JP6820340B2 - 腸内生存率が高められた乳酸菌のコーティング方法 - Google Patents
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Description
(a)乳酸菌をカゼイン含有培地で培養し、前記乳酸菌をカゼインでコーティングするステップ;
(b)前記カゼインでコーティングされた乳酸菌を、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのEPS(Extracellular Polymeric Substance)及びアルギン酸を含む溶液と混合するステップ;及び
(c)前記(b)ステップの混合物をカルシウム含有溶液に添加してアルギン酸−カルシウムビーズを形成するステップを備え、前記カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、食用油脂及びラクトバチルス・プランタラムのEPSは前記アルギン酸−カルシウムビーズの内部に含まれることを特徴とする、乳酸菌のコーティング方法を提供する。
(a)乳酸菌をカゼイン含有培地で培養し、乳酸菌をカゼインでコーティングするステップ
前記乳酸菌は酸を生成し弱酸性条件でも増殖できる乳酸菌であり、これらに限定されないが、ラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium sp.)、ストレプトコッカス属(Streptococcus sp.)、ラクトコッカス属(Lactococcus sp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus sp.)、ペディオコッカス属(Pediococcus sp.)、リューコノストック属(Leuconostoc sp.)、ワイセラ属(Weissella sp.)のいずれか一つであることを特徴とする。具体的には、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・ブレブ(Bifidobacterium breve)、ストレプトコッカス・フェカリス(Streptococcus faecalis)、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis subsp.lactis)のいずれか一つであり、より具体的には、韓国特許登録番号第1178217号に記載のラクトバチルス・プランタラムCJLP243(Lactobacillus plantarum CJLP243)、韓国特許登録番号第1486999号に記載のラクトバチルス・プランタラムCJ133(Lactobacillus plantarum CJLP133)、韓国特許登録番号第1075558号に記載のラクトバチルス・プランタラムCJLP136(Lactobacillus plantarum CJLP136)、韓国特許登録番号第1255050号に記載のラクトバチルス・プランタラムCJLP55(Lactobacillus plantarum CJLP55)及び韓国特許登録番号第1075557号に記載のラクトバチルス・プランタラムCJLP56(Lactobacillus plantarum CJLP56)のいずれか一つ以上である。
(b)ステップは懸濁および/または乳化(suspension and/or emulsion)ステップであり、前記(a)ステップにおいて生成したカゼインでコーティングされた乳酸菌を遠心分離などの方法により集菌した後、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのEPS(Extracellular Polymeric Substance)及びアルギン酸を含む溶液と混合する。
前記カゼインでコーティングされた乳酸菌を、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのEPS(Extracellular Polymeric Substance)及びアルギン酸を含む溶液と混合するステップは、これらの各成分を同時に添加するか、あるいは順次に添加するか、時間差を置いて混合する。具体的には、カゼインでコーティングされた乳酸菌とコーティング剤を先に混合し、前記混合物に水を添加して水性混合物を得て、前記水性混合物にアルギン酸含有溶液を追加して混合する。他の実施形態では、カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、およびアルギン酸含有溶液を同時に添加して混合するか、カゼインでコーティングされた乳酸菌とアルギン酸含有溶液を最初に混合し、その後コーティング剤を追加する。
また、前記(b)ステップの混合時に、凍結保護剤を任意に追加することができる。
前記凍結保護剤は、凍結乾燥のせいで乳酸菌が損傷または死滅することを防止する役割をする。前記凍結保護剤は、これらに限定されないが、例えば、デキストリン、ショ糖、グリセロール、マンニトール、およびトレハロースのいずれか一つ以上であり、具体的にはトレハロースのみを含ませるか、トレハロースに加えて他の凍結保護剤を含ませる。
前記(c)ステップは、押出(extrusion)ステップであり、懸濁および/または乳化(suspension and/or emulsion)されてコーティングされた乳酸菌とアルギン酸含有混合物をカルシウム含有溶液と反応させると、アルギン酸−カルシウム架橋結合によるマトリックスの形成のためカルシウム含有溶液内で乳酸菌がビーズ内部に捕集され、このとき、(b)ステップで混合されたコーティング剤、EPS、食用油脂などがビーズ内に同時に捕集される。
(1)前記(b)ステップの混合物を25℃〜35℃に維持するステップ;
(2)100mM〜1Mのカルシウムイオン溶液を攪拌するステップ;及び
(3)前記(b)ステップの混合物を加圧条件で前記攪拌されたカルシウムイオン溶液に点滴してアルギン酸−カルシウムビーズ含有溶液を製造するステップを備える。
前記(c)ステップの後、必要に応じて(d)ステップをさらに備えることができる。(d)ステップは凍結乾燥するステップであり、前記(c)ステップ後に製造された乳酸菌を含むアルギン酸−カルシウムビーズを凍結乾燥トレイ(Tray)に移し、急速凍結条件である−40℃〜−70℃の温度で12時間ないし24時間前後で維持した後、凍結乾燥機で解凍しながら水分を除去する。
