KR20230146838A - 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법 - Google Patents

칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법, 상기 방법으로 제조된 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균, 유산균 포집용 칼슘-알긴산 비드의 제조 수율을 개선시키는 방법 및 동결 건조된 유산균의 생존율을 개선시키는 방법에 관한 것이다.

Description

칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법{Method for producing lactic acid bacteria captured with calcium-alginate beads}
본 출원은 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법, 상기 방법으로 제조된 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균, 유산균 포집용 칼슘-알긴산 비드의 제조 수율을 개선시키는 방법 및 동결 건조된 유산균의 생존율을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
유산균(lactic acid bacteria)은 락트산균 또는 젖산균이라고도 하며, 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상 발효를 방지하여 정장제로도 이용되는 중요한 세균이다. 예를 들어, 불가리아 젖산균(L.　bulgaricus)은 가장 오래 전부터 알려진　유산균으로, 요구르트의 제조에 사용되며, 치즈나 발효 버터 제조 시의 스타터로도 사용된다. 또한, 호기성 젖산균(L. acidophilus)은 사람 및 모든 포유류와 그 밖의 동물의 장에 존재하며, 버터 또는 우유의 제조나 장내 자가 중독의 치료에 사용된다. 또한, 락티스 젖산 구균(L. lactis)은 DL-젖산을 생성하며, 이것은 항상 우유 속에 존재하여 버터 또는 치즈 제조에 사용되며 낙농용 젖산균으로서 가장 중요한 균이다.
상기와 같이 유용한　유산균은 장에 정착하여 장관 운동 활성화, 유해균 억제, 비타민을 비롯한 면역증강 물질 촉진, 아토피 피부의 완화 등 다양한 생리활성 효과를 발휘한다. 그러나 상기 생리학적 효과를 발휘하기 위해서는, 기존에 요거트 등 식품으로 섭취하는 양보다 훨씬 더 많은 양의　유산균을 섭취해야 한다. 따라서　유산균만을 분리하여 분말이나 캡슐 형태로 간편하게 먹는 방법이 대중화되어 있다. 그러나　유산균을 분말이나 캡슐형으로 만들게 되면, 장기적인 유통 과정 중에 사멸하는　유산균이 많아　유산균　본래의 생리 활성 기능을 발휘하지 못하게 되는 한계점이 있다.
일반적으로　유산균은 동결 건조법 또는 분사 건조법에 의하여 분말 형태로 제조하며, 그중 동결 건조법은 동결건조용 현탁용액에 미생물을 현탁시켜 동결시킨 후 감압 하에서 건조시키는 방법이다. 그러나,　유산균은 편혐기성이고 주위환경에 매우 민감하기 때문에, 분말　유산균은 저온 및 상온에서 생존율이 저하되어 생균수가 감소하게 된다. 최근에는 이러한 단점을 극복하기 위해 각종 피복제를 사용하여　유산균을 코팅시키는 방법이 개발되고 있는데, 예컨대 전분, 젤라틴, 알긴산, 셀룰로오스, 경화유, 각종 유화제 등을 동결 보호제로 사용하여 유통기간 내에 품질을 유지하도록 하는 방법 등이 개발되고 있다.
살아있는 유산균은 온도의 증가에 의해 사멸되므로, 동결건조는 유산균의 저장기간 동안 세포의 활성을 유지시킬 수 있는 가장 효과적인 방법이다. 동결건조를 통해 유산균의 저장 및 유통을 크게 개선할 수 있지만, 일반적으로 동결건조 공정에 의해 유산균의 생존율이 크게 감소한다.
대표적으로, 젤라틴으로 코팅된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 동결 건조하여　유산균의 안정성에 저장 온도 및 폴리머가 미치는 영향을 확인한 연구가 수행된 바 있다(Claude P.C. et al, Food. Res. Int., 1996, 29, 555∼562). 그러나, 상기 연구에서는 20℃에서 6개월 저장한 후 약 1%의　유산균이 생존하였고, 12개월 후에는 약 0.2%의　유산균만이 생존하였음을 개시하고 있어,　유산균의 생존률 및 보관안정성을 더욱 높일 수 있는 방법의 개발이 요구되는 실정이다.
한편, 알긴산 캡슐을 이용하여 유산균을 코팅하는 방법이 알려져 있으나, 알긴산은 산 및 열에 불안정하고, 종래의 알긴산을 이용한 캡슐의 제조방법에 의하면 알긴산과 미생물의 혼합물을 CaCl2　용액과 같은 응고액에　분무하여 제조하기 때문에, 분무되는 알긴산과 미생물의 혼합물의 입자 표면에서부터 알긴산이 응고액의 칼슘이온과 반응하여 경화가 개시되어 짧은 시간 동안에 충분한 칼슘이온이 입자 내부로 이동하지 못하여, 고수율로 내부의 알긴산까지 단단하고 촘촘하게 경화된 알긴산 캡슐을 대량 생산하는 것에 어려움이 있다.
본 출원의 하나의 목적은 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 제조된, 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 유산균 포집용 칼슘-알긴산 비드의 제조 수율을 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 동결 건조된 유산균의 생존율을 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 하나의 양태는 (a) 유산균을 배양하여 균체를 회수하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 유산균을 알긴산을 포함하는 용액과 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 혼합물을 칼슘 함유 용액에 첨가하여 알긴산-칼슘 비드를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 알긴산을 포함하는 용액은 수크로스, 솔비톨 또는 소이 펩톤을 포함하는 것이고, 상기 칼슘 함유 용액은 트레할로스 또는 말토덱스트린을 포함하는 것인, 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법을 제공한다.
