CN115786124A - 一种菌体冻干保护剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种菌体冻干保护剂及其用途。其中，所述菌体冻干保护剂包括透明质酸或其盐和鼠李糖。使用本申请的菌体冻干保护剂制备的动物双歧杆菌冻干粉，冻干存活率接近90％，有效解决了动物双歧杆菌冻干粉活菌率低的问题，有利于拓展动物双歧杆菌的商业价值。本申请的冻干保护剂可以应用到动物双歧杆菌的生产中，可以根据需要制成胶囊剂、片剂、粉剂等不同产品形式。

Description

一种菌体冻干保护剂及其用途

技术领域

本申请属于微生物技术领域，具体地，涉及一种菌体冻干保护剂及其用途。

背景技术

动物双歧杆菌是人和许多哺乳动物肠道中的一种有益菌，在免疫、营养和消化等一系列生理过程中发挥着重要的功能。动物双歧杆菌可以抑制外源性致病菌在肠道内的定植，能够合成各种维生素、必需氨基酸和短链脂肪酸等营养物质供机体利用。除此之外，还具有调节机体免疫、调理肠胃功能和降低胆固醇等作用。专利CN 113897300A公开了一株动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160，具有改善皮肤屏障功能损伤与皮肤敏感的作用，不仅能显著提高SDS诱导HaCaT细胞的存活率和改善相应的屏障损伤，而且能显著促进细胞迁移和天然保湿因子及屏障完整性因子AQP-3的表达，在制备预防或治疗皮肤屏障损伤的产品中具有巨大的应用前景。

当前，动物双歧杆菌主要是通过冷冻干燥将其制成冻干粉末以延长活菌保存期，但是在冷冻干燥过程中，由于动物双歧杆菌易发生低温胁迫、冻结损伤等从而导致细胞膜通透性发生改变、动物双歧杆菌菌株活性降低。因此，在冻干之前，往往需要添加特定的冻干保护剂以提升动物双歧杆菌的冻干存活率。但是由于动物双歧杆菌的菌株特异性和冻干保护剂的成分不同，冻干存活率之间也存在较大差异。当采用常规冻干保护剂(如脱脂奶粉和蔗糖等)时，动物双歧杆菌的冻干存活率较低，大大限制了其商业价值。因此，开发性质独特、作用高效的动物双歧杆菌冻干保护剂是目前急需解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本申请提供一种菌体冻干保护剂及其用途。

具体来说，本申请涉及如下方面：

1.透明质酸或其盐和鼠李糖在制备菌体冻干保护剂中的应用。

2.透明质酸或其盐和鼠李糖在提高菌体冻干存活率中的应用。

3.根据项1或2所述的应用，其特征在于，所述透明质酸或其盐的分子量为40-200万Da，所述透明质酸或其盐和鼠李糖的质量比为1：(0.42-300)，优选地，所述透明质酸或其盐的分子量为70-150万Da，所述透明质酸或其盐和鼠李糖的质量比为1：(1-100)。

4.一种菌体冻干保护剂，其特征在于，所述菌体冻干保护剂包括透明质酸或其盐和鼠李糖。

5.根据项4所述的菌体冻干保护剂，其特征在于，所述菌体冻干保护剂中，所述透明质酸或其盐的分子量为40-200万Da，所述透明质酸或其盐和鼠李糖的质量比为1：(0.42-300)，优选地，所述透明质酸或其盐的分子量为70-150万Da，所述透明质酸或其盐和鼠李糖的质量比为1：(1-100)。

6.根据项4所述的菌体冻干保护剂，其特征在于，所述菌体冻干保护剂还包括脱脂奶粉、乳清蛋白、胶原蛋白、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、乳糖醇、低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、甘油、山梨糖醇、木糖醇、海藻糖、水苏糖、菊粉、麦芽糊精、抗性糊精中的一种或者两种以上，优选地，脱脂奶粉含量为50-200g/L，蔗糖的含量为10-80g/L。

