CN102228235A - 一种益生菌微胶囊的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种益生菌微胶囊的制备方法及其应用，属于食品生物技术领域。本发明采用将海藻酸钠溶液与变性淀粉溶液等体积混合，再与益生菌混合，通过喷雾器喷嘴喷入CaCl₂溶液中，静置固化后生理盐水洗涤过滤，进行干燥获得微胶囊。本发明显著提高了益生菌抵抗人体极端环境能力，并最终起到保健益生的作用，为益生菌微胶囊化提供新的技术思路。

Description

一种益生菌微胶囊的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种益生菌微胶囊的制备方法及其应用，属于食品生物技术领域。 

背景技术

益生菌可显著改善宿主肠道微生态平衡，起到预防腹，泻、缓解乳糖不耐症、增强免疫力、降低血清胆固醇以及抑制肿瘤细胞前体物质形成等多种生理功效。但是，由于活菌制剂进入动物消化道后难以经受胃酸、胆盐、消化酶等的作用，因此难以保证足够的活菌数量到达肠道或定殖肠道而发挥作用。 

采用微胶囊技术制备的益生菌应用于微生态制剂后，能够较好保持菌体细胞活性并极大程度地提高益生菌口服时的活性菌靶向定殖，对人体、动物的益生作用更加明显。同时，微胶囊态能够显著增加益生菌产品的贮藏时间以及对人体极端胃肠道环境的耐受性，因此众多乳制品企业已着手发展微胶囊益生菌以增加乳制品的益生功效。 

微胶囊技术的发展带动了微胶囊制备方法的不断探索，目前国内常用的微胶囊制备方法如下：喷雾干燥法、喷雾凝胶法、流化床包埋空气悬浮法、乳化法、挤压法、共凝聚/相分离法和静电法等。相比较而言，喷雾干燥温度过高，挤压法制备时微胶囊形成速度慢，批次间不稳定，并不适于大规模应用，乳化过程过高的剪切力也会对乳酸菌细胞产生伤害。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种益生菌微胶囊的制备方法。 

为解决上述技术问题，提供如下技术方案：将海藻酸钠溶液与变性淀粉溶液等体积混合，再与益生菌混合，通过喷雾器喷嘴喷入CaCl₂溶液中，静置固化后生理盐水洗涤过滤，进行干燥获得微胶囊。 

具体方法如下： 

1)浓度为1-5％的海藻酸钠溶液与浓度为1-5％的变性淀粉溶液按等体积混合； 

2)将离心洗涤后的益生菌与步骤1)得到的混合液混合，混合后益生菌浓度为10⁸-10¹⁰cfu/mL； 

3)将步骤2)得到的混合液通过喷雾器喷嘴喷入浓度为2％-5％CaCl₂溶液； 

4)静置固化后用生理盐水洗涤，进行干燥获得微胶囊。 

所述益生菌为：干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、乳链球菌、婴儿双歧杆菌、短乳杆菌、短双歧杆菌、乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌、瑞士乳杆菌。 

所述益生菌培养方法为：将保藏在-70℃冰箱的液体甘油管中的菌种以无菌操作方式按5％接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养20-30h，其后将细胞离心10min(10000r/min，10℃)，弃去上清液，生理盐水冲洗沉淀，获得纯净菌体。 

所述干燥方法如下：将不同微胶囊分别放入冻干瓶，放入-70℃超低温冰箱冷冻过夜以保证形成小的冻晶和冻结完全。第二天放入真空冷冻干燥机：开启压缩机等制冷装置，将样品温度降至-60℃，开启真空泵及加热系统，真空度50mTorr(约6.67Pa)的条件下冻干30h，关机停止冻干。 

所述微胶囊性能检测包括以下几项： 

1.微胶囊的外观表征 

利用生物显微镜和扫描电镜对微胶囊产品的外观进行表征。通过光学显微镜初步观察微胶囊的外观等形态，再通过电子显微镜观察微胶囊形态。取少量冻干微囊悬浮于蒸馏水中，用吸管吸取少量滴在铝箔上，使其在铝箔上均匀摊开，自然晾干。剪下小块铝箔用导电胶固定在样品台上，真空条件下喷金处理后，用扫描电子显微镜观察微囊的形态。 