하나의 구체예로, (d) 상기 (c) 단계의 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 상기 "동결 건조(Freeze drying)"는 용기의 온도를 급격하게 낮추어 건조시키고자 하는 재료를 얼린 다음, 용기 내부의 압력을 진공으로 만들어 재료에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 건조하는 방법이다. 동결 건조는 열에 민감한 물질의 손상을 최소화하고 효과적으로 장기 보존할 수 있는 방법으로서 오염 방지, 저장, 수송, 경제성 측면에서 유용하다. 하지만, 유산균의 동결 건조 과정에서 유산균의 활성과 생존율이 급격하게 감소하게 되고, 동결시 얼음 입자가 만들어지면서 유산균 세포의 막 구조를 손상시키는 문제점이 있다. 이를 개선하기 위해 유산균이 손상되거나 사멸하지 않고 재수화(再水和)시 그 기능을 회복할 수 있도록 동결 건조시 함께 첨가하는 물질을 동결 보호제라고 지칭하며, 이는 유산균에 물리화학적 안정성을 부여하여 생존율을 높이는 역할을 한다.
본 출원에서, 동결 건조의 동결 온도는 영하의 온도, 예컨대 -10 ℃ 내지 -196 ℃(액화질소의 비점), -40 ℃ 내지 -196 ℃, -50 ℃ 내지 -196 ℃, -70 ℃ 내지 -196 ℃일 수 있고, 이와 같은 저온에서 세포 사멸을 초래하는 생화학적 반응을 포함하는 유산균의 모든 생물 활성이 효과적으로 정지된다.
본 출원에서 용어, "동결 보호"는 유산균의 활성을 그대로 보존하기 위해 동결 건조하여 보관할 때 유산균 조직을 결빙으로부터 보호하는 것을 의미한다.
본 출원의 목적상, 상기 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법으로 제조된 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균은 동결건조 후 생존율 및 안정성이 개선된 것일 수 있다.
이하 구체적으로, 본 출원의 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조방법을 상세하게 설명한다.
먼저, (a) 유산균을 배양하여 균체를 회수한다.
본 출원에서 용어, "유산균"은 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭하는 용어로서, 특별히 이에 제한되지는 않으나,　상기　유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus　sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacteriumsp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcussp.), 엔테로코커스 속(Enterococcussp.), 페디오코커스 속(Pediococcussp.) 류코노스톡 속(Leuconostocsp.) 및 비셀라 속(Weissellasp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기　유산균은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus　plantarum), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus　casei), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus　rhamnosus), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium　bifidum), 비피도박테리움 롱굼 (Bifidobacteriumlongum), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacteriumbreve), 스트렙토코커스 훼칼리스 (Streptococcus faecalis) 및 락토코커스 락티스 (Lactococcuslactissubsp.　lactis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱 구체적으로, 상기　유산균은 락토바실러스 플란타룸 CJLP133(Lactobacillus　plantarum CJLP133), 락토바실러스 플란타룸 CJLP243(Lactobacillus　plantarum CJLP243), 락토바실러스 플란타룸 CJLP136 (Lactobacillus　plantarum CJLP136), 락토바실러스 플란타룸 CJLP55 (Lactobacillus　plantarum CJLP55) 및 락토바실러스 플란타룸 CJLP56(Lactobacillus　plantarum CJLP56)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 균주는 생명공학연구원 유전자은행에 기탁되어 있으며, 당업자가 생명공학연구원 유전자은행에서 용이하게 입수 가능한 균주이다.
본 출원에서, "배양"은 상기　유산균을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 나트륨-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서,　유산균의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
배지의 온도는 20 ℃ 내지 50 ℃, 구체적으로는 30 ℃ 내지 37 ℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10시간 내지 100시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기　유산균　균체를 회수하는 단계는 본 출원의　유산균의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 목적하는 균체를 회수할 수 있다. 예컨대 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으나, 이들 예에 제한되지 않는다.
상기 회수 단계는 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 회수된　유산균　균체를 정제할 수 있다.
이어서, (b) 상기 (a) 단계의 유산균을 상기 원심분리 등의 방법으로 집균한 후, 알긴산을 포함하는 용액과 혼합한다.
본 출원에서 용어, "알긴산(alginic acid, alginate)"은 2종의 우론산의 중합체로 중합도 80, 분자량 1,500 정도의 물질로서, 만누론산(D-mannuronic acid: 이하 M 이라고도 함)과 L-글루론산(L-guluronic acid)이 β-1, 4 결합으로 수백 개가 연결된 분지되지 않은 구조를 가지는 것을 의미한다.
본 출원의 일 실시예에서는 동결보호 효과를 높여 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 동결건조 후 생존율을 높이기 위하여, 당류 및 단백질류를 알긴산을 포함하는 용액에 추가하여 제조하였다. 대표적으로 많이 사용하는 단백질류의 동결보호제는 Skim milk가 있으나, 이를 첨가할 경우, Skim milk의 칼슘성분이 알긴산과 먼저 반응하여 경화되는 것을 확인하였다. 따라서, 비드가 제대로 생성되지 않는 것을 확인하여 실험군에서 제거 하였다.
구체적으로, 상기 알긴산을 포함하는 용액은 수크로스, 솔비톨 또는 소이 펩톤, 보다 구체적으로 소이펩톤을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "소이 펩톤(Trehalose)"은 대두 유래의 단백질로, 미생물 배지에 영양원으로 주로 사용되며, 대두분리단백질(isolated soy protein)의 단백질의 함량은 약 90%며, 글로불린을 가장 많이 함유하고 있다.
