CN114250165B - 嗜盐鱼芽孢杆菌lh-b.0015及其菌剂与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种嗜盐鱼芽孢杆菌（Piscibacillus halophilus）LH‑B.0015，其保藏号为CGMCC NO:16318。本发明还公开了一种微生物菌剂及其用途，该菌剂含嗜盐鱼芽孢杆菌LH‑B.0015。嗜盐鱼芽孢杆菌LH‑B.0015耐盐范围是1%‑30%，可以在盐度3%‑25%范围内可以进行硝化和反硝化。本发明的菌株及含本发明菌株的的微生物菌剂可用于高盐环境下的生物脱氮，高盐条件下污染物的降解、转化和生物脱氮过程，包括高盐废水处理，污染海水治理，盐碱地修复，消耗氮素营养，抑制藻类过度繁殖，净化水体，改良底质等。
Description
技术领域
本发明涉及环保微生物领域，特别是嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015、含嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的微生物菌剂及其应用。
背景技术
在海产品加工、腌制品加工、化工、石油和养殖等行业中，外排含氮废水大多具有高盐的特点。比如金属精炼废水含有大量的硝酸盐氮、海产品加工废水普遍含有大量的蛋白质和氨氮。高盐废水一般是指总含盐质量分数至少1% 的废水，海水代用等众多的工业实践过程中，含盐量有时甚至高达15~30%，目前高盐废水产出途径和产量不断增加，废水水量以3％的年增长速率逐年增长，高含盐废水如果不能达标排放，则会污染地表、土壤、沿海和河口等，引发诸如富营养化等各种环境问题和生态问题。
高盐度对常规生物处理系统中微生物的正常代谢会产生不利的影响，主要包括：渗透压偏高，微生物细胞质壁分离，使生长受到阻碍甚至死亡；微生物代谢酶活性受阻；水体密度增加，影响污泥沉降效果等。因此普通生化处理对高盐含氮废水难以稳定运行，一直是污水处理的瓶颈。而很多企业利用清水稀释至0.8% 以下进行处理，这样不仅造成水资源的浪费，同时也增加处理设施及排污总量。因此，如何有效、经济地实现高含盐废水生物脱氮处理成为亟待解决的科学和工程难点问题，而实现有效、经济的高含盐废水生物脱氮的关键是找到高效嗜（耐）盐微生物。
嗜（耐）盐微生物的存在为高含盐废水生物脱氮处理提供新的思路，它是一类生活在高盐环境内的极端微生物，广泛存在于盐场、盐湖、土壤等高盐环境内。根据盐度生存范围（1~30%），嗜盐微生物分为耐盐菌、轻度嗜盐菌、中度嗜盐菌和极端嗜盐菌。这些嗜（耐）盐微生物在长期的进化过程中形成独特的高盐环境中生存的能力，具有极为特殊的生理结构和代谢机制。嗜盐微生物的细胞膜、细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性、反应动力学、酶系的性质、代谢途径及信息传递、蛋白质核酸成分及构象等方面为适应高盐环境而具有特异性。这些耐盐机制保证了嗜盐微生物在高盐环境内进行新陈代谢和生长。
大连海事大学李健（李健.一株中度嗜盐菌同步异氧硝化好氧反硝化脱氮性质研究，大连海事大学2016年工程硕士学位论文）分离筛选出一株能够以SND方式脱氮的菌株BO2，鉴定为Halomonas菌株，最优脱氮NaCl浓度为60g/L（6%）、最适脱氮C/N为5、最适脱氮初始(NH4)2SO4浓度为500mg/L，168h脱氮率达99.37%。
青岛大学张培玉等人（张培玉、郭沙沙等.1株中度嗜盐硝化菌的鉴定及在高盐废水中的应用，《安全与环境学报》,2010,10（3）:13-17）分离出1株中度嗜盐异氧硝化菌gs2，鉴定为盐单胞菌属，该菌株能在NaCl质量分数为0-20%的培养基中生长，NaCl质量分数超过15%时，菌株生长受到明显抑制。该菌具有异氧硝化能力，同时还具有一定好氧反硝化能力，可实现同步硝化反硝化。
现有技术关于嗜盐菌的硝化反硝化能力报道较少，尤其是在盐度≥15%的条件下，能够实现同步硝化反硝化脱氮的菌。从环境中获取耐盐能力大于15%的嗜盐硝化反硝化是高盐废水生物脱氮需要解决的关键技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种能够在高盐条件下进行异氧硝化好氧反硝化的LH-B.0015菌株。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了一种微生物菌剂。
本发明的再一个问题是提供上述嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的应用及含嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015微生物菌剂的用途，以解决高盐条件下的生物脱氮问题，尤其是盐度≥15%条件下的生物脱氮问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现：