2.微胶囊的包埋率测定 

喷雾凝胶后的微胶囊经过生理盐水(0.85％NaCl，w/v)洗涤后，取10μL重悬液，以不同的稀释度点种于MRS培养基平板上测定单位体积菌落数(colony forming unit，cfu)。将平板放置在37℃下厌氧培养30h，对平板上的菌落进行计数。 

包埋率(％)＝(V1-V2)×100％/V1 

V1——包埋前的活菌数(1mL液体样的活菌数，cfu/mL) 

V2——包埋后微胶囊外的活菌数(1mL液体样的活菌数，cfu/mL) 

设三个平行样。用Excel软件计算平均值和标准偏差。计算存活率时，考虑了误差的传递。 

3.微胶囊的粒径表征 

将冻干的微囊在蒸馏水中分散，采用激光粒度仪Coulter LS 230测粒径分布，以CV值(Coefficient of Variation)描述体积平均粒径分布： 

$\mathrm{CV}={[\mathrm{\Σ}{(d_i-\stackrel{\‾}{d})}^2/N]}^{\frac{1}{2}}/\stackrel{\‾}{d}$

其中di为单个微囊的粒径，为体积平均粒径，N为微囊总数。 

4.微胶囊的耐酸性测定 

取适量微胶囊(约10⁹cfu/mL)置于盛有10mL，pH 1.2模拟人体胃液的安培瓶中，处于垂直混合仪以37±1℃，180r/min的速度处理0，1，2，3h，取样后采用平板菌落计数法检测样品中活菌数。通过活菌数变化分析人体胃液中微胶囊的释放情况。按中国药典2005版第二部配制模拟人体胃液：取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释至100mL，即得。 

5.微胶囊的肠溶性测定 

取适量微胶囊(约1.1×10⁹cfu/mL)置于盛有10mL，pH 6.8人体肠液的安培瓶中，处于垂直混合仪以37±1℃，180r/min的速度处理0，15，30，45，60min，取样后采用平板菌落计数法检测样品中活菌数。通过活菌数变化分析人体肠液中微胶囊的释放情况。按中国药典2005版第二部配制模拟人体肠液：取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，取胰蛋白酶10g，加水溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL即得。 

本发明的有益效果： 

1)由于变性淀粉具有抑制肠道有害菌生长，并为益生菌提供碳源物质等作用，能够提高益生菌在人体胃肠道极端条件下的存活能力和生物活性； 

2)喷雾凝胶法，因其过程温和、条件易控，适合工业放大，具有应用于实际生产的潜力； 

3)本发明提供的方法，简单易行，对操作人员专业素质要求低； 

4)本发明制备的微胶囊粒径较小，特别适合有特殊要求的人群使用。 

具体实施方式

实施例1：干酪乳杆菌及其应用 

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCTCC NO：M 2010163，该菌株具有较高的藻毒素清除效率，又可高效地清除胆固醇。将该菌株用于保健食品领域，具有可抑制有害微生物生长、提高人体免疫力、协助营养消化等诸多方面的功效，详见专利申请201010238658.8。 

以CCTCC NO：M 2010163为出发菌株，将其在种子培养基中培养至对数生长期后，离心洗涤获得纯净菌株后与制备好的无菌海藻酸钠(2％，w/v)溶液与变性淀粉(2％，w/v)按等体积充分混合，混合后益生菌浓度为10⁹cfu/mL。混合液通过喷雾器喷嘴喷入CaCl₂(3％，w/v)溶液中，Ca²⁺与海藻酸钠交联反应形成微胶囊。静止固化120min后生理盐水洗涤三次过滤，进行干燥获得微胶囊。 

获得微胶囊后，检测如下指标： 

a)外观表征：通过扫描电子显微镜观察，发现微胶囊表面平滑，能够直接看到乳杆菌被包埋进如微胶囊内部； 

b)包埋率测定：根据专利所述包埋率测定方法测定包埋率，结果为97.30％； 

c)微胶囊的粒径表征：根据专利所述粒径测定方法测定微胶囊粒径，其粒径分布值为1.149； 

d)微胶囊的耐酸性测定：根据专利所述微胶囊的耐酸性测定方法测定微胶囊的耐酸性，经过包埋的干酪乳杆菌在模拟人体胃液条件中3h后，仅有20.56％的微胶囊出现破裂，包埋在微胶囊内部的活菌数仍可达到10⁹cfu/mL； 

e)微胶囊的肠溶性测定：根据所述微胶囊的肠溶性测定方法测定微胶囊的肠溶性，将在模拟人体胃液条件下3h后的微胶囊取出生理盐水洗涤两次后转移进入模拟人体肠液检测其肠溶性。随着在模拟人体肠液中的处理，微胶囊逐渐破裂，破裂速度呈现先迅速上升再趋于平缓的趋势，60min后基本完全释放其内的乳杆菌，达到88.89％，即仍然可以维持在 10⁹cfu/mL，达到肠道益生菌发挥益生作用的要求。 

