CN107997179A - 一种乳酸菌微胶囊的制备方法 - Google Patents

一种乳酸菌微胶囊的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乳酸菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：一、利用乳酸菌和益生元制得合生元溶液；二、将海藻酸钠和果胶溶解于蒸馏水中，并在室温下搅拌得到粘稠状混合溶液，然后将CaCO3粉末均匀地分散在混合溶液中得到微胶囊壁材，将微胶囊壁材与合生元溶液混合均匀，得到菌胶混合液；三、制备微胶囊制备。本发明制备得到的乳酸菌微胶囊既可以耐受胃酸和胆盐的作用从而在肠道更好地定植，发挥免疫调节、改善消化、抗肿瘤抗突变、调节酸碱平衡等诸多乳酸菌的益生作用，同时又使制备的微胶囊颗粒均匀且粒径在100μm左右。

Description

一种乳酸菌微胶囊的制备方法
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种乳酸菌微胶囊的制备方法。
背景技术
1907年有人提出食用酸奶可以使人长寿，因此将乳酸菌添加到日常食品中，从而可以被人类和动物的肠道吸收得到广泛的研究。乳酸菌对人体有许多的生理功能：增强宿主对病原菌的抵抗能力，调节免疫系统，抗过敏反应，降低胆固醇等。然而，在贮藏、运输和销售过程中，乳酸菌受到诸如食品组分、其它微生物、储存温度、pH等的影响，以致活菌数大幅下降，最终定植于肠道中的活菌数低于理论上能够发挥生理作用的最小值。值得注意的是，乳酸菌在环境中相对比较脆弱，要想使其到达肠道发挥生物活性作用，不仅要保证其在长期保藏、运输中存活下来，还要能承受消化道中酸性环境、胆盐和各种杀菌物质的侵蚀，以及应对肠道的高度无氧环境。
微胶囊（microencapsulation）技术是利用天然或合成的高分子成膜材料把分散均匀的固体微粒、液体或气体包覆形成微小固体颗粒的技术，囊包封能够提高囊心物的流动性并且保护他们不受湿度、酸碱度、氧气和热的影响。目前，微胶囊的制备方法有挤压法、喷雾干燥法、流化床法等，制备出的微胶囊的粒径为1-1000μm。然而，微胶囊粒径在200μm以下才能更好地应用在食品或者化妆品等行业中。
发明内容
本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种乳酸菌微胶囊的制备方法，制备得到的乳酸菌微胶囊既可以耐受胃酸和胆盐的作用从而在肠道更好地定植，发挥免疫调节、改善消化、抗肿瘤抗突变、调节酸碱平衡等诸多乳酸菌的益生作用，同时又使制备的微胶囊颗粒均匀且粒径在100μm左右。
本发明为解决上述技术问题的不足，所采用的技术方案是：一种乳酸菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
一、菌株活化
将乳酸菌接种于液体MRS培养基进行活化，37-40℃条件下培养至对数生长末期，收集第三代发酵液，将发酵液离心收集菌泥，然后用无菌生理盐水重悬，得到浓缩菌液，接着用琼脂培养基在温度37-40℃下倾注培养，最后在得到的发酵液中加入益生元，制得合生元溶液。
二、菌胶混合液配制
将海藻酸钠和果胶溶解于蒸馏水中，并在室温下搅拌得到粘稠状混合溶液，然后将CaCO3粉末均匀地分散在混合溶液中得到微胶囊壁材，将微胶囊壁材与合生元溶液混合均匀，得到菌胶混合液。
三、微胶囊制备
在添加有乳化剂的植物油中边搅拌边加入菌胶混合液，形成均匀的油包水（W/O）型乳化液，然后向乳化液中加入有机酸，继续搅拌后静置，得到的沉淀物即为沉降的微胶囊，最后采用真空抽滤装置对沉淀物进行分离，经无菌生理盐水或无菌水多次洗涤得到微胶囊。
