CN112957377B - 一种微生物生态系统微凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种微生物生态系统微凝胶及其制备方法。所述微凝胶包括微生物生态系统微凝胶内核及高分子外壳，微凝胶内核包埋了多种活细菌群体；活细菌群体选自能将尿素、肌酐代谢为氨，或能将氨转化为氨基酸的细菌。本发明将多种活细菌群体通过固定化包埋喷雾干燥法获得微凝胶内核，再与高分子外壳共孵育获得微凝胶。本发明提供的微凝胶包埋了多种功能的活细菌群体，能够克服竞争生长抑制和难以实现肠道共定殖等问题，可以用于精确合理的调控多种肠道菌群，使之在肠道形成可代谢含氮废物的人造微生态系统，可以安全、高效、无创地运用于肾病的治疗，具有重大社会和经济意义。

Description

一种微生物生态系统微凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种微生物生态系统微凝胶及其制备方法。
背景技术
随着人口老龄化和糖尿病患病几率的增加，肾病患者的数量每年还在不断上升。肾脏的衰竭会导致机体代谢功能异常，伴随有毒废物的积累，包括尿素、肌酐、吲哚衍生物和三甲胺氧化物等，这种积累进一步加剧了肾脏的损害。当肾病患者的病情进展到一定程度，就需要进行长期的血液透析治疗来暂时性的缓解肾脏的工作压力。尽管透析治疗在清除非蛋白结合的尿毒症溶质方面效率很高，但频繁的透析不仅让患者承担了高昂的治疗费用，还伴有多种致命的不良反应。因此，亟待开发临床治疗效果好，更经济实惠的肾病治疗新策略和新技术。近年来，随着对微生物组研究的不断深入，科研工作者们发现肠道菌群失调与人体多种疾病息息相关，且有大量的实验和临床数据表明，微生物在维持肠道代谢平衡、减缓肾衰竭进展中起着重要作用。因此，合理调控肠道菌群和肠道微生态系统有望成为一种简便高效的非侵入式治疗肾病的全新策略，是肾病治疗领域的重大突破。但是，截止目前国内外尚未有与此新策略相关的专利发布，在这一领域仍是一片空白。
肠道黏膜作为人体最大的半透结构，允许血液和肠道之间的代谢物交换。因此，宿主和肠道微生物及肠道菌群对食物代谢产生的毒素，也是肾病患者体内有毒废物的主要来源之一。基于肠道菌群调控策略，若能实现特殊功能细菌以各种有害的含氮废物为自身氮源进行代谢，即可通过消耗肠道含氮废物的创新策略，实现减轻肾脏负担、缓解肾病的目的。根据近年来发表的研究文献，有临床数据表明干酪乳杆菌可在一定程度上降低肾病患者的血吲哚酚葡萄糖醛酸酯和c反应蛋白等，能使血尿素降低11％，并因此缓解了患者的疾病症状。还有研究表明，同时给予肾衰竭患者嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、长双歧杆菌治疗后，患者的血尿素及尿酸含量有所下降，生活质量得以提升。
但是，目前肾病微生物疗法难以实施的瓶颈和关键技术难点在于，单一细菌疗法效果不明显，多种细菌联合治疗存在竞争生长抑制和难以实现肠道共定殖等问题。这些问题的存在使调控菌群肾病治疗策略举步维艰。
因此，如何精确合理的调控多种肠道菌群，使之在肠道形成可代谢含氮废物的人造微生态系统，并以此开发一种安全、高效、无创治疗肾病的产品，是目前亟需解决的难题，具有重大社会和经济意义。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种微生物生态系统微凝胶及其制备方法，用以解决上述现有技术中的问题。