本发明公开的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015，根据其形态特征和生理生化特征及16SrRNA基因序列在Genbank中的检索结果，分类命名为Piscibacillus halophilus LH-B.0015。LH-B.0015的系统发育分析树见图1。该菌株于2018年8月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO:16318。本发明的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的16SrRNA序列长度为1430 bp，如序列表所示。
本发明的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015能够在盐浓度1%-30%、pH6-11、温度15-45℃范围内生长，最适生长盐度为1%-25%，最适生长pH为7.0-8.5、最适生长温度为25-35℃。
本发明所述的嗜盐鱼芽孢杆菌从海底底泥样品中分离获得，其生长以胺类、酚类等为碳源，以氨氮、凯氏氮为氮源，同时能够以NO3 -或NO2 -为电子受体生长。
本发明还公开了嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的用途，该用途为将嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015或者其发酵液作有效成份用于处理盐浓度1％～30％的高盐废水，尤其是用于高盐废水的生物脱氮处理。可以在异氧条件下对高盐废水进行硝化处理，或者在缺氧/好氧条件下对高盐废水进行反硝化处理。也可以对高盐废水进行同步异氧硝化缺氧/好氧反硝化处理。
还可以嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015或者其发酵液作有效成份用于高盐含氮废水处理、海水净化治理或者盐碱地治理。
本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有权利要求1所述的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的菌种发酵液。所述的微生物菌剂中嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的菌种发酵液的质量含量优选不低于10%。菌剂的制备方法可以采用现有技术中公开的常规菌剂的制备方法。
本发明所述的微生物菌剂可以在高盐废水处理中的应用。进一步优选对于盐度大于15%的高盐废水进行异氧硝化好氧反硝化。利用本发明菌株LH-B.0015制备的微生物菌剂，当以生物脱氮为主要目标进行应用时，该菌剂的最适耐盐浓度范围是3%-25%。当废水盐浓度为3%-25%，该菌剂可以NH4-N、NO3-N、NO2-N为电子受体，并且TN≤100mg/L、C/N≥5，且经过72h，NH4-N、NO3-N、NO2-N的去除率可以达到90%以上。
本发明所述的微生物菌剂中，所述的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的菌种发酵液的制法是：将培养基灭菌后，接种嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015，置于35℃，100-120rpm培养48-72h，所得培养液按10%的量转接至新鲜培养基中，反复转接2-4次，至培养液OD600＞1.5，即得嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的菌种发酵液；
培养基：甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100～250g/L、苯酚100mg/L、苯胺50mg/L、乙酸钠250mg/L、檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。
本发明与现有技术相比，有益效果如下：
本发明的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015耐受高渗透压及高盐环境，其耐盐范围是1%-30%，可在盐度3%-25%范围内以NH4-N、NO3-N、NO2-N为电子受体进行硝化、反硝化、同步硝化反硝化，硝化反硝化效率均大于90%。
利用LH-B.0015制备的微生物菌剂，耐受高渗透压及高盐环境，在高盐废水处理，污染海水治理，盐碱地修复，消耗氮素营养，抑制藻类过度繁殖，净化水体，改良底质等方面有较好的应用效果。
附图说明
图1是嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015与已知模式菌基于16SrRNA的最大简约法构建的系统发育树；
生物材料保藏信息：
LH-B.0015，分类命名为Piscibacillus halophilus，保藏日期为2018年8月20日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO:16318。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下列实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的分离与保藏
嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015是从海底底泥中分离得到。
配置NaCl浓度为20%的LB液体培养基，并加入甘油250mg/L、葡萄250mg/L、甲醇50mg/L，在30℃条件下对样品富集培养48h。利用YL固体培养基对富集培养液中的菌株进行分离。1L培养基中含有以下组分：葡萄糖：0.6g、柠檬酸三钠0.5g、甘油2mL、苯酚0.1g、苯胺0.05g、蛋白胨1.6g、磷酸氢二钾0.35g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸铵0.25g、氯化铵0.25g、MgSO40.5g、CaCl2 0.1g、NaCl 180g；微量元素液10mL，pH7.0-7.2；琼脂2.5%。
微量元素液(1000mL)：MnCl2·7H2O 0.03 g，H3BO3 0.03 g，CoCl2·6H2O 0.20 g，CuCl2·6H2O，NiCl2·6H2O 0.02 g，Na2Mo4·2H2O 0.03g
菌株LH-B.0015保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.16318，保藏日期为2018年8月20日。
实施例2，嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的发酵培养试验：
（1）培养基：甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100～250g/L、苯酚100mg/L、苯胺50mg/L、乙酸钠250mg/L、檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。
（2）上述培养基装入1L的三角瓶中，接种嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015后在35℃条件下培养，培养过程中补充水分的散失，防止盐浓度的变化。培养48h后测定1%、10%、15%、20%、25%盐浓度条件下OD600值，分别为1.79、1.63、1.62、1.65、1.61、1.66。培养物进行两次转接培养，每次转接后均培养48h，两次培养完成后OD600分别为2.59、2.55、2.58、2.61、2.59、2.60。
（3）将1L三角瓶中的培养液接种到20L的好氧发酵罐中，反复进行发酵培养，培养基不变。培养时间48h，培养温度为35℃、搅拌速度为100rpm，溶解氧为2.0～4.0mg/L。48h后发酵罐中菌液的OD600可达到2.5～3.1。
（4）检验：培养过程中使用显微镜每日取样观察，检查是否有杂菌混入生长；同时观察LH-B.0015的生长及形态变化情况。
（5）结果：试验结果表明，菌株LH-B.0015可以快速的进行发酵培养和放大，这表明LH-B.0015具有大规模工程应用的潜力。
实施例3，嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的耐盐能力试验
（1）培养基成分为甘油50mg/L、葡萄糖25mg/L、甲醇50mg/L、甲胺20mg/L、氯化钠250g/L，苯酚50mg/L、苯胺25mg/L、乙酸钠25mg/L，柠檬酸三钠25mg/L、酵母粉10mg/L、蛋白胨20mg/L、牛肉膏20mg/L，琼脂20g/L。
（2）使用新鲜的上述培养基活化菌种，培养3天至菌苔生长丰富备用。
（3）盐度梯度设置：根据LH-B.0015菌种的富集筛选条件，设置培养基的盐度梯度分别为0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、8%、10%、12%、15%、18%、21%、24%、26%、28%、30%、32%。
（4）制备固体培养基：根据设置的培养基配方制备培养基，盐度较高的培养基热水融化后灭菌，每瓶多加5ml的蒸发水，易挥发的培养基成分待灭菌后加入摇匀，待冷却至60℃左右，倒制平皿。
（5）接种培养：无菌条件下挑取一环新鲜菌苔接入各盐度培养基，由低盐度往高盐度梯度转接，35-37℃培养3-7天，观察菌种生长情况。
（6）试验结果：LH-B.0015菌种耐盐范围为0-30%。LH-B.0015菌株在1-30%盐度培养基中三天内可以明显观察到新长出的菌苔，但是在32％饱和盐度培养基中未长出菌苔。表明LH-B.0015在1%～30%的盐浓度范围内能够快速生长。
表1 LH-B.0015在不同盐浓度培养基上的生长情况
实施例4：嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的耐盐硝化能力试验
(1)培养基：乙酸2000mg/L，氯化铵385mg/L（NH4-N 100mg/L），NaCl 0％～30％，微量元素液10ml，加入缓冲液使pH为7.5～8.0。