实施例2： 

以CCTCC NO：M 2010163为出发菌株，将其在种子培养基中培养至对数生长期后，离心洗涤获得纯净菌株后与制备好的无菌海藻酸钠(1％，w/v)溶液与变性淀粉(1％，w/v)按等体积充分混合，混合后益生菌浓度为10⁸cfu/mL。混合液通过喷雾器喷嘴喷入CaCl₂(1％，w/v)溶液中，Ca²⁺与海藻酸钠交联反应形成微胶囊。静止固化120min后生理盐水洗涤三次过滤，进行干燥获得微胶囊。 

检测指标 

a)外观表征：通过扫描电子显微镜观察，发现微胶囊形态完整，菌体存活与微胶囊内部； 

b)包埋率测定：根据专利所述包埋率测定方法测定包埋率，结果为93.90％； 

c)微胶囊的粒径表征：根据专利所述粒径测定方法测定微胶囊粒径，其粒径分布值为1.533； 

d)微胶囊的耐酸性测定：根据专利所述微胶囊的耐酸性测定方法测定微胶囊的耐酸性，经过包埋的干酪乳杆菌在模拟人体胃液条件中3h后，仅有22.68％的微胶囊出现破裂，包埋在微胶囊内部的活菌数仍可达到10⁸cfu/mL； 

e)微胶囊的肠溶性测定：根据所述微胶囊的肠溶性测定方法测定微胶囊的肠溶性，将在模拟人体胃液条件下3h后的微胶囊取出生理盐水洗涤两次后转移进入模拟人体肠液检测其肠溶性。随着在模拟人体肠液中的处理，微胶囊逐渐破裂，破裂速度呈现先迅速上升再趋于平缓的趋势，60min后基本完全释放其内的乳杆菌，达到82.34％，即仍然可以维持在10⁸cfu/mL，达到肠道益生菌发挥益生作用的要求。 

实施例3： 

以CCTCC NO：M 2010163为出发菌株，将其在种子培养基中培养至对数生长期后，离心洗涤获得纯净菌株后与制备好的无菌海藻酸钠(5％，w/v)溶液与变性淀粉(5％，w/v)按等体积充分混合，混合后益生菌浓度为10¹⁰cfu/mL。混合液通过喷雾器喷嘴喷入CaCl₂(5％，w/v)溶液中，Ca²⁺与海藻酸钠交联反应形成微胶囊。静止固化120min后生理盐水洗涤三次过滤，进行干燥获得微胶囊。 

检测指标 

a)外观表征：通过扫描电子显微镜观察，发现微胶囊形态完整，菌体存活与微胶囊内部； 

b)包埋率测定：根据专利所述包埋率测定方法测定包埋率，结果为95.80％； 

c)微胶囊的粒径表征：根据专利所述粒径测定方法测定微胶囊粒径，其粒径分布值为1.614； 

d)微胶囊的耐酸性测定：根据专利所述微胶囊的耐酸性测定方法测定微胶囊的耐酸性，经过包埋的干酪乳杆菌在模拟人体胃液条件中3h后，仅有23.56％的微胶囊出现破裂，包埋在微胶囊内部的活菌数仍可达到10¹⁰cfu/mL； 

e)微胶囊的肠溶性测定：根据所述微胶囊的肠溶性测定方法测定微胶囊的肠溶性，将在模拟人体胃液条件下3h后的微胶囊取出生理盐水洗涤两次后转移进入模拟人体肠液检测其肠溶性。随着在模拟人体肠液中的处理，微胶囊逐渐破裂，破裂速度呈现先迅速上升再趋于平缓的趋势，60min后基本完全释放其内的乳杆菌，达到80.66％，即仍然可以维持在10¹⁰cfu/mL，达到肠道益生菌发挥益生作用的要求。 