하나의 구체예로, 상기 알긴산을 포함하는 용액은 수크로스, 솔비톨 또는 소이 펩톤, 보다 구체적으로 소이펩톤을 5 중량% 내지 10 중량%, 보다 구체적으로 6 중량% 내지 8 중량%, 더욱 구체적으로 약 7 중량%로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 수크로스, 솔비톨 또는 소이 펩톤이 상기 중량%로 포함되는 경우, 비드의 제조수율이 증가되며, 동결 건조로 인한 유산균의 손상 또는 사멸을 방지하고 안정성을 높이는 동결 보호제의 역할을 수행할 수 있다. 상기 수크로스, 솔비톨 또는 소이 펩톤의 함량이 최적의 범위보다 높은 중량%로 포함되는 경우, 알긴산의 비드 형성을 방해하게 되어, 비드가 치밀하게 형성되지 않아 위산에 의한 보호 효과가 감소하는 문제점이 있다.
하나의 구체예로, 상기 알긴산을 포함하는 용액은 알긴산 나트륨을 1 중량% 내지 3 중량%, 보다 구체적으로 약 2 중량%로 수용화한 것이며, 트레할로스 또는 말토덱스트린을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알긴산 나트륨의 함량이 최적의 범위 보다 낮은 중량%로 포함되는 경우, 비드 경화가 약하게 형성되어 유산균 및 동결보호 성분이 용출될 수 있으며, 최적의 범위보다 높은 중량%로 포함되는 경우, 비드 경화가 너무 강하게되어서 추후 유산균 섭취시 유산균이 잘 나오지 않게되거나, 균이 사멸되는 문제점이 있다.
본 출원에서 용어, "트레할로스(Trehalose)"는 식물이나 미생물등 자연계에 널리 존재하고 있는 당질이다. 본 출원의 목적상, 상기 알긴산을 포함하는 용액에 포함된 트레할로스는 동결 건조로 인해 유산균이 손상 또는 사멸하는 것을 방지하며 재수화 시 그 기능을 회복할 수 있게 도와주는 동결 보호제의 역할을 수행하여, 유산균의 동결 보호 효과를 높일 수 있다.
본 출원에서 용어, "말토덱스트린(Maltodextrin)"은 다공성 입자 기제의 백색 분말로서, 흔히 요구르트, 소스, 샐러드 드레싱 등 일반 식품에 종종 사용되는 식품 첨가물이며, 본 출원의 목적상, 상기 알긴산을 포함하는 용액에 포함된 말토덱스트린은 유산균의 동결 건조 시 다공성 지지체로서 사용될 수 있으며, 동결 건조로 인해 유산균이 손상 또는 사멸하는 것을 방지하는 동결 보호제의 역할을 수행할 수 있다. 상기 다공성 지지체는 다공성 입자성을 가진 기제로서, 외부 수분 및 공기의 유입을 차단하는 역할을 한다.
하나의 구체예로, 상기 트레할로스는 5 중량% 내지 10 중량%, 보다 구체적으로 6 중량% 내지 8 중량%, 더욱 구체적으로 약 7 중량%로 포함될 수 있고, 말토덱스트린은 5 중량% 내지 10 중량%, 보다 구체적으로 6 중량% 내지 8 중량%, 더욱 구체적으로 약 6 중량%로 포함 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 구체예로, 상기 (b) 단계의 혼합물에서 알긴산을 포함하는 용액의 중량과 유산균 중량의 비는 1:1 내지 10:1, 보다 구체적으로 1:1 내지 3:1, 더욱 구체적으로 약 2:1인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유산균의 고형분 중량이 상기 최적의 비율로 포함됨으로써 본 공정의 이용 시 동결 보호 효과 및 유산균 건조 분말 수율을 유지하면서, 공정상에 제조비를 적정 수준으로 유지할 수 있다. 상기 알긴산을 포함하는 용액의 중량과 유산균 중량의 비가 상기 최적의 비율을 벗어나는 경우, 단위시간 및/또는 생산 kg 당 유산균 생산 수율이 감소하여 공정 효율이 낮아지는 문제점이 있다.
또한, 상기 알긴산을 포함하는 용액의 총 고형분 함량을 20 중량% 내지 30 중량%로 포함함으로써, 흐름성(점성)을 유지할 수 있다.
하나의 구체예로, 상기 (b) 단계의 혼합 시, 프리바이오틱스를 임의로 추가 첨가할 수 있다. 구체적으로는 유산균과 코팅제를 혼합시 프리바이오틱스를 추가 첨가하여 혼합할 수 있다. 상기 프리바이오틱스는 유산균의 먹이가 되는 역할을 한다. 상기 프리바이오틱스는 이에 한정되지는 않지만 프락토올리고당, 갈락토올리고당, 말티톨, 락티놀 및 이눌린 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 프락토올리고당 또는 이눌린일 수 있다. 상기 프리바이오틱스는 유산균 중량 대비 0.1중량% 내지 5중량% 일 수 있다.
이어서, (c) 상기 (b) 단계의 혼합물을 칼슘 함유 용액에 첨가하여 알긴산-칼슘 비드를 형성한다.
