BE1024197B1 - Procédé d'enrobage de microorganismes, poudre desdits microorganismes enrobés obtenue et composition pharmaceutique, nutraceutique, cosmétique, alimentaire ou sanitaire la comprenant. - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé d’enrobage de microorganismes, de préférence de microorganismes probiotiques et à une poudre desdits microorganismes enrobés obtenue par ce procédé, ainsi qu’aux compositions comprenant cette poudre.

Description

Procédé d'enrobage de microorganismes, poudre desdits microorganismes enrobés obtenue et composition pharmaceutique, nutraceutique, cosmétique, alimentaire ou sanitaire la comprenant

Domaine de l'invention [0001] La présente invention concerne un procédé d'enrobage de microorganismes cellulaires, en particulier de bactéries et de champignons y compris de levures, la poudre desdits microorganismes enrobés, ainsi qu'une composition pharmaceutique, nutraceutique, cosmétique, alimentaire ou sanitaire comprenant ladite poudre de microorganismes enrobés et les applications de ces compositions.

Arrière-plan technologique à la base de l'invention [0002] Même si les probiotiques peuvent être définis de plusieurs façons, en fonction de la compréhension des mécanismes d'action de leurs effets sur la santé humaine, il est généralement admis qu'il s'agit de micro-organismes vivants, bactéries ou levures utilisés comme compléments alimentaires microbiens vivants qui confèrent un effet bénéfique spécifié et démontré pour la santé de l'hôte qui les ingère, par exemple en améliorant son équilibre microbien intestinal. En raison de leurs effets bénéfiques sur la santé, les microorganismes probiotiques ont été utilisés dans le domaine pharmaceutique, cosmétique, nutraceutique et dans la transformation des aliments, en particulier pour la préparation d'aliments dits fonctionnels, c'est-à-dire ayant un effet bénéfique sur la santé ou ayant des vertus prophylactiques ou thérapeutiques contre certains désordres ou certaines maladies, affectant les animaux ou l'humain.

[0003] Cependant, la capacité des microorganismes à survivre et se multiplier dans un hôte influe fortement sur l'efficacité de leur action probiotique. En effet, les microorganismes probiotiques doivent être métaboliquement stables et actifs dans le produit qui kles contient et doivent survivre pendant le traitement et la durée de vie, en particulier lors du stockage, des compléments alimentaires et/ou des aliments au passage dans le tractus digestif supérieur. En particulier, ils doivent résister aux conditions extrêmement acides de l'estomac, à l'action d'enzymes et de sels biliaires dans l'intestin grêle, mais également à la teneur en oxygène ou en peroxyde d'hydrogène lors du stockage. Cette stabilité et cette efficacité pendant le temps, mais aussi durant le passage dans le tractus digestif, doit être maintenue pour obtenir des effets bénéfiques une fois dans l'intestin de l'hôte (Anal & Singh, 2007).

[0004] A titre indicatif, la norme que tout produit, vendu avec des allégations santé provenant de l'ajout de probiotiques doit contenir au moins 106 - 107 bactéries probiotiques viables par gramme (FAO/OMS, 2001).

[0005] Cependant, le nombre de bactéries probiotiques viables capables de fournir un effet bénéfique ciblé est souvent trop faible.

[0006] Différentes approches ont été utilisées pour améliorer la viabilité des probiotiques, y compris la sélection de souches résistantes à l'acidité et aux sels biliaires, l’adaptation au stress, l'utilisation de récipients imperméables à l’oxygène, une fermentation en continu-discontinu, l’incorporation d'oligo-éléments tels que les peptides et les acides aminés et la microencapsulation .

[0007] La micro-encapsulation des microorganismes probiotiques est un processus physico-chimique ou mécanique permettant de piéger une substance dans un matériau polymère afin de produire des microcapsules ou microbilles, d’un diamètre allant d'environ 1 pm à environ 1000 pm, qui peuvent libérer leur contenu à des taux contrôlés sous l’influence de conditions spécifiques.

[0008] L’ encapsulation des probiotiques est principalement utilisée pour protéger les cellules contre un environnement défavorable, plutôt que pour une libération contrôlée.

[0009] L'atomisation est un procédé de séchage bien connu caractérisé par des vitesses de production élevées et des coûts opérationnels relativement faibles. Cependant, les probiotiques soumis à une atomisation sont sensibles à la chaleur et un séchage entraîne une mort cellulaire à cause de la déshydratation et de l'inactivation thermique d'enzymes.

[0010] La lyophilisation est utilisée traditionnellement pour sécher et conserver les cultures d'initiation de la fermentation d'un procédé de préparation d'aliment et les probiotiques.

[0011] Il est connu un procédé d'obtention de bactéries lactiques, sous forme de poudre, comprenant les étapes consistant à cultiver les bactéries lactiques, à concentrer la culture et à lyophiliser celle-ci.

[0012] La lyophilisation permet d'obtenir une déshydratation poussée des microorganismes compatible avec des durées très longues de conservation des produits sous forme de poudre.

[0013] Cette méthode met en oeuvre des changements de température du produit assez agressifs pour les microorganismes, car elle nécessite une congélation, ce qui n'est pas sans conséquence pour les cellules. Dans certains cas, elle occasionne des altérations cellulaires (par une peroxydation des acides gras, mais également génétiques par une modification des protéines.