ラクトバチルス・プランタラムCJLP243菌株を0.02重量%の脱脂粉乳が含まれたMRS液体培地(Difco、USA)に37℃で18時間〜24時間培養した。遠心分離器を用いて上澄み液は捨て、カゼインでコーティングされた乳酸菌のみ回収した。
ラクトバチルス・プランタラムCJLP243菌株をMRS液体培地(Difco、USA)に37℃で18時間〜24時間培養した。遠心分離器を用いて上澄み液は捨て、乳酸菌のみ回収した。トレハロース(Trehalose)(菌体の重量を基準に15重量%前後)を加水及び水溶化して滅菌した。乳酸菌と前記凍結保護剤を混合して懸濁(suspension)した。前記乳酸菌を遠心分離器で集菌した。回収した乳酸菌は凍結乾燥トレイ(Tray)に移し、急速凍結条件(−40℃以下)で12時間〜24時間前後を維持した後、凍結乾燥機で解凍しながら水分を除去した。
ラクトバチルス・プランタラムCJLP243菌株を0.02重量%の脱脂粉乳が含まれたMRS液体培地(Difco、USA)に37℃で18時間〜24時間培養した。遠心分離器を用いて上澄み液は捨て、カゼインでコーティングされた乳酸菌のみ回収した。
ラクトバチルス・プランタラムCJLP243菌株を0.02重量%の脱脂粉乳が含まれたMRS液体培地(Difco、USA)に37℃で18時間〜24時間培養した。遠心分離器を用いて上澄み液は捨て、カゼインでコーティングされた乳酸菌のみ回収した。
前記製造された実施例1と比較例1ないし3の乳酸菌または乳酸菌複合体に対して、下記の方法で腸内生存率、流通保存性を評価し、その結果を下記表1ないし4に示した。
乳酸菌は摂取後、消化器官を経て様々な要因によって死滅する環境にさらされる。最も重要な原因としては、胃から分泌される胃酸による死滅と十二指腸から分泌される胆汁酸による死滅を挙げることができる。具体的に、胃酸の強酸は菌に直接作用して死滅を誘導し、胆汁酸は様々な消化酵素(主に脂肪分解酵素による)や、浸透圧のストレスで菌の死滅を誘導する。胃/胆汁酸による生菌の生存率の評価方法の一つである簡易モデルとして、仮想の胃/胆汁経路実験法(Simulated Stomach Duodenum Passage、(SSDP))(MG Vizoso Pinto、CMAP Franz、U. Schillinger、and WH Holzapfel、 “Lactobacillus spp. with in vitro probiotic properties from human faeces and traditional fermented products”、International Journal of Food Microbiology、vol.109、no.3、pp.205−214、2006)が提案された。SSDPの主な試験法は、一定濃度の生菌や生菌粉末を酸性条件下(pH 3.0、飲食物を摂取した胃のpH条件)のMRS培地で1時間静置培養し、さらに胆汁酸条件(人工胆汁液、Oxgall/salts)で2時間静置培養して、菌の生存率を1時間単位でチェックする方法である。SSDP試験法は、前記胃−胆汁条件を連続的に適用するため、菌の生存は個別に適用するよりも過酷な条件であるが、実際の人体の消化器環境に似ている。特に、脱水および粉末製剤化された乳酸菌の場合、菌体が活性化されない状態であるためSSDP試験の過酷な環境でもっと脆弱であるが、粉末形態の乳酸菌を最終的に摂取する評価モデルとしてもっと適切な方法であると考えられる。
凍結乾燥化された乳酸菌原末は温度と保存期間の経過につれて活性が徐々に減少する。 活性の影響要因として一般的に、温度、酸素、水分などが挙げられる。主に凍結乾燥化された乳酸菌原末は吸湿性が非常に強く、保存初期に多くの含量が減少する。流通保存性を高めるために包装材に脱酸素剤を適用するなど除湿のために様々な方法があるが、最終的には、乳酸菌原末自体のコーティング程度により保存期間に大差がある。したがって、原料特性に起因した吸湿性を緩和するために、グルコースとデキストリンなどの賦形剤を原末の重量を基準に1倍〜10倍の範囲で混合して保存する。本実験では、マルトデキストリンと無水結晶ブドウ糖が1:1の割合で混合された賦形剤を原末1:混合賦形剤3の割合で混合して保存した。保存期間中の空気透過性を排除するためアルミパウチに個別包装して50℃で3日間保存し、短期の過酷条件における生存率を分析した。
Claims (17)
- (a)乳酸菌をカゼイン含有培地で培養し、前記乳酸菌をカゼインでコーティングするステップ;
(b)前記カゼインでコーティングされた乳酸菌を回収するステップ;
(c)前記回収されたカゼインでコーティングされた乳酸菌を、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのEPS(Extracellular Polymeric Substance)及びアルギン酸を含む溶液と混合するステップ;及び
(d)前記(c)ステップの混合物をカルシウム含有溶液に添加してアルギン酸−カルシウムビーズを形成するステップを備え、
前記カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、食用油脂、及びラクトバチルス・プランタラムのEPSが、前記アルギン酸−カルシウムビーズの内部に含まれることを特徴とする、乳酸菌のコーティング方法であって、
前記カゼイン含有培地はカゼイン含有脱脂粉乳を含む培地であり、前記脱脂粉乳は全培地組成物を基準に0.005重量%〜0.2重量%である、乳酸菌のコーティング方法。 - 前記乳酸菌はラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium sp.)、ストレプトコッカス属(Streptococcus sp.)、ラクトコッカス属(Lactococcus sp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus sp.)、ペディオコッカス属(Pediococcus sp.)、リューコノストック属(Leuconostoc sp.)およびワイセラ属(Weissella sp.)からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項1に記載の乳酸菌のコーティング方法。