구체적으로, 상기 (c)단계는 압출 (extrusion) 단계로서, 상기 (b) 단계의 혼합물을 칼슘 함유 용액에 점적(droplets) 또는 분무하여 칼슘 함유 용액과 반응시키면, 알긴산-칼슘 가교결합을 통한 매트릭스 형성으로 인해 칼슘 함유 용액 내에서　유산균이 비드 내부에 포집되고　알긴산-칼슘 비드를 형성할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알긴산-칼슘 반응을 통한 비드 입자 제조는 공정조건이 상온조건(예: 25℃) 아래에서 진행하고, 별도의 물리적인 스트레스가 적어, 생균의 생존율에 미치는 악영향이 적다. 또한, 압출 (extrusion) 방식을 이용한 알긴산-칼슘 비드 입자 형성은 pH 의존성 방출 성질이 있어, 위산과 같은 산성에서는 분해되지 않고, 장내 환경인 중성에서는 서서히 분해되는 특성이 있어, 유산균의 장내 생존율 향상에 큰 도움이 된다.
동결보호제 성분으로서 당류, 단백질류, 지질류 등을 사용할 수 있다. 칼슘 함유 용액에 단백질류를 첨가할 경우, 아미노산의 양극성 성질에 의해 알긴산이 칼슘 이온과 결합하는 것을 방해하여, 치밀한 구조의 알긴산 비드를 형성하는 것을 방해한다. 지질류는 물과 잘 섞이지 않아 칼슘 함유 용액에 사용하기 적합하지 않다. 따라서, 본 출원의 일 실시예에서는 칼슘 함유 용액에 당류를 첨가하여 알긴산 비드의 제조 수율과 생존율을 향상시키는 것을 확인하였다.
구체적으로, 상기 칼슘 함유 용액은 트레할로스 또는 말토덱스트린, 보다 구체적으로 트레할로스를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 트레할로스 또는 말토덱스트린을 포함되는 경우, 비드의 제조수율이 증가되며, 동결 건조로 인한 유산균의 손상 또는 사멸을 방지하고 안정성을 높이는 동결 보호제의 역할을 수행할 수 있다.
하나의 구체예로, 상기 칼슘 함유 용액을 유산균 펠렛과 혼합된 알긴산을 포함하는 용액의 고형분 함량과 유사한 농도로 설정하기 위하여, 상기 칼슘 함유 용액은 트레할로스 또는 말토덱스트린, 보다 구체적으로 트레할로스를, 15 중량% 내지 35 중량%, 보다 구체적으로 20 중량% 내지 30 중량%, 더욱 구체적으로 약 25 중량%로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
(b) 단계의 혼합물과 칼슘 함유 용액의 농도를 유사하게 설정함으로써 점적(droplets) 후 칼슘 함유 용액으로 유산균 및 알긴산을 포함하는 용액의 동결보호제 성분이 용해되는 것을 최대한 억제할 수 있다.
하나의 구체예로, 상기 칼슘 함유 용액은 염화칼슘을 0.5 중량% 내지 1.5 중량%, 보다 구체적으로 약 1 중량%로 수용화한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염화칼슘이 최적의 범위 보다 낮은 중량%로 포함되는 경우, 비드 조직이 치밀하지 않게 생성되어 동결보호 효과가 충분하지 않을 수 있으며, 최적의 범위보다 높은 중량%로 포함되는 경우, 비드 경화가 지나치게 강하게 되어 최종 제품에서 유산균 용출이 충분치 않아 제품화가 어려운 문제점이 있다.
구체적으로, 상기 (c) 단계 이후, 상기 알긴산-칼슘 비드 함유 용액을 4 ℃ 내지 20 ℃의 온도에서 30분 내지 60분간 보관하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이는 숙성 과정으로서, 나트륨 이온이 칼슘 이온으로 치환되면서 알긴산이 망상 구조를 형성하여 캡슐화가 진행되고, 상기 숙성 과정을 거쳐 입자 조직의 치밀성을 높일 수 있다.
본 출원의　방법은 동결 보호제, 다공성 지지체 및 질소원으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 구체적으로, 1종, 2종 및 3종을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의　방법은 상기 알긴산을 포함하는 용액 및 상기 칼슘 함유 용액을 제외하고도, 종래에 동결보호제로서 알려진 성분을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 출원에서　칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균을 제조하기 위하여 추가로 포함되는 "동결 보호제"는 해당 기술분야에서 통상적으로 사용되는 동결 보호 효능을 가지는 물질을 의미한다. 상기 동결 보호제는 시판되는 것을 구입하여 이용할 수 있으며, 그 종류에는 특별한 없다. 구체적으로, 동결 보호제로서 트레할로스, 당류, 아미노산, 펩티드, 젤라틴, 글리세롤, 당알콜, 유청, 알긴산, 아스코르빈산, 효모 추출물, 탈지유 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 상기 "다공성 지지체"는 외부 수분 및 공기의 유입을 차단하고, 동결 건조된 유산균에 다공성을 부여하여 재수화 작용을 용이하게 하는 역할을 한다. 상기 다공성 지지체는 해당 기술분야에서 동결 건조시 통상적으로 사용되는 다공성 지지체로서 시판되는 것을 구입하여 이용할 수 있으며, 특별히 그 종류에 제한이 없다. 구체적으로, 다공성 지지체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 말토덱스트린, 알기네이트, 키토산, 전분, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 트리아세틴, 아세틸트리에틸 시트레이트, 트리에틸 시트레이트, 글리세린, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 출원에서, 상기 "질소원(N-source)"은　유산균의 질소 에너지원으로 사용되는 물질을 의미하며, 이는 후발효에 의한 균체의 손상을 방지하는 역할을 한다.　유산균을 동결 보호용 조성물과 혼합할 경우 에너지원이 없는 조건에서 살아있는　유산균은 유기산을 생성하게 되고, 이는 pH 저하를 일으켜　유산균의 사멸을 유도한다. 따라서, 질소 에너지원은 유기산 생성 및 이로 인한 pH 저하를 방지하므로,　유산균의 사멸을 예방할 수 있게 된다.