[0014] Le niveau de la viabilité cellulaire après lyophilisation varie en fonction de nombreux facteurs, dont la souche du micro-organisme et l'efficacité de l'agent protecteur utilisé pendant la lyophilisation (Morgan & al., 2006).

[0015] Les poudres obtenues sont cependant peu résistantes à l’air, à l’humidité et/ou à la température. Elles conservent difficilement une concentration cellulaire stable pendant un stockage. De plus, lorsque les microorganismes comme les bactéries lactiques passent par l’estomac après l’ingestion, une majorité des cellules sont tuées par le suc gastrique avant d’atteindre l’intestin.

[0016] Afin de surmonter ces problèmes, des procédés d'enrobage des micro-organismes, en particulier des bactéries lactiques, utilisant des gélatines, des sucres, des gommes, etc. ont été proposés. Le procédé classique pour l’enrobage des micro-organismes, en particulier des bactéries lactiques, comprend habituellement l’étape consistant à introduire un enrobage spécifique sur les cellules séchées ou sur la culture concentrée de cellules comme indiqué à la Figure 1.

[0017] Les microorganismes, en particulier les bactéries lactiques sont cultivées dans un bioréacteur en aérobie ou anaérobie en utilisant un milieu de fermentation contenant des sources assimilables d'acides aminés, peptides, sucres, vitamines et minéraux. Ces nutriments contenus dans le milieu ne sont utilisés que pour la prolifération des cellules.

[0018] Les cultures concentrées sont obtenues au moyen d'une séparation par une centrifugation ou une ultrafiltration, dont le but est uniquement la séparation et la concentration des cellules contenues dans le milieu de culture.

[0019] Une composition d'enrobage peut être appliquée à la culture sèche de micro-organismes, en particulier des bactéries lactiques ainsi obtenues, suivie d'un séchage, le plus souvent par lyophilisation.

[0020] De façon alternative, la culture de microorganismes, en particulier de bactéries lactiques concentrées et formulées, peut être introduite dans une solution aqueuse de la composition d'enrobage, suivie d'un séchage, le plus souvent par lyophilisation.

[0021] Cet enrobage peut être de type microsphérique, et appliqué aux micro-organismes, en particulier aux bactéries lactiques par une buse d'injection dans un procédé de micro-encapsulation.

[0022] Pour la micro-encapsulation de cellules microbiennes, il est essentiel que le procédé d'encapsulation soit mis en oeuvre dans des conditions relativement douces pour assurer une viabilité élevée des cellules encapsulées.

[0023] Il existe de nombreuses techniques de microencapsulation. Cependant, les techniques appliquées aux probiotiques sont généralement limitées à l'encapsulation dans des particules en gel, l'enrobage en lit fluidisé, et le séchage par atomisation.

[0024] Les techniques d’encapsulation de microorganismes probiotiques dans des particules en gel peuvent être classées en 2 groupes, en fonction du procédé utilisé pour former les capsules ou les billes : les techniques d'extrusion et d'émulsion.

[0025] L'extrusion est une technique physique qui utilise des hydro-colloïdes comme matériaux d’encapsulation. La solution de polymère est d'abord mélangée avec les cellules microbiennes. Ce mélange est ensuite extrudé, à travers une buse à haute pression, sous forme de gouttelettes dans une solution contenant un agent de solidification.

[0026] La gélification se produit par contact de la solution de polymère avec l’agent de solidification, par refroidissement ou par une combinaison des deux. Les facteurs qui influent la taille des microsphères produites sont : - le diamètre de la buse de dispersion, - la viscosité et le débit de la solution polymère, - la distance d'écoulement entre la buse et la solution de solidification, - la concentration et la température de la solution de polymère.

[0027] De nouvelles techniques ont été développées pour la formation de gouttelettes et donc des microsphères par extrusion : (a) la formation de gouttelettes par une force électrostatique, (b) la formation de gouttelettes par le dispositif de jet coupé, (c) la formation de gouttelettes par la fréquence des vibrations, (d) la formation de gouttelettes par co-extrusion (flux coaxial).

[0028] Les principaux avantages de la méthode d’extrusion sont la simplicité de son fonctionnement, à moindre coût, et les conditions de fonctionnement assurant une viabilité cellulaire élevée. L'inconvénient majeur de cette technique est qu'elle est difficile à industrialiser et à automatiser en raison de la formation des microbilles.

[0029] La réalisation d'une émulsion est une technique chimique permettant d'encapsuler des cellules probiotiques, qui utilise également des hydro-colloïdes comme matériaux d’encapsulation. Cette technique implique la dispersion d'une suspension « cellule-polymère » (phase discontinue) dans une phase huileuse/organique (phase continue). Le mélange est ensuite homogénéisé pour former une émulsion eau-dans-huile à l’aide d’un agent tensioactif et d'une agitation. La gélification de la phase dispersée est déclenchée par refroidissement ou par l'addition d’un agent de solidification à l’émulsion. Les microsphères produites sont ensuite recueillies par filtration ou par centrifugation.

[0030] Cette technique présente l'avantage d'être facile à industrialiser et donne un taux de survie élevé des micro-organismes. L'inconvénient majeur de cette technique est que les microbilles produites présentent un large éventail de tailles et de formes.

[0031] Le séchage par atomisation est couramment utilisé pour la micro-encapsulation de microorganismes probiotiques. Il implique l'atomisation d’une solution contenant les cellules microbiennes et la matrice de polymère dans l’air chaud de séchage, suivie d’une évaporation rapide de l’eau.