作为本发明一种乳酸菌微胶囊的制备方法的进一步优化：所述步骤一中乳酸菌为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳酸菌、干酪乳杆菌中的一种或任意混合物，且菌液中的菌浓度达到109cfu/mL。
作为本发明一种乳酸菌微胶囊的制备方法的进一步优化：所述步骤一中的MRS液体培养基成分为：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%、乙酸钠0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、吐温80为0.1%、硫酸锰0.02%、硫酸镁0.02%以及余量的水。
作为本发明一种乳酸菌微胶囊的制备方法的进一步优化：所述步骤一中的益生元为低聚果糖、低聚异麦芽糖和菊粉中的一种或任意混合物。
作为本发明一种乳酸菌微胶囊的制备方法的进一步优化：所述步骤二中海藻酸钠和果胶溶解于蒸馏水中形成的混合溶液中海藻酸钠的质量分数为3%，果胶的质量分数为1-3%，且海藻酸钠和果胶均为食品级。
作为本发明一种乳酸菌微胶囊的制备方法的进一步优化：所述步骤二中CaCO3的加入量为：CaCO3与海藻酸钠的质量的比为1:3。
作为本发明一种乳酸菌微胶囊的制备方法的进一步优化：所述步骤三中的植物油为大豆油、花生油或者橄榄油，菌胶混合液与油相的体积比为1:2-5。
作为本发明一种乳酸菌微胶囊的制备方法的进一步优化：所述步骤三中的乳化剂为吐温-80、司班-80或者司班-20，且乳化剂的添加量为植物油体积的0.2-0.5%。
作为本发明一种乳酸菌微胶囊的制备方法的进一步优化：所述步骤三中的有机酸为醋酸、柠檬酸或者乳酸，有机酸的添加量与菌胶混合液的体积比为1:6000。
有益效果
一、本发明制备得到的乳酸菌微胶囊既可以耐受胃酸和胆盐的作用而在肠道更好地定植，发挥免疫调节、改善消化、抗肿瘤抗突变、调节酸碱平衡等诸多乳酸菌的益生作用，同时又使制备的微胶囊颗粒均匀且粒径在100μm左右；
二、本发明选择不溶性CaCO3为体系中Ca2+的来源，待反应体系中的混合物在搅拌下形成均匀的油包水（W/O）型乳化液后，加入有机酸，引发不溶性钙盐中Ca2+的解离，促使在乳液液滴内部与海藻酸钠作用生成凝胶颗粒，这种方法在室温下即可完成，操作容易，设备简单，制得的微胶囊包埋率高、颗粒粒径均匀且较小，很好地解决了现有技术中存在的一些技术问题。
附图说明
图1为本发明乳酸菌微胶囊在普通光学显微镜下的观察结果图；
图2为本发明乳酸菌微胶囊在扫描电镜下的观察结果图；
图3为本发明乳酸菌微胶囊在金相显微镜下的观察结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式进一步对本发明的技术方案进行阐述。
实施例1
一种乳酸菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
一、菌株活化
将保存在-80℃条件下的甘油保藏管保藏的保加利亚乳杆菌接种于液体MRS培养基进行活化，40℃条件下培养16h至对数生长末期，活化三代，收集第三代发酵液。将发酵液于6000rpm/min条件下离心6min收集菌泥，然后用质量分数为0.9%的无菌生理盐水重悬，得到浓缩菌液，接着用琼脂培养基在温度37℃下倾注培养，经计数得到培养液的活菌密度为6.6×109cfu/mL。最后，在得到的发酵液中加入0.6%的低聚果糖组成合生元溶液。
二、菌胶混合液配制
将海藻酸钠和果胶溶解于蒸馏水中，使海藻酸钠的质量分数为3%、果胶的质量分数为1%，配制成一定质量分数的混合溶液，并在室温下下搅拌过夜得到一种均匀无气泡的粘稠状溶液；然后将CaCO3粉末均匀地分散在上述溶液中，CaCO3与海藻酸钠的质量比为1:3，得到微胶囊的壁材；然后，将得到的壁材在110℃的条件下灭菌10min。最后，将灭菌后的壁材在无菌环境中与步骤一得到的合生元溶液混合均匀，得到菌胶混合液。