(2)试验设计：硝化试验在10个500mL的三角瓶中进行，各加入培养基300mL，设置9个盐度梯度，盐含量分别为1%、3％、6％、10％、12％、15％、20％、25％、30％。
(3)硝化试验：所有样品灭菌后接种LH-B.0015培养液约10mL，在恒温摇床上进行培养，温度为30～35℃；震荡速度为120ppm；分别于24h、48h和72h后取样测定三角瓶中NH4-N的浓度。试验结果如下表数据：
表2 LH-B.0015在不同盐浓度下硝化去除NH4-N的试验结果(单位：mg/L)
实施例5：嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的耐盐反硝化能力试验
(1)培养基：乙酸2000mg/L、硝酸钾722mg/L（NO3-N 100mg/L），NaCl 0％～30％，微量元素液10ml，加入缓冲液使pH为7.5～8.0。
(2)试验设计：反硝化试验在10个500mL的三角瓶中进行，各加入培养基300mL，设置9个盐度梯度，盐含量分别为1%、3％、6％、10％、12％、15％、20％、25％、30％。
(3)反硝化试验：所有样品灭菌后接种LH-B.0015培养液约10mL，在恒温摇床上进行培养，温度为30～35℃；震荡速度为120ppm；分别于24h、48h和72h后取样测定三角瓶中NH4-N的浓度。试验结果如下表数据：
表3 LH-B.0015在不同盐浓度下硝化去除NO3-N的试验结果(单位：mg/L)
实施例6：嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的耐盐反硝化能力试验
(1)培养基：乙酸2000mg/L，亚硝酸钠515mg/L（NO2-N 100mg/L），NaCl 0％～30％，微量元素液10ml，加入缓冲液使pH为7.5～8.0。
(2)试验设计：反硝化试验在10个500mL的三角瓶中进行，各加入培养基300mL，设置9个盐度梯度，盐含量分别为1%、3％、6％、10％、12％、15％、20％、25％、30％。
(3)反硝化试验：所有样品灭菌后接种LH-B.0015培养液约10mL，在恒温摇床上进行培养，温度为30～35℃；震荡速度为120ppm；分别于24h、48h和72h后取样测定三角瓶中NH4-N的浓度。试验结果如下表数据：
表4 LH-B.0015在不同盐浓度下硝化去除NO2-N的试验结果(单位：mg/L)
实施例7：含嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的微生物菌剂的制备
利用实施例2所述培养基制备含嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的微生物菌剂。方法如下：液体培养基灭菌后，接种嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015，置于30℃，120rpm培养72h，培养液按10%的量转接至新鲜培养基中，反复转接3-4次，至培养液OD600＞1.5，培养液单独使用或与其他常规微生物体系混合，即获得含有嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的微生物菌剂。
实施例8：含嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的微生物菌剂在高盐含氮废水处理中的应用实验
利用实施例7制得的含有嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015微生物菌剂，处理COD1000mg/L，NH4-N 100mg/L，pH7.0-8.5，盐度分别为1%、3%、5%、8%、10%、15%、18%、20%、22%、25%的废水，30℃、72h后降解率如下表所示（单位%）：
由上表可知，含有嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015微生物菌剂能够在3%-25%盐度下降解有机物及氨氮，COD和氨氮的降解率均达到90%以上。含有嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015微生物菌剂能够同时进行硝化反硝化脱氮，从氨氮与总氮的脱除效率来看，在盐度3%-18%条件下，废水中几乎没有硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的积累，几乎完全实现了同步硝化反硝化，20%-25%盐度条件下，硝酸盐氮有少量的积累，延长培养时间后硝酸盐氮完全脱除，说明在盐度超过20%的条件下，需要延长处理时间。
实施例9：含嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的微生物菌剂在高盐含氮废水处理中的应用实验
将实施例7制得的微生物菌剂作为一级种子液进行扩大培养，通过6L二级种子培养后进行100L发酵培养获得微生物菌剂，培养条件同一级种子液培养。可根据需要将培养规模进行放大或批量培养。
将该菌剂用于处理COD2500，氨氮200mg/L，盐度10%的实际高盐废水，稳定运行后，COD平均去除率可达到92%以上，氨氮平均去除率95%以上，总氮平均去除率85%以上。