[0032] Le produit micro-encapsulé est ensuite séparé, sous forme d’une poudre sèche, de l’air de transport dans un cyclone. Différents paramètres de séchage par pulvérisation tels que le taux d’alimentation en produits, le débit d’air, la température du produit, la température d’entrée d’air, et la température de sortie d’air doivent être optimisés afin de produire des microsphères, capsules ou billes bien formées.

[0033] Cette technique présente l'avantage d'avoir des vitesses de production élevées mais aussi des inconvénients comme les coûts de l'installation industrielle et de fonctionnement. Mais, le problème principal est l'utilisation de températures élevées et des stress osmotiques dus à la déshydratation qui entraînent des pertes de viabilité et d'activité relativement élevés immédiatement après pulvérisation, en particulier l'inactivation d'enzymes essentielles qui maintiennent l’équilibre cellulaire.

[0034] D'après Châvez & Ledeboer, 2007, le nombre logarithmique de probiotiques diminue linéairement avec la température de l’air de sortie de l'atomiseur (dans la plage de 50 ° C - 80 ° C) et travailler avec des températures inférieures conduit à une accumulation de poudre à l'intérieur du cyclone. L'encapsulation par atomisation de Lactobacillus acidophilus réduit la viabilité d’environ 100 fois par rapport à avant l’encapsulation en raison de la température élevée utilisée dans le procédé (Zhao et al. 2008) . Divers facteurs tels que le type et la concentration des matériaux supports, les combinaisons temps- température et la résistance à la chaleur des cellules microbiennes influencent la viabilité des cellules encapsulées par atomisation. En utilisant un amidon modifié pré-gélatinisé en tant que matériau de support, O’Riordan (2001) a néanmoins obtenu une perte de moins d'une unité logarithmique (0,78) lors de l’encapsulation de cellules de Bifidobacterium avec une température d’entrée de 100 °C et une température de sortie de 45 °C.

[0035] Lors d'un enrobage par pulvérisation, c'est à dire dans la technique du lit fluidisé, les cellules probiotiques doivent être sous forme solide, mais pas nécessairement complètement séchées. Elles sont ensuite mises en suspension dans l’air et un matériau d'enrobage liquide est appliqué par pulvérisation sur les cellules probiotiques. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet facilement l'ajout d'une couche supplémentaire de molécules ciblées pour une libération dans l’intestin, par exemple.

[0036] Le but de la micro-encapsulation est de préserver la viabilité des cellules microbiennes encapsulées des conditions environnementales néfastes rencontrées lors de leur mise en œuvre, lors de leur conservation avant emploi, mais aussi lors de leur addition à des aliments et au cours du passage à travers le tube digestif. Cependant, il existe une perte de viabilité cellulaire au cours des étapes du procédé de la microencapsulation lui-même ou du séchage qui le suit.

[0037] Un problème dans l'approche de l'enrobage des probiotiques est que ces technologies stabilisent les bactéries le plus souvent sous forme liquide. Pour améliorer le stockage, il est pratique de convertir ces capsules ou billes en poudre sèche en utilisant des techniques telles que l'atomisation, la lyophilisation ou le lit fluidisé. Néanmoins, il est également connu que la lyophilisation induit une mortalité significative des cellules bactériennes à cause de la perte d'intégrité membranaire et de la dénaturation des macromolécules. Les composants du milieu dans lequel les bactéries sont séchées peuvent avoir un effet plus important sur la stabilité des probiotiques que la micro-encapsulation elle-même.

[0038] La double encapsulation dans l'alginate et la maltodextrine de Lactobacillus rhamnosus GG et de Lactobacillus acidophilus NCFM ne montre pas de différence dans la perte de viabilité observée suite à la lyophilisation par rapport à celle observée avec les suspensions cellulaires préparées avec la maltodextrine seule : la réduction logarithmique de Lactobacillus GG est de 0,63 et 0,84, la réduction logarithmique de

Lactobacillus NCFM est de 1,89 et 1,95 respectivement pour les cellules doublement encapsulées et les cellules libres (Sohail & al., 2013).

[0039] La viabilité de Bifidobacterium longum 15708 micro-encapsulé par une technique d'extrusion et de pulvérisation (spray) dans une matrice alginate après lyophilisation a été évaluée par Amine et al. (2014) . Des pertes de viabilité de 2,9 et 2 log ont respectivement été observées. La lyophilisation des cellules libres a entraîné une perte de 2,75 log.

[0040] La multiplication de ces microorganismes probiotiques à l'intérieur de capsules ou billes composées d'un matériau polymère est déjà connue dans l'art. En effet, il a été démontré que la production de populations élevées de probiotiques était possible à l'intérieur de billes d'alginate.

[0041] Cependant de manière générale, de tels procédés classiques pour l’enrobage des bactéries lactiques qui comprennent les étapes d’introduction de la composition d'enrobage ou de micro-encapsulation après concentration et éventuellement séchage des cultures, conduisent lors de l'étape de lyophilisation, à des rendements de survie cellulaire qui restent faibles pour de nombreux probiotiques.

[0042] En outre, il est connu que les microorganismes probiotiques montrent une perte de viabilité cellulaire au cours des étapes du procédé de la micro-encapsulation lui-même et lors de leur séchage.