本发明的技术方案如下：
一种微生物生态系统微凝胶，包括微生物生态系统微凝胶内核、高分子外壳，其特征在于，所述微凝胶内核包埋了多种活细菌群体；所述活细菌群体为能将尿素、肌酐代谢为氨，或能将氨转化为氨基酸的细菌。
根据本发明的实施例，所述活细菌群体为细菌混合物，选自芽孢杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属中一种或多种。
根据本发明的实施例，所述微凝胶为海藻酸钙微凝胶。
根据本发明的实施例，所述高分子外壳为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚醚酰亚胺、羧甲基纤维素的一种或多种。
根据本发明的实施例，本发明所述微生物生态系统微凝胶还包括用于保护微凝胶中细菌存活的冻干保护剂。优选地，所述冻干保护剂为葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、半乳糖、脱脂奶粉、甘油的一种或多种。
本发明的另一个目的在于，提供一种微生物生态系统微凝胶的制备方法，将多种活细菌群体通过固定化包埋喷雾法获得微凝胶内核，再与高分子外壳共孵育获得微凝胶；所述活细菌群体为能将尿素、肌酐代谢为氨，或能将氨转化为氨基酸的细菌。
进一步地，所述微凝胶内核制备步骤包括：
1)培养功能细菌，离心收集菌体沉淀、分散后得菌体悬液；
2)将菌体悬液与海藻酸钠溶液混合均匀；
3)将混合液喷入氯化钙溶液中，得到微凝胶内核。
进一步地，所述微凝胶的制备过程为，将所述微凝胶内核与高分子搅拌孵育，调节pH至5-7，将高分子包覆在微凝胶内核表面，得到微生物生态系统微凝胶；所述高分子为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚醚酰亚胺、羧甲基纤维素的一种或多种。
本发明还提出一种微生物生态系统微凝胶冻干粉，按本发明以上所述方法制备得到的微凝胶与冻干保护剂以1:5-10v/v的比例混合均匀，冷冻干燥得到微生物生态系统微凝胶冻干粉。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明提供的微凝胶包埋了多种功能的活细菌群体，能够克服竞争生长抑制和难以实现肠道共定殖等问题，可以用于精确合理的调控多种肠道菌群，使之在肠道形成可代谢含氮废物的人造微生态系统，可以安全、高效、无创地运用于肾病的治疗，具有重大社会和经济意义。
2.本发明通过连续制备的固定化包埋喷雾干燥技术，制备了一种可以包裹多菌的微凝胶制剂。该技术的依托原理是通过海藻盐临近聚合物链上的两个羧基基团与钙离子作用形成离子桥或通过每一对聚合物链上的羟基和羧基基团同钙离子发生螯合作用而形成的。制备方法简便且高效，对设备要求低。
3.本发明所用的特定功能细菌，能够实现先将尿素和肌酐降解为氨，再将氨转化为氨基酸的级联代谢作用，更高效地将肠道内的有毒的含氮废物代谢成无害的氨基酸。本发明所提供的方法可以进行任意细菌的替换，从而实现定制化的个性治疗。
4.本发明用高分子作为外壳材料具有良好的粘附性，可以粘附在海藻酸钙微球表面形成微凝胶外壳。该微凝胶外壳是一种选择透过性纳米膜材料，仅允许小分子含氮废物进出，使微凝胶包裹的细菌仅以肠道内小分子的含氮废物作为自身氮源。高分子外壳材料还具有可生物降解、生物相容性优异、安全无毒副作用等特点。