三、微胶囊制备
将步骤二得到的菌胶混合液加入到搅拌中的含0.3%司班-80的大豆油中，菌胶混合液与油相的比例为1:3，在转速600rpm条件下搅拌反应15min形成均匀的油包水（W/O）型乳化液；然后，向所述的乳化液中加入灭过菌的冰醋酸，继续搅拌40min后静置一定的时间，得到的沉淀物即为沉降的微胶囊。最后，采用真空抽滤装置对沉淀物进行分离，经无菌生理盐水或无菌水多次洗涤得到微胶囊。
本实施例制备的乳酸菌微胶囊乳酸菌的包埋率达到84.6%，颗粒均匀且粒径在105μm，耐胃酸性、肠释放性良好。
实施例2：
一种乳酸菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
一、菌株活化
将保存在-80℃条件下的甘油保藏管保藏的保加利亚乳杆菌与鼠李糖乳酸菌按照1:1的比例接种于液体MRS培养基进行活化，40℃条件下培养16h至对数生长末期，活化三代，收集第三代发酵液。将发酵液于6000rpm/min条件下离心6min收集菌泥，然后用质量分数为0.9%的无菌生理盐水重悬，得到浓缩菌液，接着用琼脂培养基在温度37℃下倾注培养，经计数得到培养液的活菌菌密度为7.2×109cfu/mL。最后，在得到的发酵液中加入0.6%的低聚果糖、1.25%低聚异麦芽糖组成合生元溶液。
二、菌胶混合液配制
将海藻酸钠和果胶溶解于蒸馏水中，使海藻酸钠的质量分数为3%、果胶的质量分数为2%，配制成一定质量分数的混合溶液，并在室温下搅拌过夜得到一种均匀无气泡的粘稠状溶液；然后将CaCO3粉末均匀地分散在上述溶液中，CaCO3与海藻酸钠的质量比为1:3，得到微胶囊的壁材；然后，将得到的壁材在110℃的条件下灭菌10min。最后，将灭菌后的壁材在无菌环境中与步骤一得到的合生元溶液混合均匀，得到菌胶混合液。
三、微胶囊制备
将步骤二得到的菌胶混合液加入到搅拌中的含0.5%司班-80的大豆油中，菌胶混合液与油相的比例为1:4，在转速600rpm条件下搅拌反应15min形成均匀的油包水（W/O）型乳化液；然后，向所述的乳化液中加入灭过菌的冰醋酸，继续搅拌40min后静置一定的时间，得到的沉淀物即为沉降的微胶囊。最后，采用真空抽滤装置对沉淀物进行分离，经无菌生理盐水或无菌水多次洗涤得到微胶囊。
本实施例制备的乳酸菌微胶囊中乳酸菌的包埋率达到84.9%，颗粒均匀且粒径在100μm左右，耐胃酸性、肠释放性良好。
实施例3：
一种乳酸菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
一、菌株活化
将保存在-80℃条件下的甘油保藏管保藏的干酪乳杆菌与鼠李糖乳酸菌按照1:1的比例接种于液体MRS培养基进行活化，40℃条件下培养16h至对数生长末期，活化三代，收集第三代发酵液。将发酵液于5000rpm/min条件下离心8min收集菌泥，然后用质量分数为0.9%的无菌生理盐水重悬，得到浓缩菌液，接着用琼脂培养基在温度37℃下倾注培养，经计数得到培养液的活菌菌密度为7.5×109cfu/mL。最后，在得到的发酵液中加入1%的菊粉、1.25%低聚异麦芽糖组成合生元溶液。
二、菌胶混合液配制
将海藻酸钠和果胶溶解于蒸馏水中，使海藻酸钠的质量分数为3%、果胶的质量分数为2%，配制成一定质量分数的混合溶液，并在室温下下搅拌过夜得到一种均匀无气泡的粘稠状溶液；然后将CaCO3粉末均匀地分散在上述溶液中，CaCO3与海藻酸钠的质量比为1:3，得到微胶囊的壁材；然后，将得到的壁材在110℃的条件下灭菌10min。最后，将灭菌后的壁材在无菌环境中和步骤一中得到的合生元溶液混合均匀，得到菌胶混合液。
三、微胶囊制备