Etat de la technique [0043] Champagne et al. (2000 & 2007) décrivent une production de microorganismes probiotiques à l'intérieur d'une capsule composée d'un matériau polymérique, en particulier de billes d'alginate. Cependant ce document ne décrit ni ne suggère de traiter ces billes d'alginate obtenues par une étape supplémentaire de séchage, en particulier par lyophilisation.

[0044] La demande internationale de brevet WO2015/000972 divulgue une méthode améliorée de lyophilisation de cellules encapsulées comprenant deux étapes successives de deux brèves incubations, de moins d'une heure et insuffisantes pour assurer une multiplication cellulaire dans un milieu comprenant des molécules protectrices, suivie d'une étape de séchage de ces cellules encapsulés et traités.

Buts de l'invention [0045] La présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé d'encapsulation de micro-organismes, en particulier des microorganismes probiotiques choisis parmi le groupe constitué par les bactéries, telles que les bactéries lactiques et les bifidobactéries, ainsi que les champignons, en particulier les levures, et qui ne présente pas les inconvénients de l'état de la technique.

[0046] Un but particulier de l'invention est d'obtenir un procédé industrialisable et qui génère des poudres de ces micro-organismes, en particulier des probiotiques encapsulés avec une faible mortalité des cellules encapsulées.

[0047] Un dernier but de l'invention est d'obtenir de telles poudres de microorganismes lyophilisées qui comprennent une concentration élevée en microorganismes vivants encapsulés aptes à présenter une efficacité probiotique ou non probiotique dans des compositions de type pharmaceutiques, cosmétiques, agroalimentaires, nutraceutiques ou sanitaires, en particulier dans des compositions sanitaires utilisables dans l'épuration des canalisations ou des fosses septiques, mais aussi d'obtenir des poudres ayant de préférence des tailles uniformes de particules solides constituées de ces capsules, microsphères ou billes, les dites poudres étant aptes à être conservées, manipulées et stockées pendant des durées prolongées.

Eléments caractéristiques de l'invention [0048] La présente invention concerne un procédé d'enrobage ou d'encapsulation de microorganismes de préférence des microorganismes probiotiques, le dit procédé comprenant les étapes, de préférence consécutives suivantes: - éventuellement une première étape de culture et de multiplication desdits microorganismes, suivie éventuellement d'une étape de collecte desdits microorganismes, - une étape d'enrobage desdits microorganismes dans des capsules polymériques, - une seconde étape de culture et de multiplication des dits microorganismes encapsulés dans une solution nutritive adéquate pendant une durée comprise entre 2 heures et 7 jours, - une étape de collecte des microorganismes multipliés et encapsulés et - une étape de séchage par lyophilisation des microorganismes multipliés et encapsulés pour former une poudre de microorganismes encapsulés.

[0049] La présente invention concerne aussi une poudre de microorganismes, de préférence probiotiques, incorporées dans des capsules polymériques et obtenue de préférence par le procédé de l'invention.

[0050] De préférence, dans le procédé et les poudres de l'invention, les microorganismes, sont choisis parmi les bactéries probiotiques et les champignons, en particulier les levures.

[0051] Avantageusement, les bactéries probiotiques sont choisies parmi le groupe constitué par les bactéries lactiques ou les bifidobactéries, plus particulièrement les bactéries lactiques sont choisies parmi le groupe constitué par Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, lactobacillus alimentarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, en particulier Lactobacillus casei subsp. Casei ou Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, en particulier Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ou Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Oenococcus oeni, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus halophilus, Streptococcus thermophilus ou leur mélange.

[0052] Dans le procédé et les poudres de l'invention, les bifidobactéries sont choisies parmi le groupe constitué par Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis y compris Bifidobacterium animalis subsp. animalis et Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum,

Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidibacterium lactis, Bididobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum ou leur mélange. Les microorganismes peuvent aussi être choisis parmi le groupe constitué par Micrococcus varians, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus natto, Bacillus clausii, Bacillus cereus var. toyoi, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli souche nissle, Paenibacillus alvei, Propionibacterium freudenreichii Escherichia coli souche nissle, Propionibacterium freudenreichii et les levures, de préférence Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Yarrowia lipolytica, Brettanomyces bruxellensis, Debaryomyces hansenii, Candida albicans et Kluyveromyces marxianus .

[0053] Avantageusement dans le procédé et les poudres de l'invention, le matériau polymérique enrobant des capsules polymériques est un hydro-colloïde choisi parmi le groupe constitué par l'alginate, l'agar, les carraghénanes, de préférence le !-carraghénane, l'amidon, le chitosane, l'alginate, la pectine, le pullulane, la gélatine, les gommes, en particulier la gomme gellane ou la gomme xanthane, l’acétophtalate de cellulose, la gélatine, les protéines du lait, en particulier la caséine ou un mélange d'entre eux, tels que décrits par Burgain & al. (2011) ainsi que par Rathore & al. (2013) ; lesdits materiaux pouvant être combinés à d'autres éléments connus pour améliorer cet enrobage, en particulier des maltodextrines, de la cellulose, de l'hemicellulose, de l'ethylcelllulose, de la carboxycellulose et leur mélange.

[0054] Dans le procédé de l'invention, la solution nutritive des microorganismes encapsulés comprend essentiellement des acides aminés, des saccharides, des minéraux et éventuellement des vitamines.