7.根据项1-3中任一项所述的应用或者项4-6中任一项所述的菌体冻干保护剂，其特征在于，所述菌体为动物双歧杆菌。

8.一种菌体的冻干方法，其特征在于，使用项4-6中任一项所述的菌体冻干保护剂。

9.根据项8所述的菌体的冻干方法，其特征在于，所述冻干方法包括将菌体的菌泥与所述冻干保护剂混合之后进行冷冻干燥，其中所述冻干保护剂与所述菌泥的质量比为1：(0.25-4)。

10.一种菌体冻干粉，其特征在于，所述菌体冻干粉包括菌体、透明质酸或其盐和鼠李糖，

优选地，所述菌体冻干粉由项8或9所述的冻干方法制备得到。

本申请提供了一种可以显著提高动物双歧杆菌冻干存活率的冻干保护剂，此冻干保护剂的成分包含鼠李糖、透明质酸或其盐，其中透明质酸或其盐的平均分子量为40-200万Da，优选70-150万Da，使用此冻干保护剂制备的动物双歧杆菌冻干粉，冻干存活率接近90％，有效解决了动物双歧杆菌冻干粉活菌率低的问题，有利于拓展动物双歧杆菌的商业价值。本申请的冻干保护剂可以应用到动物双歧杆菌的生产中，可以根据需要制成胶囊剂、片剂、粉剂等不同产品形式。

附图说明

图1为不同分子量HA的冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干存活率；

图2为不同HA添加量的冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干存活率；

图3为不同鼠李糖添加量的冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干存活率；

图4为不同透明质酸和鼠李糖添加量的冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干存活率；

图5为动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干存活率；

图6为不同动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干存活率。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。

本申请提供一种菌体冻干保护剂，其包括透明质酸或其盐和鼠李糖。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种天然的高分子酸性黏多糖，广泛分布在动物和人体组织及细胞外基质中，其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能。HA的分子量分布广泛，Mr一般为2×10³-7×10⁶Da。HA溶液的浓度或者Mr越大，HA分子的缠绕程度越高，粘度越大。HA溶液由于含有分子网状结构，可同时具有凝胶的弹性和溶液的黏性这一双重特征。

其中，透明质酸或其盐可以涵盖各种分子量的透明质酸或其盐。

透明质酸盐可以为透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸锌、透明质酸钙、透明质酸镁等。

在一个具体的实施方式中，所述透明质酸或其盐的分子量为40-200万Da，例如可以为40万Da、50万Da、60万Da、70万Da、80万Da、90万Da、100万Da、110万Da、120万Da、130万Da、140万Da、150万Da、160万Da、170万Da、180万Da、190万Da、200万Da。

在一个具体的实施方式中，所述透明质酸或其盐的分子量为70-150万Da。

鼠李糖又称6-脱氧-L-甘露糖，是一种有机化合物，分子式为C₆H₁₂O₅是一种广泛存在于植物的多糖、糖苷、植物胶和细菌多糖中的一种物质。在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂还包括辅料。

具体地，所述辅料为菌体冻干保护剂所用的公知性辅料，例如所述的辅料可以为脱脂奶粉、乳清蛋白、胶原蛋白、葡萄糖、和蔗糖、半乳糖、乳糖、乳糖醇、低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、甘油、山梨糖醇、木糖醇、海藻糖、水苏糖、菊粉、麦芽糊精、抗性糊精中的一种或者多种。在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、分子量为70-150万Da的透明质酸钠、鼠李糖和水。

在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂中，透明质酸或其盐和鼠李糖质量比为1：(0.42-300)，具体地，其质量比可以为1：0.42；1：1；1：2；1：3；1：4；1：5；1：10；1：15；1：20；1：25；1：30；1：35；1：40；1：45；1：50；1：55；1：60；1：65；1：70；1：75；1：80；1：85；1：90；1：95；1：100；1：105；1：110；1：115；1：120；1：125；1：130；1：135；1：140；1：145；1：150；1：155；1：160；1：165；1：170；1：175；1：180；1：185；1：190；1：195；1：200；1：205；1：210；1：215；1：220；1：225；1：230；1：235；1：240；1：245；1：250；1：255；1：260；1：265；1：270；1：275；1：280；1：285；1：290；1：295；1：300。

