1～1:40，反应1-60分钟，此时得到B微球，取出用生理盐水洗涤；
壳聚糖溶液的配制方法是：壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为0.01-1.5％w/v；
(3)将步骤(2)中的B微球浸入金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，B微球与金属螯合剂溶液体积比范围为1：1～1：40，反应1-60分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的C微球；
其中，金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠，此时C微球中的海藻酸盐为海藻酸的钠盐；
(4)将步骤(2)得到的B微球或步骤(3)得到的C微球放入益生菌培养液中培养，使益生菌在微囊内增殖到109-1013/ml微球的细胞密度后，得到D微球；
(5)将B微球、C微球或培养增殖后的D微球经干燥处理后获得E微球；
(6)在B微球、C微球、D微球或E微球表面被覆喷涂甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物，即得到益生菌微囊产品；
甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物中，甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯的摩尔比为1：10-10:1，喷涂采用的共聚物质量百分浓度在2-80％。
2.按照权利要求1所述的微胶囊产品，其特征在于：组成产品壁层中，海藻酸盐材料的分子量10kDa～5000kDa；壳聚糖材料的分子量为1kDa～1000kDa，脱乙酰度50-98％；甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物的分子量为10kDa～5000kDa，甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯的摩尔比为1：10-10:1；
组成产品内核的海藻酸盐材料的分子量10kDa～5000kDa。
3.按照权利要求1所述的微胶囊产品，其特征在于：产品中益生菌总含量在109-1015CFU/g，益生菌种类包括具有益生作用的乳杆菌，双歧杆菌，乳球菌，粪链球菌，中介链球菌，嗜热链球菌或酵母菌中的二种以上，每种菌的含量在106-1015CFU/g。
4.按照权利要求3所述的微胶囊产品，其特征在于：乳杆菌为嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、拉曼乳杆菌、弯曲乳杆菌、詹士乳杆菌、保加利亚乳杆菌中的一种或二种以上；
双歧杆菌为长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、婴儿双歧杆菌中的一种或二种以上。
5.一种权利要求1所述的微胶囊产品的制备方法，其特征在于：微胶囊制备步骤如下，
(1)制备包埋有益生菌的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；
其中，益生菌的含量为5×106-5×1013/ml微球；海藻酸盐为海藻酸的钙盐、钡盐、锌盐中的一种或二种以上；
(2)将步骤(1)中的A微球浸入壳聚糖溶液中，A微球与壳聚糖溶液体积比为1:1～1:40，反应1-60分钟，此时得到B微球，取出用生理盐水洗涤；
壳聚糖溶液的配制方法是：壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为0.01-1.5％w/v；
(3)将步骤(2)中的B微球浸入金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，B微球与金属螯合剂溶液体积比范围为1：1～1：40，反应1-60分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的C微球；
其中，金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠，此时C微球中的海藻酸盐为海藻酸的钠盐；
(4)将步骤(2)得到的B微球或步骤(3)得到的C微球放入益生菌培养液中培养，使益生菌在微囊内增殖到109-1013/ml微球的细胞密度后，得到D微球；
(5)将B微球、C微球或培养增殖后的D微球经干燥处理后获得E微球；
(6)在B微球、C微球、D微球或E微球表面被覆喷涂甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物，即得到益生菌微囊产品；
甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物中，甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯的摩尔比为1：10-10:1，喷涂采用的共聚物质量百分浓度在2-80％。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所获得的益生菌微囊产品可通过添加其他药物学可接受的辅料或食品领域采用辅料继续加工成片剂、或灌装成大胶囊。
7.一种权利要求1所述的微胶囊产品的应用，其特征在于：益生菌微囊产品可放入牛奶、酸奶、果冻、酸乳或奶粉食品中做成含益生菌的功能食品。
8.一种权利要求1所述的微胶囊产品的应用，其特征在于：益生菌微囊产品可添加到畜牧业饲料中，做成功能饲料。
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