[0055] De préférence dans la poudre de l'invention, le microorganisme est soit Lactobacillus rhamnosus et comprend une concentration en Lactobacillus rhamnosus supérieure à 1,5 x 1011 (cfu/g), de préférence supérieure à 2 x 1011 (cfu/g) ou soit le microorganisme est choisi parmi le groupe constitué par Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus et Lactobacillus bulgaricus et comprend une concentration en microorganismes par capsule supérieure à 1x 109 (cfu/g), de préférence comprise entre 1 x 109 (cfu/g) et 2 x 1011 (cfu/g) .

[0056] Un autre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un diluant ou véhicule pharmaceutique adéquat, une composition alimentaire comprenant un diluant ou un véhicule alimentaire adéquat ou une composition nutraceutique comprenant un diluant ou un véhicule adéquat et la poudre de l'invention.

[0057] Un dernier aspect de l'invention concerne une composition sanitaire, en particulier destinée à l'épuration des déchets présents dans des canalisations ou fosses septiques et comprenant la poudre de l'invention.

[0058] La présente invention sera décrite en détails ci-dessous dans la description d'une forme d'exécution préférée de l'invention, en référence aux figures et à l'exemple présenté à titre d'illustration non limitative de la portée de l'invention.

Brève description des figures [0059] La figure 1 représente les étapes d'un procédé de l'état de la technique pour un enrobage de bactéries lactiques.

[0060] La figure 2 représente les étapes principales du procédé d'obtention d'une poudre lyophilisée des bactéries lactiques enrobées selon la présente invention.

Description détaillée de l'invention [0061] La présente invention concerne un procédé d'enrobage ou d'encapsulation, en particulier de microencapsulation d'un microorganisme, c'est-à-dire une cellule vivante choisie parmi le groupe constitué par les bactéries, en particulier les bactéries lactiques ou les bifidobactéries et les champignons, de préférence un microorganisme probiotique encapsulé comprenant, tel que représenté à la figure 2, les étapes, de préférence successives, suivantes: - éventuellement une première culture 1, multiplication ou propagation préalable desdits microorganismes cellulaires, de préférence probiotiques, en particulier des microorganismes, en particulier des bactéries lactiques ou des levures, sur un milieu de croissance des microorganismes adéquat, en particulier une solution aqueuse comprenant de préférence comme nutriments, au moins des acides aminés, des saccharides, des minéraux et éventuellement des vitamines ; - éventuellement une étape de collecte des microorganismes multipliés dénommée étape de formulation 2 desdits microorganismes pour les mettre en conditions aptes à l'étape ultérieure d'enrobage ; - un enrobage ou une encapsulation, en particulier une micro-encapsulation 3 desdits microorganismes ou cellules, de préférence probiotiques, multipliés dans des capsules, c'est-à-dire des microsphères ou des billes polymériques ; - une seconde culture 4, multiplication ou propagation desdits microorganismes dans une solution nutritive adéquate, de préférence une solution aqueuse comprenant comme nutriments au moins des saccharides, des acides aminés, des minéraux, et éventuellement des vitamines et, pendant une phase de croissance cellulaire dans (à l'intérieur de) lesdites capsules polymériques, les desdites microsphères ou lesdites billes polymériques, afin d'augmenter la concentration, de préférence d'un facteur 2, 4, 6, 10, 100 ou 1000 ou plus desdits micro-organismes, de préférence probiotiques, à l'intérieur des capsules, microsphères ou billes polymériques, pendant une durée adéquate pour cette culture, multiplication ou propagation, de préférence pendant une durée de plus de 2 heures, de préférence une durée de plus de 4 heures ou 6 heures, de plus de 12 heures, voire de plus de 24 heures ou 48 heures, en particulier pendant une durée comprise entre environ 2 heures et environ 7 jours, de préférence comprise entre environ 6 heures et environ 4 jours, plus particulièrement entre environ 12 heures et environ 48 heures ; - une récolte 5, de préférence sur un tamis de taille adéquate, desdits micro-organismes, de préférence probiotiques, encapsulés et - un séchage 6, de préférence par lyophilisation des micro-organismes, de préférence probiotiques, encapsulés pour former une poudre de microorganismes, de préférence probiotiques encapsulés.

[0062] Selon l'invention, le milieu de culture des microorganismes encapsulés est une solution nutritive et de préférence aqueuse connue pour la croissance des microorganismes, en particulier les bactéries et les champignons, y compris les levures et comporte, de préférence des acides aminés ou des peptides source d'acides aminés, des saccharides, c'est-à-dire des monosaccharides tel que le glucose ou des polysaccharides, des minéraux en particulier sous forme de sels d'halogénures et de métaux alcalins ou alcalinoterreux, éventuellement des vitamines ayant de préférence des activités anti-oxydantes et éventuellement des acides, tels que l'acide ascorbique ou l'acide citrique.

[0063] De préférence, la solution nutritive comporte les éléments suivants: peptone de caséine, extrait de levure, extrait de viande, du polyoxyethylene sorbitan monooleate (polysorbate 80 ou tween 80 ®), glucose, des minéraux (de préférence choisis parmi le groupe constitué par du potassium, du sodium, de l'ammonium, du magnésium et du manganèse et éventuellement du Zinc, du Cuivre, du fer, du Bore, du Cobalt, des sulfates, en particulier du sulfate de calcium et/ou du sulfate de magnésium, du phosphate de diammonium, de l'acide phosphorique, éventuellement du peptone de viande, du tryptone, du glucose ou d'autres saccharides , des vitamines).