상기 질소원은 해당 기술분야에서 동결 건조 시 통상적으로 사용되는 질소원으로서 시판되는 것을 구입하여 이용할 수 있으며, 특별히 그 종류에 제한이 없다. 구체적으로, 질소원은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 탈지 분유, 유청 단백질, 효모 추출물, 맥아 추출물, 비프 추출물, 카세인 가수분해물, 맥아 추출물, 트립톤, 시스테인, 펩톤일 수 있고, 구체적으로 상기 펩톤으로는 소이펩톤, 피쉬 펩톤, 프로테오스 펩톤, 카세인 펩톤, 펩톤 No.3를 포함할 수 있다.
이어서, 임의로 (d) 상기 (c) 단계의 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균을 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 동결 건조 단계는 상기 (c)단계 후 제조된 유산균 포함 알긴산-칼슘 비드를 동결건조 트레이(Tray)에 옮겨 담아, 50시간 동안 -20℃에서 30℃까지 상승시키며 진행할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 방법으로 제조된, 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균을 제공한다.
상기 방법 및 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균은 상기 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 유산균은 칼슘-알긴산 비드로 포집되지 않은 유산균보다 동결건조 후 생존율이 개선된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 유산균은 칼슘-알긴산 비드로 포집되지 않은 유산균보다 안정성이 개선된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 목적상 상기 안정성은 보관(유통) 안정성 또는 위장관내 안정성을 의미하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 고온 안정성, 내산성 또는 내담즙성 등을 의미하는 것일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 (a) 유산균을 배양하여 균체를 회수하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 유산균을 알긴산을 포함하는 용액과 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 혼합물을 칼슘 함유 용액에 첨가하여 알긴산-칼슘 비드를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 알긴산을 포함하는 용액은 수크로스, 솔비톨 또는 소이 펩톤을 포함하는 것이고, 상기 칼슘 함유 용액은 트레할로스 또는 말토덱스트린을 포함하는 것인, 유산균 포집용 칼슘-알긴산 비드의 제조 수율을 개선시키는 방법을 제공한다.
상기 방법 및 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균은 상기 설명한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 (a) 유산균을 배양하여 균체를 회수하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 유산균을 알긴산을 포함하는 용액과 혼합하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 혼합물을 칼슘 함유 용액에 첨가하여 알긴산-칼슘 비드를 형성하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균을 동결건조하는 단계를 포함하고, 상기 알긴산을 포함하는 용액은 수크로스, 솔비톨 또는 소이 펩톤을 포함하는 것이고, 상기 칼슘 함유 용액은 트레할로스 또는 말토덱스트린을 포함하는 것인, 동결 건조된 유산균의 생존율을 개선시키는 방법을 제공한다.
상기 방법 및 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균은 상기 설명한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 방법으로 제조된, 동결 건조되고 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균을 제공한다.
상기 방법 및 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균은 상기 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 유산균은 칼슘-알긴산 비드로 포집되지 않은 유산균보다 동결건조 후 생존율이 개선된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 유산균은 칼슘-알긴산 비드로 포집되지 않은 유산균보다 안정성이 개선된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법은 비드의 제조 수율이 증가되며, 동결 건조 후 생존율 및 안정성이 개선된 유산균을 제공할 수 있다.
도 1은 본 출원의 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 칼슘-알긴산 비드 유무에 따른 위장관내 안정성 평가 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1. 유산균을 포함하는 동결건조 분말의 제조
비교예 1-1. 유산균의 배양
락토바실러스 플란타룸 CJLP133 균주를 MRS 액체 배지(Difco, USA)에, 37℃에서 10시간 동안 배양하였다. 배양액의 유산균은 약 8.68 x 10^9 CFU/mL의 균수를 확인하였다. MRS 배지 성분은 다음과 같이 Proteose Peptone 10g, Beef Extract 10g, Yeast Extract 5g, Dextrose 20g, Polysorbate 80 1g, Ammonium Citrate 2g, Sodium Acetate 5g, Magnesium Sulfate 0.1g, Manganese Sulfate 0.05g, Dipotassium Phosphate 2g 혼합하여 1L 가수 및 수용화하여 멸균하였다.
비교예 1-2. 동결보호제를 포함하는 유산균 용액의 제조
상기 비교예 1-1의 유산균을 배양한 배양액을 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고 Pellet을 확보하였다. 확보한 균체는 멸균된 동결보호제와 1:4의 비율(w/w)로 30분간 교반하여 안정화시켰다. 동결보호제 solution은 Matodextrin 140g, Trehalose 140g, Skim milk 30g, 증류수 690g을 혼합 후 멸균하여 준비하였다.
비교예 1-3. 동결보호제를 포함하는 유산균의 동결건조
상기 비교예 1-2의 유산균을 포함하는 동결보호제는 급속동결 후 동결건조기를 이용하여 건조하였다. 동결건조는 50시간 동안 -20℃에서 30℃까지 상승시키며 진행하였다.