实施例10：含嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的微生物菌剂在港湾海水治理中的应用
三亚某港湾海水管理目标为3类水标准，但频繁出现无机氮污染物超标现象，超标率60%。采用现场中试试验，将实施例9制得的扩大培养后的含嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的微生物菌剂投加至海湾港湾海水中试装置中（投加量为水量的千分之三），装置运行5d后，无机氮含量开始明显下降，由1.0mg/L降至0.2mg/L，连续运行30d，无机氮始终小于0.4mg/L，未发生水质指标超标现象，出水稳定达到3类水标准。
序列表
<110> 中蓝连海设计研究院有限公司
<120> 嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015及其菌剂与用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1430
<212> DNA
<213> Piscibacillus halophilus
<400> 1
ctgggggtgc tatacatgca agtcgagcgc gggaagcaaa ctgaatcctt cgggaggacg 60
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Claims (7)
1.一种嗜盐鱼芽孢杆菌（Piscibacillushalophilus）LH-B.0015，其特征在于：其保藏号为CGMCC NO:16318。
2.权利要求1所述的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B .0015的用途，其特征在于：该用途为将嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015或者其发酵液作有效成份用于处理盐浓度1％～30％的高盐废水的生物脱氮处理。
3.权利要求2所述的用途，其特征在于：该用途为将嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B .0015或者其发酵液作有效成份用于高盐含氮废水处理、海水净化治理或者盐碱地治理中的生物脱氮处理。
4.一种微生物菌剂，其特征在于：该微生物菌剂含有权利要求1所述的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的菌种发酵液。
5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂中嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的菌种发酵液的质量含量不低于10%。
6.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B .0015的菌种发酵液的制法是：将培养基灭菌后，接种嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015，置于35℃,100-120rpm培养48-72h，所得培养液按10%的量转接至新鲜培养基中，反复转接2-4次，至培养液OD600＞1.5，即得嗜盐鱼芽孢杆菌LH-B.0015的菌种发酵液；
培养基为：甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100~250g/L、苯酚100mg/L、苯胺50mg/L、乙酸钠250mg/L、檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。
7.权利要求5或6所述的微生物菌剂用途，其特征在于，所述的用途为微生物菌剂在盐度3%-25%的高盐废水中的生物脱氮处理。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN109456926A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-12 | 中蓝连海设计研究院有限公司 | 一种含嗜盐反硝化菌yl5-2的微生物菌剂及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 天漠嗜盐和耐盐细菌产淀粉酶活性及菌株多样性;杨玉婷;吴秋蕾;张俊;张丽;贺建武;刘祝祥;陈义光;;吉首大学学报(自然科学版)(第04期);全文 * |
| 芽胞杆菌属及其近缘属种名目录;刘波;王阶平;陶天申;喻子牛;;福建农业学报(第01期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114250165A (zh) | 2022-03-29 |
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