[0064] Les capsules ou les billes sont des capsules polymériques ou des billes polymériques dont le matériau (un hydro-colloïde) principal est choisi parmi le groupe constitué par l'alginate, l'agar, les carraghénanes, de préférence le !-carraghénane, l'amidon, le chitosane, l'alginate, la pectine, le pullulane, la gélatine, les gommes, en particulier la gomme gellane ou la gomme xanthane, l’acétophtalate de cellulose, la gélatine, les protéines du lait, en particulier la caséine ou un mélange d'entre eux, tels que décrits par Burgain & al. (2011) ainsi que par Rathore & al.(2013); lesdits materiaux pouvant être combinés à d'autres éléments connus pour améliorer cet enrobage, en particulier des maltodextrines, de la cellulose, de l'hemicellulose, de l'ethylcelllulose, de la carboxycellulose et leur mélange. De préférence, les capsules polymériques ou billes polymériques sont des capsules d'un matériau choisi parmi le groupe constitué par l'alginate ou un mélange d'alginate et de maltodextrines.

[0065] Les capsules, microsphères ou billes sont presque exclusivement produites en utilisant des polymères solubles dans l'eau qui fournissent un degré élevé de perméabilité aux nutriments de faible poids moléculaire et aux métabolites, fournissant ainsi des conditions optimales nécessaires au bon fonctionnement des cellules, de préférence probiotiques, immobilisées. En outre, de préférence, les matériaux des capsules, microsphères ou billes sont sélectionnés pour assurer une libération entérique des microorganismes, c'est-à-dire dans l'intestin du mammifère, y compris l'homme à qui elles sont administrées.

[0066] Aussi bien des polymères hydrosolubles naturels que des synthétiques ont été utilisés pour la micro-encapsulation de cellules microbiennes. Bien que les polymères synthétiques offrent une plus grande résistance mécanique et une meilleure stabilité chimique, les polymères naturels sont préférés à leurs homologues synthétiques, car ils sont moins nocifs pour l'intégrité et la viabilité cellulaire des microorganismes encapsulés ou enrobés.

[0067] Les microsphères, capsules ou billes obtenues par le procédé de l'invention sont d'une taille généralement comprise entre environ 1 pm et environ 1000 pm, de préférence entre environ 5 pm et environ 800 pm, plus particulièrement entre environ 10 pm et environ 500 pm.

[0068] Avantageusement, selon l'invention, les microorganismes, de préférence probiotiques, en particulier des bactéries lactiques sont propagées une première fois dans un bioréacteur en conditions aérobies ou en conditions anaérobies en utilisant un milieu de fermentation contenant des nutriments adéquats, en particulier une ou plusieurs source(s) assimilable(s) d'acides aminés, de peptides, de saccharides, de vitamines et de minéraux.

[0069] Cette culture de microorganismes probiotiques multipliés est ensuite introduite dans une composition d'enrobage, sans concentration préalable; la culture de micro-organismes, probiotiques, étant de préférence mélangée avec une solution comprise entre environ 1% et environ 10% d'alginate de sodium stérile, de préférence à environ 5% d’alginate de sodium stérile.

[0070] Ledit mélange est ajouté goutte à goutte par extrusion dans une solution stérile contenant entre environ 3% et environ 1% de CaCl2, de préférence environ 2% Cacl2 et entre environ 0.1 % et environ 5 % de glycérol, de préférence environ 1% de glycérol, à température ambiante tout en agitant continuellement et ces capsules, microsphères ou ces billes obtenues sont ensuite durcies dans cette solution pendant une durée comprise entre environ 30 minutes et environ 2 heures, de préférence pendant environ 1 heure.

[0071] La viabilité cellulaire de la poudre de cellules probiotiques enrobées ainsi obtenue est étonnamment supérieure à celle d'une poudre de cellules probiotiques enrobées obtenue à partir de capsules, de microsphères ou de billes contenant une culture concentrée de ces microorganismes probiotiques.

[0072] De préférence, les microorganismes sont des bactéries gram-positives, en particulier des espèces de bactéries lactiques principalement utilisées comme probiotiques et traitées par les étapes du procédé de l'invention sont choisies parmi le groupe constitué par Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, en particulier Lactobacillus casei subsp. Casei ou Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, en particulier Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ou Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Oenococcus oeni, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus halophilus, Streptococcus thermophilus, d'autres bactéries décrites par Makinen & Bigret, 1993 ou par Anal & Singh, 2007 ou leurs mélanges.

[0073] Les bactéries lactiques, qui sont parmi les microorganismes probiotiques les plus importants généralement associés au tractus gastro-intestinal, ont de nombreux effets bénéfiques sur la flore intestinale humaine, y compris pour la stimulation immunitaire, pour la réduction du taux de cholestérol, l'inhibition de la croissance des pathogènes, le maintien d'une microflore intestinale saine, la prévention du cancer, l'amélioration de l'utilisation du lactose, la prévention des maladies diarrhéiques ou de la constipation, l'absorption du calcium, la synthèse de vitamines et la prédigestion des protéines (Li & al., 2009).

[0074] Ces bactéries Gram-positives, en forme de bâtonnet, non sporulées, catalase-négatives, généralement anaérobies, mais aérotolérantes, sont tolérantes à l’acidité et peuvent être fermentaires; l’acide lactique est le principal produit final de la fermentation des sucres (Axelsson, 1993) .