실시예 1. 염화칼슘을 포함하는 칼슘 함유 용액을 이용한 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균 제조 및 동결건조
실시예 1-1. 유산균의 배양
락토바실러스 플란타룸 CJLP133 균주를 MRS 액체 배지(Difco, USA)에, 37℃에서 10시간 동안 배양하였다. 배양액의 유산균은 약 8.68 x 10^9 CFU/mL의 균수를 확인하였다. MRS 배지 성분은 다음과 같이 Proteose Peptone 10g, Beef Extract 10g, Yeast Extract 5g, Dextrose 20g, Polysorbate 80 1g, Ammonium Citrate 2g, Sodium Acetate 5g, Magnesium Sulfate 0.1g, Manganese Sulfate 0.05g, Dipotassium Phosphate 2g 혼합하여 1L 가수 및 수용화하여 멸균하였다.
실시예 1-2. 유산균을 포함하는 알긴산 나트륨 용액의 제조
상기 실시예 1-1의 유산균을 배양한 배양액을 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고 Pellet을 확보하였다. 알긴산을 포함하는 용액(Alginate solution)은 하기 표 1과 같은 구성으로 혼합 후 멸균하여 준비하였다. 확보한 균체는 멸균된 알긴산 나트륨 용액과 1:2의 비율(w/w)로 30분간 교반하여 안정화시켰다.
알긴산 나트륨(Sodium alginate) 20g
트레할로스(Trehalose) 140g
덱스트린(Dextrin) 60g
증류수 780g
실시예 1-3. 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조
칼슘 함유 용액은 하기 표 2와 같은 구성으로 혼합 후 멸균하여 준비하였다.
상기 실시예 1-2의 혼합물을 주사기를 이용하여 칼슘 함유 용액에 점적(drop)하여 칼슘-알긴산 비드를 제조하였다. 이후, 1시간동안 침지하여 나트륨 이온이 칼슘 이온으로 치환되면서 알긴산이 망상 구조를 형성하여 캡슐화가 진행되도록 하였다.
CaCl2 10g
증류수 990g
실시예 1-4. 동결건조
상기 실시예 1-3의 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균은 급속동결 후 동결건조기를 이용하여 건조하였다. 동결건조는 50시간 동안 -20℃에서 30℃까지 상승시키며 진행하였다.
실시예 2. 염화칼슘 및 말토덱스트린을 포함하는 칼슘 함유 용액을 이용한 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균 제조 및 동결건조
상기 실시예 1-3에서 하기 표 3과 같은 구성의 칼슘 함유 용액을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였다.
CaCl2 10g
말토덱스트린 250g
증류수 740g
실시예 3. 염화칼슘 및 트레할로스를 포함하는 칼슘 함유 용액을 이용한 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균 제조 및 동결건조
상기 실시예 1-3에서 하기 표 4과 같은 구성의 칼슘 함유 용액을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였다.
CaCl2 10g
트레할로스 250g
증류수 740g
실시예 4. 수크로스를 포함하는 알긴산을 포함하는 용액을 이용한 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균 제조 및 동결건조
상기 실시예 1-2에서 하기 표 5와 같은 구성의 알긴산을 포함하는 용액을 사용하고,
상기 실시예 1-3에서 하기 표 6과 같은 구성의 칼슘 함유 용액을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였다.
알긴산 나트륨 20g
트레할로스 70g
수크로스 70g
말토덱스트린 60g
증류수 780g
CaCl2 10g
트레할로스 250g
증류수 740g
실시예 5. 솔비톨을 포함하는 알긴산을 포함하는 용액을 이용한 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균 제조 및 동결건조
상기 실시예 1-2에서 하기 표 7와 같은 구성의 알긴산을 포함하는 용액을 사용하고,
상기 실시예 1-3에서 상기 표 6과 같은 구성의 칼슘 함유 용액을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였다.
알긴산 나트륨 20g
트레할로스 70g
솔비톨 70g
말토덱스트린 60g
증류수 780g
실시예 6. 소이 펩톤을 포함하는 알긴산을 포함하는 용액을 이용한 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균 제조 및 동결건조
상기 실시예 1-2에서 하기 표 8와 같은 구성의 알긴산을 포함하는 용액을 사용하고,
상기 실시예 1-3에서 상기 표 6과 같은 구성의 칼슘 함유 용액을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였다.
알긴산 나트륨 20g
트레할로스 70g
소이 펩톤 70g
말토덱스트린 60g
증류수 780g
실험예 1. 칼슘 함유 용액의 구성에 따른 칼슘-알긴산 비드의 제조수율 및 동결건조 후 유산균 생존율 측정
상기 실시예 1 내지 실시예 3의 칼슘-알긴산 비드의 제조수율 및 동결건조 후 유산균 생존율 측정하고자 하였다.
칼슘-알긴산 비드의 제조수율을 구하는 방법은 하기와 같다.
구체적으로, 상기 실시예 1 내지 실시예 3의 유산균 Pellet과 혼합된 알긴산을 포함하는 용액을 적정 농도로 희석하여 MRS agar 배지에 도말하여 균수(cfu/g)를 측정하였다. 또한, 제조한 비드도 적정한 농도로 희석하여 MRS agar 배지에 적정 농도로 도말하여 균수(cfu/g)를 측정하였다. 제조수율 계산을 위하여 측정한 균수를 투입한 알긴산을 포함하는 용액의 무게 및 제조한 비드 무게와 각각 곱하여 총균수를 계산하였다. 측정한 총균수를 비교하여 칼슘-알긴산 비드의 제조수율(before drying)을 측정하였다.
