CN114249432B - 一种生物促进剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种生物促进剂，属环保微生物领域。该生物促进剂包含嗜盐鱼芽孢杆菌（Piscibacillus halophilus）LH‑B.0015的发酵产物，还包含淀粉类、糖类、无机离子。本发明还公开了前述生物促进剂的用途。本发明的微生物促进剂能够促进耐盐脱氮效果，在盐度1%‑25%的体系中提高脱氮效率。该生物促进剂用于高盐环境下的生物脱氮体系的提高，可以有效解决高盐环境下生物脱氮难题，降低处理成本，具有良好的应用前景。

Description

一种生物促进剂及其用途

技术领域

本发明涉及环保微生物领域，特别是一种生物促进剂及其应用。

背景技术

在海产品加工、腌制品加工、化工、石油和养殖等行业中，外排含氮废水大多具有高盐的特点。比如金属精炼废水含有大量的硝酸盐氮、海产品加工废水普遍含有大量的蛋白质和氨氮。高盐废水一般是指总含盐质量分数至少1% 的废水，海水代用等众多的工业实践过程中，含盐量有时甚至高达15~30%，目前高盐废水产出途径和产量不断增加，废水水量以3％的年增长速率逐年增长，高含盐废水如果不能达标排放，则会污染地表、土壤、沿海和河口等，引发诸如富营养化等各种环境问题和生态问题。

高盐度对常规生物处理系统中微生物的正常代谢会产生不利的影响，主要包括：渗透压偏高，微生物细胞质壁分离，使生长受到阻碍甚至死亡；微生物代谢酶活性受阻；水体密度增加，影响污泥沉降效果等。因此普通生化处理对高盐含氮废水难以稳定运行，一直是污水处理的瓶颈。而很多企业利用清水稀释至0.8% 以下进行处理，这样不仅造成水资源的浪费，同时也增加处理设施及排污总量。因此，如何有效、经济地实现高含盐废水生物脱氮处理成为亟待解决的科学和工程难点问题，而实现有效、经济的高含盐废水生物脱氮的关键是找到高效嗜（耐）盐微生物。

嗜（耐）盐微生物的存在为高含盐废水生物脱氮处理提供新的思路，它是一类生活在高盐环境内的极端微生物，广泛存在于盐场、盐湖、土壤等高盐环境内。根据盐度生存范围（1~30%），嗜盐微生物分为耐盐菌、轻度嗜盐菌、中度嗜盐菌和极端嗜盐菌。这些嗜（耐）盐微生物在长期的进化过程中形成独特的高盐环境中生存的能力，具有极为特殊的生理结构和代谢机制。嗜盐微生物的细胞膜、细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性、反应动力学、酶系的性质、代谢途径及信息传递、蛋白质核酸成分及构象等方面为适应高盐环境而具有特异性。这些耐盐机制保证了嗜盐微生物在高盐环境内进行污染物质的去除。

为了能够在高盐环境下生产，嗜盐微生物在细胞结构和胞内组成上都有高盐适应机理。大多数嗜盐微生物采用相容性溶质机制进行渗透压调节。嗜盐微生物能够自行合成或从胞外直接吸收相容性溶质，从而抵御高渗透压环境得以生存，部分嗜盐菌在高盐环境中能够产生高浓度的相容性物质，调节渗透压，保护细胞功能。相容性溶质一般包括糖类、糖苷类、氨基酸类、甜菜碱类、四氢嘧啶类等，不同种的嗜盐菌胞内所含的相容性溶质不同，嗜盐菌在不同盐度产生的相容性物质也不同。

脱氮细菌在降解普通氨氮废水时表现出较高的脱氮效率，但是对于一些逆环境下（如高盐、高氨氮浓度等高渗环境或极端pH条件等）的氨氮废水的处理就会受到很大程度的限制，原因在于这些菌株对逆环境的抗性不足，高盐高氨氮等极端条件可抑制普通菌株的正常生长和增殖，造成菌体细胞及其相关代谢酶失活，并进一步导致脱氮能力降低甚至丧失。提高脱氮细菌的抗逆性对于废水脱氮处理工艺的广泛应用具有重要价值。抗逆协助原理是脱氮菌株在吸收相容性溶质后可获得抗逆性，从而提高其对逆环境下高浓度氨氮废水的降解效率。

南京农业大学姚倩倩（姚倩倩.高产四氢嘧啶菌株的分离及其发酵条件研究，南京农业大学2016年学术硕士学位论文）分离筛选出一株以四氢嘧啶为主要相容性溶质的中度嗜盐菌，初步鉴定为盐单胞菌属内的一个种。该菌株在较低盐条件下主要靠甜菜碱来维持细胞内外的渗透压平衡，而在高盐条件下主要依赖四氢嘧啶以抵御高渗透压的冲击。