- 前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・ブレブ(Bifidobacterium breve)、ストレプトコッカス・フェカリス(Streptococcus faecalis)、およびラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis subsp.lactis)からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項1に記載の乳酸菌のコーティング方法。
- 前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP243(Lactobacillus plantarum CJLP243)、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133(Lactobacillus plantarum CJLP133)、ラクトバチルス・プランタラムCJLP136(Lactobacillus plantarum CJLP136)、ラクトバチルス・プランタラムCJLP55(Lactobacillus plantarum CJLP55)、及びラクトバチルス・プランタラムCJLP56(Lactobacillus plantarum CJLP56)からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項1に記載の乳酸菌のコーティング方法。
- 前記コーティング剤は、多孔性ポリマー、蛋白質および増粘多糖類からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項1に記載の乳酸菌のコーティング方法。
- 前記(c)ステップの溶液に、プレバイオティクスがさらに含まれることを特徴とする、請求項1に記載の乳酸菌のコーティング方法。
- 前記アルギン酸溶液は、アルギン酸ナトリウムを2重量%〜4重量%で水溶化したものであり、アルギン酸溶液の重量とカゼインでコーティングされた乳酸菌の重量の比が1:1〜10:1であることを特徴とする、請求項1に記載の乳酸菌のコーティング方法。
- 前記(c)ステップのラクトバチルス・プランタラムは、ラクトバチルス・プランタラムCJLP243(Lactobacillus plantarum CJLP243)であることを特徴とする、請求項1に記載の乳酸菌のコーティング方法。
- 前記カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、食用油脂及びラクトバチルス・プランタラムのEPSが内部に含まれたアルギン酸−カルシウムビーズを凍結乾燥するステップをさらに備える、請求項1に記載の乳酸菌のコーティング方法。
- 前記(c)ステップの溶液に凍結保護剤がさらに含まれることを特徴とする、請求項1に記載の乳酸菌のコーティング方法。
- カゼインでコーティングされた乳酸菌、コーティング剤、食用油脂、ラクトバチルス・プランタラムのEPS、およびアルギン酸−カルシウムビーズを含む、乳酸菌複合体であって、前記カゼインでコーティングされた乳酸菌は、カゼイン含有脱脂粉乳が全培地組成物を基準に0.005重量%〜0.2重量%で含まれた培地で培養したものであって、カゼイン−菌マトリックスの形成によってカゼインコーティングされたものであり、
前記アルギン酸−カルシウムビーズの内部に、前記カゼインでコーティングされた乳酸菌、及び前記ラクトバチルス・プランタラムのEPSが含まれることを特徴とする、乳酸菌複合体。 - プレバイオティクス、凍結保護剤からなる群より選択されるいずれか一つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項11に記載の乳酸菌複合体。
- 前記コーティング剤は、多孔性ポリマー、蛋白質および増粘多糖類からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むことを特徴とする、請求項11に記載の乳酸菌複合体。
- 前記乳酸菌は、ラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium sp.)、ストレプトコッカス属(Streptococcus sp.)、ラクトコッカス属(Lactococcus sp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus sp.)、ペディオコッカス属(Pediococcus sp.)、リューコノストック属(Leuconostoc sp.)およびワイセラ属(Weissella sp.)からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むことを特徴とする、請求項11に記載の乳酸菌複合体。
- 前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・ブレブ(Bifidobacterium breve)、ストレプトコッカス・フェカリス(Streptococcus faecalis)、およびラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis subsp.lactis)からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むことを特徴とする、請求項11に記載の乳酸菌複合体。
- 前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP243(Lactobacillus plantarum CJLP243)、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133(Lactobacillus plantarum CJLP133)、ラクトバチルス・プランタラムCJLP136(Lactobacillus plantarum CJLP136)、ラクトバチルス・プランタラムCJLP55(Lactobacillus plantarum CJLP55)、及びラクトバチルス・プランタラムCJLP56(Lactobacillus plantarum CJLP56)からなる群より選択されるいずれか一つ以上を含むことを特徴とする、請求項11に記載の乳酸菌複合体。
- 前記ラクトバチルス・プランタラムは、ラクトバチルス・プランタラムCJLP243(Lactobacillus plantarum CJLP243)であることを特徴とする、請求項11に記載の乳酸菌複合体。
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