실시예 1 내지 실시예 3의 유산균의 동결건조 후 생존율을 계산하기 위해서 총균수를 계산하였다.
구체적으로, 실시예 1 내지 실시예 3의 동결건조 후 비드의 무게를 측정하고, MRS agar 배지에 적정 농도로 희석 후 도말하여 균수(cfu/g)를 측정하였다. 계산한 총균수를 상기에서 계산한 알긴산을 포함하는 용액의 총균수와 비교하여 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 동결건조 후 생존율(after drying)을 측정하여 각각 하기 표 9 내지 표 11에 나타내었다.
실시예 1 L.plantarum
alginate solution 		제조수율
(before drying)		 동결건조 후
생존율
(After Freezing drying)
Visible cells (cfu/g) 1.00.E+11 6.07.E+10 8.65.E+10
Sol or Bead (g) 210.0 201.4 17.9
Total cells (cfu) 2.10.E+13 1.22.E+13 1.55.E+12
Survival ratio (%) - 58.21 7.38
실시예 2 L.plantarum
alginate solution 		제조수율
(before drying)		 동결건조 후
생존율
(After Freezing drying)
Visible cells (cfu/g) 1.00.E+11 9.05.E+10 8.52.E+10
Sol or Bead (g) 210.0 207.2 47.7
Total cells (cfu) 2.10.E+13 1.88.E+13 4.06.E+12
Survival ratio (%) - 89.29 19.33
실시예 3 L.plantarum
alginate solution 		제조수율
(before drying)		 동결건조 후
생존율
(After Freezing drying)
Visible cells (cfu/g) 1.00.E+11 9.89.E+10 2.03.E+11
Sol or Bead (g) 210.0 206.1 47.4
Total cells (cfu) 2.10.E+13 2.04.E+13 9.60.E+12
Survival ratio (%) - 97.07 45.73
상기 표 9를 참고하면, 상기 실시예 1의 CaCl2로만 구성된 CaCl2 용액을 사용한 경우, 비드 제조수율은 58.21%, 동결건조 후 최종 생존율은 7.38%로 매우 낮은 것을 확인 할 수 있었다.
상기 표 10을 참고하면, 상기 실시예 2의 말토덱스트린이 25% 첨가된 CaCl2 용액을 사용한 경우, 비드 제조수율은 89.29%, 동결건조 후 최종 생존율은 19.33%으로 상기 실시예 1보다 향상된 것을 확인하였다. 이는 알긴산 함유 용액과 유사한 농도인 25%의 말토덱스트린으로 인하여 비드 제조 수율이 크게 향상되면서 그에 따른 동결건조 생존율도 개선된 것을 시사하는 것이다.
상기 표 11을 참고하면, 상기 실시예 3의 트레할로스가 25% 첨가된 CaCl2 용액을 사용한 경우, 비드 제조수율은 97.07%, 동결건조 후 최종 생존율은 45.73%으로 그 결과가 더욱 개선된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 알긴산을 포함하는 용액의 구성에 따른 칼슘-알긴산 비드의 제조수율 및 동결건조 후 유산균 생존율 측정
상기 실험예 1과 동일한 방법으로, 상기 실시예 4 내지 실시예 6의 칼슘-알긴산 비드의 제조수율 및 동결건조 후 유산균 생존율 측정하여 하기 표 12 내지 표 14에 나타내었다.
실시예 4 L.plantarum
alginate solution 		제조수율
(before drying)		 동결건조 후
생존율
(After Freezing drying)
Visible cells (cfu/g) 8.90.E+10 1.05.E+11 1.86.E+11
Sol or Bead (g) 210.0 168.8 50.8
Total cells (cfu) 1.87.E+13 1.77.E+13 9.44.E+12
Survival ratio (%) - 94.86 50.52
실시예 5 L.plantarum
alginate solution 		제조수율
(before drying)		 동결건조 후
생존율
(After Freezing drying)
Visible cells (cfu/g) 8.90.E+10 1.02.E+11 2.58.E+11
Sol or Bead (g) 210.0 167.5 49.5
Total cells (cfu) 1.87.E+13 1.71.E+13 1.28.E+13
Survival ratio (%) - 91.42 68.31
실시예 6 L.plantarum
alginate solution 		제조수율
(before drying)		 동결건조 후
생존율
(After Freezing drying)
Visible cells (cfu/g) 1.00.E+11 1.10.E+11 3.80.E+11
Sol or Bead (g) 210.0 188.5 47.7
Total cells (cfu) 2.10.E+13 2.07.E+13 1.81.E+13
Survival ratio (%) - 98.72 86.32
상기 표 12를 참고하면, 상기 실시예 4의 수크로스를 포함하는 알긴산을 포함하는 용액을 사용한 경우, 비드 제조수율은 94.3%, 동결건조 후 최종 생존율은 50.44%로 실시예 3과 유사한 수준의 결과를 보여주었다.
상기 표 13을 참고하면, 상기 실시예 5의 솔비톨을 포함하는 알긴산을 포함하는 용액을 사용한 경우, 비드 제조수율은 91.49%, 동결건조 후 최종 생존율은 68.36%으로 상기 실시예 4보다 향상된 것을 확인하였다.
상기 표 14를 참고하면, 상기 실시예 6의 소이 펩톤을 포함하는 알긴산을 포함하는 용액을 사용한 경우, 비드 제조수율은 98.77%, 동결건조 후 최종 생존율은 86.35%로 그 결과가 매우 개선된 것을 확인할 수 있었다. 이에, 비드 제조수율 및 유산균의 동결건조 보호 효과가 극대화되는 최적의 조성을 확인하였다.