5.本发明所用的冻干保护剂在长时间保持上述特定功能细菌活力的同时，还赋予上述微凝胶较高的粘性，以便制备成丸剂或片剂。
附图说明
图1为本发明微生物生态系统微凝胶的工作原理图。
图2为本发明细菌对尿素、肌酐和氨的代谢效果图。
图3为本发明微生物生态系统微凝胶中三种细菌的生存情况图。
图4为本发明冻干保护剂以及储存条件对微凝胶中细菌的活力影响图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明提供一种微生物生态系统微凝胶，该微凝胶的制备采用连续制备的固定化包埋喷雾干燥技术，包括微生物生态系统微凝胶内核和高分子外壳。所述的微生物生态系统微凝胶能够将尿素和肌酐级联代谢为氨基酸，并且通过对肠道菌群的调控，可实现非侵入式治疗肾病。
优选的，所述的微生物生态系统微凝胶内核是由能够代谢肠道含氮废物的特定功能细菌和固化并保护细菌的海藻酸钙微球组成，从而高效地将肠道内有毒的含氮废物代谢成无害的氨基酸。
优选的，所述的能够代谢肠道含氮废物的特定功能细菌包含能将尿素或肌酐代谢为氨的细菌，以及能将氨转化为氨基酸的细菌。
优选的，所述的特定功能细菌，包含芽孢杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属的一种或多种，包含来自相同菌属不同菌种的组合。
优选的，所述的固化并保护细菌的海藻酸钙微球，其特征在于，以1％-5％的海藻酸钠作为固定化载体，0.5％-3％的氯化钙作为固定液，采用一步连续制备的固定化包埋技术制备而成。
按上述方案，优选的，所述的微生物生态系统微凝胶内核采用一步连续制备的固定化包埋技术制备而成，具体包括以下步骤：
1)液体培养基中培养上述特定功能细菌，然后将细菌悬液离心，收集菌体沉淀并用磷酸缓冲液(PBS)重新分散得菌体悬液。
2)将108-109CFU/mL的上述菌体悬液和1-5％的海藻酸钠溶液以1:5-10(v/v)的比例混合均匀。
3)将步骤2)得到的混合液以1:5-20(v/v)的比例直接喷入0.5-3％的氯化钙溶液中，得到所述的微生物生态系统微凝胶内核。
优选的，所述的高分子外壳是一种选择透过性纳米膜材料，通过纳米膜的间隙，小分子化合物可以自由进出。所以对小分子的含氮废物具有选择透过性，可避免上述微生物生态系统微凝胶的特定功能细菌对大分子含氮化学物质的过度消耗。
优选的，所述的高分子化合物为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚醚酰亚胺、羧甲基纤维素的一种或多种。
所述的非侵入式治疗肾病的微生物生态系统微凝胶及其制备方法，采用连续制备的固定化包埋喷雾干燥技术，主要包括以下步骤：
1)液体培养基中培养上述特定功能细菌，然后将菌液离心，收集菌体沉淀并用PBS重新分散得菌体悬液。
2)将108-109CFU/mL的上述菌体悬液和1％-5％的海藻酸盐溶液以1:5-10(v/v)的比例混合均匀。
3)将步骤2)得到的混合液以1:5-20(v/v)的比例直接喷入0.5-3％的氯化钙溶液中，即可实现对细菌的固化包埋，得到上述的微生物生态系统微凝胶内核。
4)将1-5份微生物生态系统微凝胶内核用PBS溶液重悬后加入1-5份高分子化合物，在pH为7-10的条件下共孵育10-30min，再用盐酸调节pH为5-7，将高分子化合物包覆在微球表面形成外壳层，离心浓缩得到微凝胶主体。