大连海事大学李健（李健.一株中度嗜盐同步异氧硝化好氧反硝化脱氮性质研究，大连海事大学2016年工程硕士学位论文）分离出1株能够合成Ectoine、同时能够以同步硝化反硝化方式脱氮的菌株B02。菌株鉴定为Halomonas.sp菌株。该菌株能分泌四氢嘧啶，对活性污泥处理含高浓度氨氮垃圾渗滤液脱氮系统进行强化作用，与未添加该菌株的系统相比，垃圾渗滤液氨氮去除率提高了 15.65%，达98.74%，同时COD、浊度去除率也有提高。

现有技术关于嗜盐菌合成的生物促进剂报道较少，尤其是在＞15%盐度的条件下，能够对高盐废水脱氮具有促进效果的生物促进剂。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的不足，提供一种能够在高盐条件下促进生物脱氮的生物促进剂。

本发明的另一个问题是提供上述促进剂的应用，是为解决高盐条件下的生物脱氮问题，尤其是盐度≥15%条件下的生物脱氮问题。

本发明公开的生物促进剂，包含嗜盐鱼芽孢杆菌（Piscibacillus halophilus）LH-B.0015的发酵产物，还包含淀粉类、糖类、无机离子。

本发明的生物促进剂的重量本比如下：嗜盐鱼芽孢杆菌（Piscibacillus halophilus）LH-B.0015的发酵产物70-90份，淀粉类3-10份，糖类3-10份，无机离子2-5份。

本发明生物促进剂中，原料淀粉类可以为玉米淀粉、土豆淀粉、豆类淀粉等等，优选为玉米淀粉，原料糖类可以为葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖等，优选为蔗糖；原料无机离子可以硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙、碳酸钙、碳酸钠等，优选为选自硫酸镁和硫酸亚铁。

本发明的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015，根据其形态特征和生理生化特征及16SrRNA基因序列在Genbank中的检索结果，分类命名为Piscibacillus halophilus LH-B.0015。该菌株于2018年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16318。本发明的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的16SrRNA序列长度为1430bp。

本发明的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015能够在盐浓度1%-30%、pH6-11、温度15-45℃范围内生长，最适生长盐度为1%-25%，最适生长pH为7.0-8.5、最适生长温度为25-35℃。

本发明的嗜盐鱼芽孢杆菌（Piscibacillus halophilus）LH-B.0015的发酵产物，其发酵培养基碳源优选甘油、乙酸、丁酸、丙酸、乳酸、甲醇、甲胺、乙酸钠、檬酸三钠、丁二酸中的一种或几种。

本发明的嗜盐鱼芽孢杆菌（Piscibacillus halophilus）LH-B.0015的发酵培养最佳pH为6.5-8.5，发酵培养基盐度为1％～25％。

本发明嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵产物优选的制备方法是：

向培养基中接种嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015，在35℃下培养，培养过程中补充水分的散失，防止盐浓度的变化；培养48h后测定1%、10%、15%、20%、25%盐浓度条件下OD600值；培养物进行2-4次转接培养，每次转接后均培养48-72h；

将培养液接种到好氧发酵罐中，反复进行发酵培养，培养基不变；培养时间48-72h，培养温度为35℃、搅拌速度为100-120rpm，溶解氧为2.0～4.0mg/L，即得；

培养基为：甘油500mg/L、乙酸250mg/L、丁酸250mg/L、丙酸250mg/L、乳酸250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100～250g/L、苯酚100mg/L、苯胺50mg/L、乙酸钠250mg/L、檬酸三钠250mg/L、硫酸铵500mg/L，微量元素少量，pH为6.5～8.5。

本发明的生物促进剂，其可以应用在高盐废水的生物脱氮处理中。其中，所述的高盐废水的盐浓度优选为1％～25％。所述生物脱氮包括硝化、反硝化、同步硝化反硝化、异氧硝化好氧反硝化。

本发明生物促进剂，还可以应用于促进高盐废水的生物脱氮处理效果的促进剂。本发明的生物促进剂不仅在高盐条件下自身处理高氨氮废水，还可以利用自身抗逆协助功能协助其他菌株处理离氨氮废水，提高氨氮的去除效率。

与现有技术相比，本发明具有有益效果如下：

本发明的生物促进剂包含嗜盐鱼芽孢杆菌（Piscibacillus halophilus）LH-B.0015，该菌株能够分泌糖类、糖苷类、氨基酸类、甜菜碱类、四氢嘧啶类等相容性溶质，使菌株本身在高盐胁迫下仍能保持较高的脱氮能力，同时利用渗透压补偿溶质的抗逆协助原理提高脱氮细菌的耐盐性，使其他脱氮菌株能够在高盐胁迫下实现较高的脱氮效率。

嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的分泌产物与淀粉、糖、无机离子组合可以作为生物体内酶、核酸、细胞膜等的保护剂和稳定剂，协助微生物细胞抵抗极端环境，能够更进一步提高菌株在高盐环境下的脱氮效率，在1%-25%的盐度环境中促进生化系统硝化、反硝化脱氮、有机污染物的降解，在高盐废水处理，污染海水治理，盐碱地修复，消耗氮素营养，抑制藻类过度繁殖，净化水体，改良底质等方面有较好的应用效果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下列实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1，嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015分离与保藏

嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015是从海底底泥中分离得到。

配置NaCl浓度为20%的LB液体培养基，并加入甘油250mg/L、葡萄250mg/L、甲醇50mg/L，在30℃条件下对样品富集培养48h。利用YL固体培养基对富集培养液中的菌株进行分离。1L培养基中含有以下组分：葡萄糖：0.6g、柠檬酸三钠0.5g、甘油2mL、苯酚0.1g、苯胺0.05g、蛋白胨1.6g、磷酸氢二钾0.35g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸铵0.25g、氯化铵0.25g、MgSO40.5g、CaCl2 0.1g、NaCl 180g；微量元素液10mL，pH7.0-7.2；琼脂2.5%。

微量元素液(1000mL)：MnCl₂·7H₂O 0.03g，H₃BO₃ 0.03g，CoCl₂·6H₂O 0.20g，CuCl₂·6H₂O，NiCl₂·6H₂O 0.02g，Na₂Mo₄·2H₂O 0.03g

菌株LH-B.0015保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.16318。

实施例2，嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵产物的制备

（1）培养基：甘油500mg/L、乙酸250mg/L、丁酸250mg/L、丙酸250mg/L、乳酸250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100～250g/L、苯酚100mg/L、苯胺50mg/L、乙酸钠250mg/L、檬酸三钠250mg/L、硫酸铵500mg/L，微量元素少量，pH为6.5～8.5。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。

（2）上述培养基装入1L的三角瓶中，接种嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015后在35℃条件下培养，培养过程中补充水分的散失，防止盐浓度的变化。培养48h后测定1%、10%、15%、20%、25%盐浓度条件下OD600值。培养物进行两次转接培养，每次转接后均培养48h。

（3）将1L三角瓶中的培养液接种到20L的好氧发酵罐中，反复进行发酵培养，培养基不变。培养时间48h，培养温度为35℃、搅拌速度为100rpm，溶解氧为2.0～4.0mg/L。

通过以上发酵制备获得1%、10%、15%、20%、25%盐度的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵产物。

实施例3，生物促进剂的制备

取实施例2制得的1%、10%、15%、20%、25%盐度的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵产物70份（重量份，下同），分别加入玉米淀粉10份，蔗糖10份，硫酸镁5份，硫酸亚铁5份搅拌混匀后，在30-45℃温度下流化干燥后，得到生物促进剂分别为生物促进剂1、生物促进剂2、生物促进剂3、生物促进剂4、生物促进剂5。

取实施例2制得的1%、10%、15%、20%、25%盐度的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵产物80份，加入玉米淀粉10份，蔗糖6份，硫酸镁2份，硫酸亚铁2份搅拌混匀后，在30-45℃温度下流化干燥后，得到生物促进剂分别为生物促进剂6、生物促进剂7、生物促进剂8、生物促进剂9、生物促进剂10。

取实施例2制得的1%、10%、15%、20%、25%盐度的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵产物90份，加入玉米淀粉3份，蔗糖3份，硫酸镁2份，硫酸亚铁2份搅拌混匀后，在30-45℃温度下流化干燥后，得到生物促进剂分别为生物促进剂11、生物促进剂12、生物促进剂13、生物促进剂14、生物促进剂15。

实施例4，生物促进剂促进脱氮能力试验

取实施例3制得的生物促进剂各50g，加水300ml在115rpm，30℃下摇床复水24h。将复水后的促进剂分别加入氨氮50mg/L、COD300mg/L、盐度为1%、10%、15%、20%、25%的三角瓶中。三角瓶中加入等量常规活性污泥，以不加生物促进剂的活性污泥组作为对照，在恒温摇床上进行培养，温度为30～35℃；震荡速度为120ppm；分别于24h、48h后取样测定三角瓶中NH₄-N的浓度。试验结果如下表数据：

表1 生物促进剂促进NH₄-N去除的试验结果(单位：mg/L)

。

从上表可以看出，各种配方及不同盐度制备的生物促进剂与活性污泥法相比，脱氮能力显著提升，其中嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的酵产物含量越高，促进脱氮能力越高。