실험예 3. 칼슘-알긴산 비드 유무에 따른 고온 안정성 평가
상기 실시예 6 및 비교예의 고온 안정성을 비교하고자 하였다. 구체적으로, 동결건조 분말화한 비교예 및 실시예 6의 시료를 알루미늄 파우치 포장에 일정량을 담아 개별 포장하여 밀봉하였다. 시료는 각각 40 ℃ 인큐베이터에 12주간 보관하였다. 각 저장기간별 유산균 감소량을 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 유산균 감소량은 비교예의 경우 1.674log가 감소하였으나, 실시예 6의 경우 1.027log가 감소하여 본 출원의 방법으로 제조한 유산균의 고온 안정성이 향상된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 칼슘-알긴산 비드 유무에 따른 위장관내 안정성 평가
상기 실시예 6 및 비교예의 위장관내 안정성을 비교하고자 하였다.
구체적으로, 위장관 모사(SSDP, simulated stomach duodenum passage)에 따른 내산성 및 내담즙성 실험을 통한 생존율을 비교하였다.
내산성 실험을 위해 MRS broth에 5N 염산(HCl)을 첨가하여 pH3의 Acidic MRS broth를 제조하였다. 내담즙성 실험 위해서는 10% Oxgall solution 과 인공담즙액 Buffer를 제조하였다.
유산균 생존율 비교를 위해 Acidic MRS에 비교예에서 제조한 동결건조 분말과, 실시예 6에서 제조한 동결건조 분말을 넣고 37℃에서 1시간동안 반응하였다. 이후 10% Oxgall solution과 Buffer를 추가하여 pH를 7로 보정 후 2시간 동안 반응시킨 후 샘플링하여 유산균의 생존율을 확인하였다. 그 결과는 하기 표 15에 나타내었다.
　 초기균수(cfu/g) 테스트결과(cfu/g) 생존율(%)
비교예 2.45.E+11 9.02.E+08 0.37
실시예 6 9.16.E+10 3.21.E+10 34.94
상기 표 15를 참고하면, 비교예의 유산균은 0.37%의 생존율을 보인 반면, 실시예 6의 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균은 34.94%의 생존율을 보여 내산성 및 내담즙성이 크게 향상된 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. (a) 유산균을 배양하여 균체를 회수하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 유산균을 알긴산을 포함하는 용액과 혼합하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 혼합물을 칼슘 함유 용액에 첨가하여 알긴산-칼슘 비드를 형성하는 단계를 포함하고,
    상기 알긴산을 포함하는 용액은 수크로스, 솔비톨 또는 소이 펩톤을 포함하는 것이고,
    상기 칼슘 함유 용액은 트레할로스 또는 말토덱스트린을 포함하는 것인, 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, (d) 상기 (c) 단계의 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기　유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus　sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacteriumsp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcussp.), 엔테로코커스 속(Enterococcussp.), 페디오코커스 속(Pediococcussp.) 류코노스톡 속(Leuconostocsp.) 및 비셀라 속(Weissellasp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기　유산균은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus　plantarum), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus　casei), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus　rhamnosus), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium　bifidum), 비피도박테리움 롱굼 (Bifidobacteriumlongum), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacteriumbreve), 스트렙토코커스 훼칼리스 (Streptococcus faecalis) 및 락토코커스 락티스 (Lactococcuslactissubsp.　lactis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인,　방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기　유산균은 락토바실러스 플란타룸 CJLP133(Lactobacillus　plantarum CJLP133), 락토바실러스 플란타룸 CJLP243(Lactobacillus　plantarum CJLP243), 락토바실러스 플란타룸 CJLP136 (Lactobacillus　plantarum CJLP136), 락토바실러스 플란타룸 CJLP55 (Lactobacillus　plantarum CJLP55) 및 락토바실러스 플란타룸 CJLP56(Lactobacillus　plantarum CJLP56)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유산균은 칼슘-알긴산 비드로 포집되지 않은 유산균보다 동결건조 후 생존율이 개선된 것인, 유산균.
  8. 제6항에 있어서, 상기 유산균은 칼슘-알긴산 비드로 포집되지 않은 유산균보다 안정성이 개선된 것인, 유산균.
  9. (a) 유산균을 배양하여 균체를 회수하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 유산균을 알긴산을 포함하는 용액과 혼합하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 혼합물을 칼슘 함유 용액에 첨가하여 알긴산-칼슘 비드를 형성하는 단계를 포함하고,
    상기 알긴산을 포함하는 용액은 수크로스, 솔비톨 또는 소이 펩톤을 포함하는 것이고,
    상기 칼슘 함유 용액은 트레할로스 또는 말토덱스트린을 포함하는 것인, 유산균 포집용 칼슘-알긴산 비드의 제조 수율을 개선시키는 방법.
  10. (a) 유산균을 배양하여 균체를 회수하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 유산균을 알긴산을 포함하는 용액과 혼합하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 혼합물을 칼슘 함유 용액에 첨가하여 알긴산-칼슘 비드를 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 칼슘-알긴산 비드로 포집된 유산균을 동결건조하는 단계를 포함하고,
    상기 알긴산을 포함하는 용액은 수크로스, 솔비톨 또는 소이 펩톤을 포함하는 것이고,
    상기 칼슘 함유 용액은 트레할로스 또는 말토덱스트린을 포함하는 것인, 동결 건조된 유산균의 생존율을 개선시키는 방법.
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