将步骤二得到的菌胶混合液加入到搅拌中的含0.5%司班-80的大豆油中，菌胶混合液与油相的比例为1:3，在转速600rpm条件下搅拌反应15min形成均匀的油包水（W/O）型乳化液；然后，向所述的乳化液中加入灭过菌的冰醋酸，继续搅拌40min后静置一定的时间，得到的沉淀物即为沉降的微胶囊。最后，采用真空抽滤装置对沉淀物进行分离，经无菌生理盐水或无菌水多次洗涤得到微胶囊。
本实施例制备的乳酸菌微胶囊中乳酸菌的包埋率达到83.9%，颗粒均匀且粒径在100μm左右，耐胃酸性、肠释放性良好。
实施例4：
一种乳酸菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
一、菌株活化
将保存在-80℃条件下的甘油保藏管保藏的鼠李糖乳酸菌按接种量3%接种于液体MRS培养基进行活化，40℃条件下培养16h至对数生长末期，活化三代，收集第三代发酵液。将发酵液于5000rpm/min条件下离心8min收集菌泥，然后用质量分数为0.9%的无菌生理盐水重悬，得到浓缩菌液，接着用琼脂培养基在温度37℃下倾注培养，经计数得到培养液的活菌菌密度为6.8×109cfu/mL。最后，在得到的发酵液中加入0.6%的低聚果糖、1%的菊粉、1.25%的低聚异麦芽糖组成合生元溶液。
二、菌胶混合液配制
将一定量海藻酸钠和果胶溶解于蒸馏水中，使海藻酸钠的质量分数为3%、果胶的质量分数为1%，配制成一定质量分数的混合溶液，并在室温下下搅拌过夜得到一种均匀无气泡的粘稠状溶液；然后将CaCO3粉末均匀地分散在上述溶液中，CaCO3与海藻酸钠的质量比为1:3，得到微胶囊的壁材；然后，将得到的壁材在110℃的条件下灭菌10min。最后，将灭菌后的壁材在无菌环境中和步骤一中得到的合生元溶液混合均匀，得到菌胶混合液。
三、微胶囊制备
将步骤二得到的菌胶混合液加入到搅拌中的并添加0.5%吐温-80的大豆油中，菌胶混合液与油相的比例为1:4，在转速600rpm条件下搅拌反应15min形成均匀的油包水（W/O）型乳化液；然后，向所述的乳化液中加入灭过菌的冰醋酸，继续搅拌40min后静置一定的时间，得到的沉淀物即为沉降的微胶囊。最后，采用真空抽滤装置对沉淀物进行分离，经无菌生理盐水或无菌水多次洗涤得到微胶囊。
本实施例制备的乳酸菌微胶囊中乳酸菌的包埋率达到85%，颗粒均匀且粒径在100μm左右，耐胃酸性、肠释放性良好。
采用本发明方法制备得到的益生菌微胶囊进行了如下所述的性能测定：
A、包埋率测定
称取本发明益生菌微胶囊0.5g加入到30mL灭菌后的解囊液（分别准确配制0．1mol/LNa2HP04和0．05mol/L柠檬酸，调节pH=7．25，121℃灭菌15min后备用）中，37℃条件下在摇床中震荡2-3h，摇床转速为180rpm，使菌体完全释放，然后取样梯度稀释，采用平板计数法进行活菌计数，按照下式进行计算乳酸菌微胶囊中益生菌包埋率。
式中，微胶囊中活菌数为每克微胶囊的含菌量与收集得到的微胶囊总质量的乘积；初始活菌数为每毫升浓缩菌液的含菌量与加入的浓缩菌液总体积的乘积。
B、形态测定
使用显微镜观察微胶囊的大小和粒径，所使用的显微镜为普通光学显微镜、扫描电子显微镜。
C、耐胃酸测试
称取本发明乳酸菌微胶囊0.5g置于10mL人工胃液（盐酸16.4mL，胃蛋白酶10g，加水搅匀后定容至1000mL，pH为1.2）中，在温度37℃下震荡培养，并每隔0.5h移取样品溶液于解囊液中震荡培养2h，使菌体释放完全，从中移取1mL进行梯度稀释，采用琼脂培养基倾注培养法进行活菌计数。结果表明，在胃液中消化2.5h后，活菌数仅减少0.2个数量级，说明微胶囊可以很好地耐受胃酸的作用。
D、肠液释放性测试