实施例4： 

以鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus GG编号ATCC 53103为出发菌株将其在种子培养基中培养至对数生长期后，离心洗涤获得纯净菌株后与制备好的无菌海藻酸钠(5％，w/v)溶液与变性淀粉(5％，w/v)按等体积充分混合，混合后益生菌浓度为10⁹cfu/mL。混合液通过喷雾器喷嘴喷入CaCl₂(5％，w/v)溶液中，Ca²⁺与海藻酸钠交联反应形成微胶囊。静止固化120min后生理盐水洗涤三次过滤，进行干燥获得微胶囊。按实施例1方法获得微胶囊后，检测如下指标： 

a)外观表征：通过扫描电子显微镜观察，发现微胶囊形态完整，菌体存活与微胶囊内部； 

b)包埋率测定：根据专利所述包埋率测定方法测定包埋率，结果为94.60％； 

c)微胶囊的粒径表征：根据专利所述粒径测定方法测定微胶囊粒径，其粒径分布值为1.577； 

d)微胶囊的耐酸性测定：根据专利所述微胶囊的耐酸性测定方法测定微胶 囊的耐酸性，经过包埋的干酪乳杆菌在模拟人体胃液条件中3h后，仅有24.34％的微胶囊出现破裂，包埋在微胶囊内部的活菌数仍可达到10⁹cfu/mL； 

e)微胶囊的肠溶性测定：根据所述微胶囊的肠溶性测定方法测定微胶囊的肠溶性，将在模拟人体胃液条件下3h后的微胶囊取出生理盐水洗涤两次后转移进入模拟人体肠液检测其肠溶性。随着在模拟人体肠液中的处理，微胶囊逐渐破裂，破裂速度呈现先迅速上升再趋于平缓的趋势，60min后基本完全释放其内的乳杆菌，达到80.66％，即仍然可以维持在10⁹cfu/mL，达到肠道益生菌发挥益生作用的要求。 

实施例5： 

采用实施例1方法分别包埋其他益生菌如嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、乳链球菌、婴儿双歧杆菌、短乳杆菌、短双歧杆菌、乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌、瑞士乳杆菌。虽然因上述菌株形态各异，因此其粒径分布值在1.003-1.855之间，但实验发现：通过此法包埋得到的微胶囊，均能够使益生菌在模拟胃液中得到很好的保护，而进入模拟肠液后在适当时间后释放，释放后的活性益生菌可继续生长。 

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，特别需要指出，本发明方法还可适用于本申请文件中未提及的其他益生菌。 

Claims (7)

1.一种益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，将海藻酸钠溶液与变性淀粉溶液等体积混合，再与益生菌混合，通过喷雾器喷嘴喷入CaCl₂溶液中，静置固化后生理盐水洗涤过滤，进行干燥获得微胶囊。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体方法如下：

1)浓度为1-5％的海藻酸钠溶液与浓度为1-5％的变性淀粉溶液按等体积混合；

2)将离心洗涤后的益生菌与步骤1)得到的混合液混合，混合后益生菌浓度为10⁸-10¹⁰cfu/mL；

3)将步骤2)得到的混合液通过喷雾器喷嘴喷入浓度为2％-5％CaCl₂溶液；

4)静置固化后用生理盐水洗涤，进行干燥获得微胶囊。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述干燥过程如下：将微胶囊放入冻干瓶，-70℃超低温冰箱冷冻过夜，放入真空冷冻干燥机控制温度-60℃、真空度6.67Pa冻干30h。

4.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述益生菌为干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、乳链球菌、婴儿双歧杆菌、短乳杆菌、短双歧杆菌、乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌、瑞士乳杆菌中任一一种或多种的组合。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述益生菌为干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，具体方法如下：

1)浓度为2％的海藻酸钠溶液与浓度为2％的变性淀粉溶液按等体积混合；

2)将离心洗涤后的益生菌与步骤1)得到的混合液混合，混合后益生菌浓度为10⁹cfu/mL。

3)将步骤2)得到的混合液通过喷雾器喷嘴喷入浓度为3％CaCl₂溶液；

4)静置固化120分钟后用生理盐水洗涤，进行干燥获得微胶囊。

7.一种权利要求1所述方法在微生态制剂或益生菌食品中的应用。