[0075] En outre, d’autres microorganismes communément utilisés comme probiotiques sont les bifidobactéries, également traitées par les étapes du procédé de l'invention, de préférence choisies parmi le groupe constitué par Bifidobacterium adolescentie, Bifidobacterium animalis, y compris Bifidobacterium animalis subsp.animalis et Bifidobacterium animalis subsp.lactis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidibacterium lactis, Bididobacterium longum et Bifidobacterium pseudolongum.

[0076] Les bifidobactéries sont également Gram-positives et sont en forme de bâtonnet, mais assurent leur croissance en anaérobie. Ces bactéries peuvent se développer à un pH appartenant à la gamme 4.5-8.5. Les bifidobactéries fermentent les hydrates de carbone, produisant principalement de l’acide acétique et de l’acide lactique dans un rapport molaire de 3:2 (v/v), mais pas de dioxyde de carbone, d’acide butyrique ou d’acide propionique.

[0077] Outre les bactéries lactiques, d'autres bactéries telles que Micrococcus varians, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus natto, Bacillus clausii, Bacillus cereus var. toyoi, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli souche nissle, Paenibacillus alvei, Propionibacterium freudenreichii

Escherichia coli souche nissle, Propionibacterium freudenreichii ont également été identifiés comme ayant des effets probiotiques (Holzapfel, Haberer, Geisen, Bjorkroth, & Schillinger, 2001 ; Anal & Singh, 2007) et sont traités par les étapes de préférence successives du procédé de l'invention.

[0078] Outre des bactéries, d'autres microorganismes tel que des champignons peuvent être aussi enrobés par le procédé de l'invention et présents dans les poudres de l'invention. Parmi les champignons préférées, on peut mentionnes les levures, telles que Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Yarrowia lipolytica, Brettanomyces bruxellensis, Debaryomyces hansenii, Candida albicans et Kluyveromyces marxianus .L'invention concerne également la composition pharmaceutique, de préférence entérique, nutraceutique, alimentaire ou sanitaire comprenant éventuellement un diluant tel qu'un solvant, ou véhicule pharmaceutique, cosmétique ou alimentaire adéquat ainsi que la poudre de microorganismes, de préférence probiotiques, encapsulés et séchés de l'invention, ainsi que les applications, en particulier thérapeutiques (y compris pour le maintien ou le rétablissement de la santé d'un animal mammifère, y compris l'humain, mais aussi pour le traitement ou la prévention des pathologies infectieuses inflammatoires, comme la gastro-entérite, en particulier du nouveau-né, ou la maladie de Crohn) et cosmétiques de ces compositions. En particulier la présente invention concerne l'application de la composition sanitaire de l'invention pour l'épuration de canalisations ou de fosses septiques.

[0079] Les compositions alimentaires, nutraceutiques ou pharmaceutiques de l'invention sont de préférence des compositions entériques présentes sous la forme d'une gélule dure ou gélule souple, de tablettes, de sachets ou de formulations adéquates contenant des matériaux tels que de l'amidon ou de la cellulose facilement administrables per os.

Exemple: Obtention de capsules d'alginate avec crème de Lactobacillus (Lb.) rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus ou Lactobacillus bulgaricus [0080] Des microsphères ou capsules de Lb. rhamnosus, Lb. acidophillus, Lb. helveticus ou Lb. bugaricus dans une matrice faite d'alginate ont été préparées selon le protocole suivant : [0081] 250 g ou 50 g d'une solution stérile d'alginate à 5% en poids ont été ajoutés à des quantités équivalentes de 250g de crème de Lb. rhamnosus (7 x 109 cfu) , à 50 g de Lb. helveticus (8,73 x 109 cfu), à 250 g de Lb. acidophilus (1,14 x 109 cfu), ou à 50 g de Lb. bulgaricus (8,03 x 108 cfu) .

[0082] Une coulée goutte à goutte avec un appareil de rupture des gouttes en régime d'écoulement laminaire a été réalisée pour produire des microsphères par solidification dans une solution composée de CaCl2 à 2% en poids et de glycérol à 1% en poids sous agitation. La séparation des microsphères a ensuite été réalisée à l'aide d'un t ami s stérile.

[0083] 250g ou 50g des microsphères ou capsules ainsi produites ont été mis en culture dans un bioréacteur afin d'augmenter la concentration cellulaire en Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. helveticus ou Lb. bulgaricus à l'intérieur des microsphères avant lyophilisation.

Une poudre fluide et sèche de microsphères ou de capsules a été obtenue.

[0084] Dans les mêmes conditions, un témoin plus concentré en cellules de Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. helveticus ou Lb. bulgaricus a été réalisé afin d'avoir une concentration dans les microsphères équivalente à la concentration en Lb. rhamnosus Lb. acidophilus, Lb. helveticus ou Lb. bulgaricus obtenue après la phase de croissance cellulaire dans les microsphères.