称取本发明乳酸菌微胶囊0.5g置于30mL模拟肠液（磷酸二氢钾6.8g加水500ml溶解，用0.4%的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g加水适量使其溶解，将两液混合后加水定容至1000ml）中，在温度37℃下震荡培养2.5h，并每隔0.5h移取样品溶液1mL进行梯度稀释计数，以确定释放到模拟肠液中的活菌数。结果表明在1.5h后，本发明乳酸菌微胶囊中乳酸菌基本释放完全，活菌数可达7.6×109cfu/mL。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
一、菌株活化
将乳酸菌接种于液体MRS培养基进行活化，37-40℃条件下培养至对数生长末期，收集第三代发酵液，将发酵液离心收集菌泥，然后用无菌生理盐水重悬，得到浓缩菌液，接着用琼脂培养基在温度37-40℃下倾注培养，最后在得到的发酵液中加入益生元，制得合生元溶液；
二、菌胶混合液配制
将海藻酸钠和果胶溶解于蒸馏水中，并在室温下搅拌得到粘稠状混合溶液，然后将CaCO3粉末均匀地分散在混合溶液中得到微胶囊壁材，将微胶囊壁材与合生元溶液混合均匀，得到菌胶混合液；
三、微胶囊制备
在添加有乳化剂的植物油中边搅拌边加入菌胶混合液，形成均匀的油包水（W/O）型乳化液，然后向乳化液中加入有机酸，继续搅拌后静置，得到的沉淀物即为沉降的微胶囊，最后采用真空抽滤装置对沉淀物进行分离，经无菌生理盐水或无菌水多次洗涤得到微胶囊。
2.如权利要求1所述一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤一中乳酸菌为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳酸菌、干酪乳杆菌中的一种或任意混合物，且菌液中的菌浓度达到109cfu/mL。
3.如权利要求1所述一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤一中的MRS液体培养基成分为：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%、乙酸钠0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、吐温80为0.1%、硫酸锰0.02%、硫酸镁0.02%以及余量的水。
4.如权利要求1所述一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤一中的益生元为低聚果糖、低聚异麦芽糖和菊粉中的一种或任意混合物。
5.如权利要求1所述一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤二中海藻酸钠和果胶溶解于蒸馏水中形成的混合溶液中海藻酸钠的质量分数为3%，果胶的质量分数为1-3%，且海藻酸钠和果胶均为食品级。
6.如权利要求1所述一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤二中CaCO3的加入量为：CaCO3与海藻酸钠的质量的比为1:3。
7.如权利要求1所述一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤三中的植物油为大豆油、花生油或者橄榄油，菌胶混合液与油相的体积比为1:2-5。
8.如权利要求1所述一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤三中的乳化剂为吐温-80、司班-80或者司班-20，且乳化剂的添加量为植物油体积的0.2-0.5%。
9.如权利要求1所述一种乳酸菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤三中的有机酸为醋酸、柠檬酸或者乳酸，有机酸的添加量与菌胶混合液的体积比为1:6000。
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