实施例5，生物促进剂对异氧硝化好氧反硝化菌株抗逆协助作用实验保藏的异氧硝化好氧反硝化菌--噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)LH-N40 CGMCC No. 6971，发明所涉及的菌株为噬氨副球菌LH-N40已于2012年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.6971；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

取保藏的异氧硝化好氧反硝化菌--噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)LH-N40 CGMCC No.6971在LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.2，121℃，20min 灭菌)中进行活化将活化好的菌液按10％接菌量转接到脱氮培养基(乙酸2000mg/L，氯化铵385mg/L(NH₄-N 100mg/L)，NaCl 10％，微量元素液10ml，加入缓冲液使pH为7.5～8.0)中，温度设置为30℃，在摇床转速为120rpm下培养。设置对照组及5个实验组。

取实施例3制得的生物促进剂2，按50 mg/L、100mg/L、150 mg/L、200mg/L、250 mg/L的量加入上述异氧硝化好氧反硝化实验组中。考察不同浓度生物促进剂对异氧硝化好氧反硝化菌脱氮的抗逆协助效果，试验结果如下表所示：

表2 不同浓度生物促进剂对菌株的脱氮作用效果

由上表可知，添加生物促进剂比不添加脱氮率提高了23%以上。说明生物促进剂对异氧硝化好氧反硝化菌--噬氨副球菌（Paracoccus aminovorans）LH-N40 CGMCC No. 6971脱氮起到显著的抗逆协助作用。

实施例6，生物促进剂对农药废水脱氮处理的强化促进作用实验

农药废水中含有大量的有毒有害物质，会对细菌的细胞代谢的产生影响，尤其是脱氮细菌，试验将生物促进剂添加进活性污泥农药废水处理体系中，考察生物促进剂对活性污泥的强化脱氮作用效果。

农药废水进水氨氮225mg/L，COD1800-2500mg/L，色度800，浊度2.1FTU，总盐5%，生化系统采用水解酸化-好氧-接触氧化工艺进行处理，停留时间56h，日常生化系统出水氨氮120-150mg/L，COD500-600mg/L，生化系统添加实施例3制得的生物促进剂2、生物促进剂3，按照1:1比例混合后稀释流加，添加量为100mg/L/d，稳定流加3d后，氨氮和COD出水浓度明显下降，流加到第7d后，出水氨氮10-15mg/L，出水COD90-100mg/L，稳定运行后，出水氨氮维持在5mg/L以下，COD维持在100mg/L以下出水色度200左右，出水浊度0.3 FTU。说明本发明生物促进剂对活性污泥的强化脱氮有较好的作用。

Claims (6)

1.一种生物促进剂，其特征在于：该生物促进剂包含保藏编号为CGMCC NO.16318的嗜盐鱼芽孢杆菌（Piscibacillus halophilus）LH-B.0015的发酵产物，还包含淀粉类、糖类和无机离子；

嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵产物所用的发酵培养基碳源选自甘油、乙酸、丁酸、丙酸、乳酸、甲醇、甲胺、乙酸钠、檬酸三钠、丁二酸中的一种或两种以上；

发酵培养时的pH为6.5-8.5；

嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵产物发酵时培养基盐度为1％～25％；

嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵产物的制备方法是：

向培养基中接种嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015，在35℃下培养，培养过程中补充水分的散失，防止盐浓度的变化；培养48h后测定1%、10%、15%、20%、25%盐浓度条件下OD600值；培养物进行2-4次转接培养，每次转接后均培养48-72h；

将培养液接种到好氧发酵罐中，反复进行发酵培养，培养基不变；培养时间48-72h，培养温度为35℃、搅拌速度为100-120rpm，溶解氧为2.0～4.0mg/L，即得。

2.根据权利要求1所述的生物促进剂，其特征在于，各原料的重量配比如下：

嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵产物70-90份；

淀粉类3-10份；

糖类3-10份；

无机离子2-5份。

3.根据权利要求1或2所述的生物促进剂，其特征在于，所述的培养基为：甘油500mg/L、乙酸250mg/L、丁酸250mg/L、丙酸250mg/L、乳酸250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100～250g/L、苯酚100mg/L、苯胺50mg/L、乙酸钠250mg/L、檬酸三钠250mg/L、硫酸铵500mg/L，微量元素少量，pH为6.5～8.5。

4.根据权利要求1或2所述的生物促进剂，其特征在于：淀粉类为玉米淀粉，糖类为蔗糖，无机离子选自硫酸镁和硫酸亚铁。

5.权利要求1或2所述的生物促进剂的用途，其特征在于：该用途为将生物促进剂应用在高盐废水的生物脱氮处理中；所述的高盐废水的盐浓度为1％～25％。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述生物脱氮选自硝化、反硝化、同步硝化反硝化、异氧硝化好氧反硝化。