以下是结合附图和具体原材料给出的实验实施例。
以下实施例中所用的复杂液体培养基的配方为：5.0g大豆蛋白胨，5.0g胰胨，10.0g酵母提取物，10.0g葡萄糖，40.0mL盐溶液，0.5g L-半胱氨酸，1.0mL 0.1％的刃天青，1000mL蒸馏水。其中盐溶液的配制为：0.2g CaCl2，0.48g MgSO4·7H2O，1.0g K2HPO4，1.0gKH2PO4，10.0g NaHCO3，2.0g NaCl，1000mL蒸馏水。
实施例1.特定功能细菌的培养
具体步骤如下：
将活化的菌株1(双歧杆菌属)接种到含有约21.4mmol/L尿素的复杂液体培养基中，于37℃、厌氧条件下培养24h后，将菌液离心，取上清培养液，用尿素试剂盒检测培养细菌前后培养基中尿素的含量，分别表示为空白1组和细菌1组。如图2A所示，培养菌株1后培养基中的尿素含量显著性下降，证明菌株1有优异的代谢尿素的能力。
将活化的菌株2(乳杆菌属)接种到含有约707μmol/L肌酐的复杂液体培养基中，于37℃、厌氧条件下培养24h后，将菌液离心，取上清培养液，用肌酐试剂盒检测培养细菌前后培养基中肌酐的含量，分别表示为空白2组和细菌2组。如图2B所示，培养菌株2后的培养基中的肌酐含量显著性下降，证明菌株2有优异的代谢尿素的能力。
将活化的菌株3(乳杆菌属)接种到含有约360μmol/L氯化铵的复杂液体培养基中，于37℃、厌氧条件下培养24h后，将菌液离心，取上清培养液，用血氨试剂盒检测培养细菌前后培养基中氨的含量，分别表示为空白3组和细菌3组。如图2C图所示，培养菌株3后的培养基中的氨含量显著性下降，证明菌株3有优异的代谢氨的能力。
实施例2.微生物生态系统微凝胶的制备
制备方法具体步骤如下：
在37℃、厌氧条件下，将菌株1、菌株2、菌株3分别在复杂液体培养基中培养48h后，离心收集菌体沉淀并用PBS重新分散得菌体悬液。
将菌株1、2、3的菌体悬液按照一定比例(3:3:4)混匀，之后将菌数总量为108-109CFU/mL的菌体悬液与1％的海藻酸钠溶液以1：9(v/v)的比例混匀得到混合溶液A。
采用连续制备的固定化包埋喷雾干燥技术制备微生物生态系统微凝胶，具体操作是：将20mL混合溶液A以雾状形式加入到100mL 1％的氯化钙溶液中，得到海藻酸钙微球悬浊液。将悬浊液过滤，收集微球并用无菌水洗涤后重新悬浮于20mL PBS溶液中得到混合溶液B，而过滤后母液为溶液C。混合溶液B与0.1mg/mL的聚乙烯醇在pH＝8.5下共孵育10min，用盐酸调节pH＝6，离心浓缩得到微生物生态系统微凝胶。将溶液C离心浓缩到20mL得到未被海藻酸钙微球包裹的自由混菌溶液。
分别将1mL的微生物生态系统微凝胶、1mL自由混菌溶液在含有21.4mmol/L尿素、707μmol/L肌酐以及360μmol/L氯化铵的复杂液体培养基中，于37℃的厌氧条件下培养24h，然后用血氨试剂盒检测培养前后培养基中的氨含量。如图3A所示，相比于自由混菌，微生物生态系统微凝胶对氨的代谢能力明显提升。采用稀释涂布平板计数法，对比微生物生态系统微凝胶的三种细菌菌落数，如图3B所示，将三种菌株混合培养时，三种菌株的菌落数的相对比例变化趋势相当，说明三种菌株在微生物生态系统微凝胶内核的生存能力相当，即微球包裹的菌群呈现共生的生长趋势。
实施例3.