[0085] Les teneurs en bactéries viables dans les microsphères ou capsules (cfu) ont été analysées avant et après la phase de croissance dans les microsphères ou capsules ainsi qu'après la lyophilisation. Ces-dernières ont été comparées aux teneurs en bactéries viables obtenues dans des microsphères ou capsules plus concentrées avant et après lyophilisation (témoin). Des résultats similaires aussi inattendus ont été obtenus avec d'autres souches de microorganismes de bactéries lactiques, de bifidobactéries ou de levures. Par conséquent, ces différents types de microorganismes peuvent trouver à ces concentrations plus élevées et plus viables des applications avantageuses dans l'alimentation, la nutraceutique, la cosmétique ou la pharmacie ainsi que dans le domaine sanitaire, en particulier pour le traitement des déchets dans les canalisations et les fosses septiques.

[0086] Les résultats pour les 4 souches décrites ci-dessus sont présentés dans le tableau 1 suivant :

Bibliographie

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Zhao, & al. (2008) . World Journal of Microbiology and Biotechnology 24 (8), 1349-1354. LEGENDE Fig. 1

Claims (17)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé d'enrobage de microorganismes comprenant les étapes suivantes : - éventuellement une première étape de culture (1) desdits microorganismes suivie éventuellement d'une étape de collecte (2) desdits microorganismes, - une étape d'enrobage (3) desdits microorganismes dans des capsules polymériques, - une seconde étape de culture et de multiplication (4) desdits microorganismes encapsulés dans une solution nutritive pendant une durée supérieure à 24 heures, - une étape de collecte (5) des microorganismes multipliés et encapsulés et - une étape de séchage (6) par lyophilisation des microorganismes multipliés et encapsulés pour former une poudre de microorganismes encapsulés.
2. 2. Le procédé selon la revendication 1 dans lequel les microorganismes sont des microorganismes probiotiques.
3. 3. Le procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2 dans lequel les microorganismes sont choisis parmi les bactéries et les champignons, en particulier les levures.
4. 4. Le procédé selon la revendication 3 dans lequel les bactéries sont choisies parmi le groupe constitué par les bactéries lactiques ou les bifidobactéries.
5. 5. Le procédé selon la revendication 4, dans lequel les bactéries lactiques sont choisies parmi le groupe constitué par Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, lactobacillus alimentarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, en particulier Lactobacillus casei subsp. Casei ou Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, en particulier Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ou Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Oenococcus oeni, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus halophilus, Streptococcus thermophilus ou leur mélange.
6. 6. Le procédé selon la revendication 4 dans lequel les bifidobactéries sont choisies parmi le groupe constitué par Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidibacterium lactis, Bididobacterium longum, bifidobacterium pseudolongum ou leur mélange.
7. 7. Le procédé selon la revendication 3, dans lequel le microorganisme est choisi parmi le groupe constitué par Micrococcus varians, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus natto, Bacillus clausii, Bacillus cereus var. toyoi, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli souche nissle, Paenibacillus alvei, Propionibacterium freudenreichii Escherichia coli souche nissle, Propionibacterium freudenreichii et les levures, de préférence Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Yarrowia lipolytica, Brettanomyces bruxellensis, Debaryomyces hansenii, Candida albicans et Kluyveromyces marxianus ou leur mélange.
8. 8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le matériau polymérique enrobant des capsules polymériques est un hydro-colloïde.
9. 9. Le procédé selon la revendication 8, dans lequel l'hydro-colloïde est choisi parmi le groupe constitué par l'alginate, l'agar, les carraghénanes, de préférence le κ-carraghénane, l'amidon, le chitosane, l'alginate, la pectine, le pullulane, la gélatine, les gommes, en particulier la gomme gellane ou la gomme xanthane, l’acétophtalate de cellulose, la gélatine, les protéines du lait, en particulier la caséine ou un mélange d'entre eux, de préférence de l'alginate ou un mélange contenant de l'alginate et d'autres éléments connus pour améliorer cet enrobage, en particulier des maltodextrines, de la cellulose, de l'hemicellulose, de l'ethylcelllulose, de la carboxycellulose et leur mélange, de préférence des maltodextrines.
10. 10. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la solution nutritive des microorganismes encapsulés comprend des acides aminés, des saccharides, des minéraux et éventuellement des vitamines.
11. 11. Poudre de microorganismes, de préférence probiotiques, incorporées dans des capsules polymériques et obtenue de préférence par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
12. 12. La poudre selon la revendication 11, dans laquelle le microorganisme est Lactobacillus rhamonosus et comprenant une concentration en lactobacillus rhamnosus supérieure à 1,5 x 1011(cfu/g), de préférence supérieure à 2 x 1011 (cfu/g).
13. 13. La poudre selon la revendication 11, dans laquelle le microorganisme est choisi parmi le groupe constitué par Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus et Lactobacillus bulgaricus et comprenant une concentration en microorganismes par capsule supérieure à 1x 109 (cfu/g), de préférence comprise entre 1 x 109 (cfu/g) et 2 x 1011 (cfu/g) .
14. 14. Composition pharmaceutique comprenant un diluant ou véhicule pharmaceutique adéquat et la poudre selon l'une quelconque des revendications précédentes 11 à 13.
15. 15. Composition alimentaire comprenant un diluant ou un véhicule alimentaire adéquat et la poudre selon l'une quelconque des revendications précédentes 11 à 13.
16. 16. Composition nutraceutique comprenant un diluant ou un véhicule adéquat et la poudre selon l'une quelconque des revendications précédentes 11 à 13.
17. 17. Composition sanitaire, en particulier destinée à l'épuration des déchets présents dans des canalisations ou fosses septiques et comprenant la poudre selon l'une quelconque des revendications précédentes 11 à 13.