以菌株1作为模式菌株，微凝胶的冷冻干燥以及储存条件，具体操作如下：
在37℃、厌氧条件下，将菌株1在复杂液体培养基中培养48h后，离心收集菌体沉淀并用PBS重新分散得菌体悬液。将活菌数总量为108-109CFU/mL的菌体悬液与1％的海藻酸钠溶液以1：9(v/v)的比例混匀得到混合溶液A。采用连续制备的固定化包埋喷雾干燥技术制备微凝胶，具体操作是：将20mL混合溶液A以雾状形式加入到100mL 1％的氯化钙溶液中，得到海藻酸钙微球悬浊液。将悬浊液过滤，收集微球并用无菌水洗涤后重新悬浮于20mL PBS溶液中得到混合溶液B。混合溶液B与0.1mg/mL的聚乙烯醇在pH＝8.5下共孵育10min，用盐酸调节pH＝6，离心浓缩得到微凝胶。
微凝胶分别与冻干保护剂1(海藻糖8％，乳糖8％，VC 0.2％，甘油3％)、冻干保护剂2(海藻糖10％，甘油5％)、冻干保护剂3(葡萄糖10％)以1:5(v/v)的比例混合均匀。然后真空冷冻干燥12h分别得到微凝胶冻干粉1、2、3。之后采用稀释涂布平板计数法，对比未冻干时的微凝胶、微凝胶冻干粉1、2、3复溶1h后的活菌数。如图4A所示，微凝胶冻干粉1、2、3中的活菌数相比于未冻干的微凝胶，细菌的存活率分别为85％、61％、43％。即在相同的条件的条件下，不同的冻干保护剂对细菌的保护能力会有较大差异。
将微凝胶冻干粉1分别在4℃、-20℃条件下保存3d、7d、15d、30d。将保存的冻干粉用PBS溶液复溶后，采用稀释涂布平板计数法，探索冻干粉在各条件下的活菌数情况。如图4B所示，30d内，保存的冻干粉中活菌数没有显著性差异，但是-20℃下保存的活菌数优于4℃下保存的活菌数。因此，在-20℃下，本实施例中的微凝胶至少可以储存一个月以上。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和描述的实施例。

Claims (6)

1.一种微生物生态系统微凝胶，包括微生物生态系统微凝胶内核和高分子外壳，所述微凝胶的制备过程包括:1）培养功能细菌，离心收集菌体沉淀、分散后得菌体悬液；2）将菌体悬液与海藻酸钠溶液混合均匀；3）将混合液喷入氯化钙溶液中，得到微凝胶内核；4）将所述微凝胶内核与高分子搅拌孵育，调节pH至5-7，将高分子包覆在微凝胶内核表面，得到微生物生态系统微凝胶，所述高分子为聚乙烯醇；所述微凝胶内核包埋了多种活细菌群体，所述活细菌群体为能将尿素、肌酐代谢为氨，和能将氨转化为氨基酸的细菌；所述活细菌群体为细菌混合物，选自芽孢杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属中一种或多种。
2.根据权利要求1所述的微生物生态系统微凝胶，其特征在于，所述微凝胶为海藻酸钙微凝胶。
3.根据权利要求1所述的微生物生态系统微凝胶，其特征在于，还包括用于保护微凝胶中细菌存活的冻干保护剂。
4.根据权利要求3所述的微生物生态系统微凝胶，其特征在于，所述冻干保护剂为葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、半乳糖、脱脂奶粉、甘油的一种或多种。
5.一种微生物生态系统微凝胶的制备方法，其特征在于，所述微凝胶的制备过程包括:1）培养功能细菌，离心收集菌体沉淀、分散后得菌体悬液；2）将菌体悬液与海藻酸钠溶液混合均匀；3）将混合液喷入氯化钙溶液中，得到微凝胶内核；4）将所述微凝胶内核与高分子搅拌孵育，调节pH至5-7，将高分子包覆在微凝胶内核表面，得到微生物生态系统微凝胶，所述高分子为聚乙烯醇；所述微凝胶内核包埋了多种活细菌群体，所述活细菌群体为能将尿素、肌酐代谢为氨，和能将氨转化为氨基酸的细菌；所述活细菌群体为细菌混合物，选自芽孢杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属中一种或多种，其中多种活细菌群体通过固定化包埋喷雾法获得微凝胶内核。
6.一种微生物生态系统微凝胶冻干粉，其特征在于，按权利要求5所述方法制备得到的微凝胶与冻干保护剂以1:5-10v/v的比例混合均匀，冷冻干燥得到。
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