在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂中，脱脂奶粉的含量为50-200g/L，蔗糖的含量为10-80g/L，透明质酸或其盐的含量为1-10g/L，鼠李糖的含量为10-100g/L。

在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂中，脱脂奶粉的含量为50-200g/L，蔗糖的含量为10-80g/L，透明质酸或其盐的含量为2-7g/L，鼠李糖的含量为30-70g/L。

在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、分子量为40-200万Da的透明质酸钠、鼠李糖和水，其中脱脂奶粉的含量为50-200g/L，蔗糖的含量为10-80g/L，透明质酸或其盐的含量为2-7g/L，鼠李糖的含量为30-70g/L。

在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、分子量为70-150万Da的透明质酸钠、鼠李糖和水，其中脱脂奶粉的含量为50-200g/L，蔗糖的含量为10-80g/L，透明质酸或其盐的含量为1-10g/L，鼠李糖的含量为10-100g/L。

在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、分子量为110万Da的透明质酸钠、鼠李糖和水，其中脱脂奶粉的含量为100g/L，蔗糖的含量为30g/L，透明质酸或其盐的含量为4g/L，鼠李糖的含量为50g/L。

在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂由脱脂奶粉、蔗糖、透明质酸或其盐、鼠李糖和水组成。

在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、分子量为40-200万Da的透明质酸钠、鼠李糖和水，其中脱脂奶粉的含量为50-200g/L，蔗糖的含量为10-80g/L，透明质酸或其盐的含量为2-7g/L，鼠李糖的含量为30-70g/L，余量为水。

在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、分子量为70-150万Da的透明质酸钠、鼠李糖和水，其中脱脂奶粉的含量为50-200g/L，蔗糖的含量为10-80g/L，透明质酸或其盐的含量为1-10g/L，鼠李糖的含量为10-100g/L，余量为水。

在一个具体的实施方式中，所述菌体冻干保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、分子量为110万Da的透明质酸钠、鼠李糖和水，其中脱脂奶粉的含量为100g/L，蔗糖的含量为30g/L，透明质酸或其盐的含量为4g/L，鼠李糖的含量为50g/L，余量为水。

在一个具体的实施方式中，所述菌体为双歧杆菌。

在一个具体的实施方式中，所述菌体为动物双歧杆菌。

在一个具体的实施方式中，所述菌体为动物双歧杆菌乳亚种。

在一个具体的实施方式中，所述菌体为动物双歧杆菌动物亚种。

本申请的菌体冻干保护剂中，鼠李糖和分子量为40-200万Da的透明质酸或其盐复配对于提升菌体的冻干存活率具有协同增效的作用。

本申请还提供一种菌体的冻干方法，其使用上述的任意一种菌体冻干保护剂。

在一个具体的实施方式中，所述菌体的冻干方法包括将菌体的菌泥与所述冻干保护剂混合之后进行冷冻干燥，其中所述冻干保护剂与所述菌泥的质量比为1：(0.25-4)，例如可以为1:0.25、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4等。

其中，菌泥为菌液离心后得到的固体沉淀。

在一个具体的实施方式中，菌泥通过以下方式得到：

将菌液在4℃8000×g下离心20min弃去上清液，然后将菌泥用PBS缓冲液在相同离心条件下洗涤两次。

冷冻干燥的方法可以采用本领域已知的工艺进行。

在一个具体的实施方式中，冷冻干燥包括预冻、一次干燥和二次干燥，具体包括以下步骤：

预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h；一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h；二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。

本申请的菌体冻干保护剂用于动物双歧杆菌冻干过程，可以使冻干后的动物双歧杆菌冻干存活率接近90％。

本申请还提供一种菌体冻干粉，其包括菌体、透明质酸或其盐和鼠李糖。

所述菌体冻干粉还可以包括辅料，其中辅料的种类如上所述。

在一个具体的实施方式中，菌体冻干粉，其包括菌体、脱脂奶粉、蔗糖、透明质酸或其盐和鼠李糖。

进一步地，所述菌体冻干粉通过上述任意一种菌体的冻干方法制备得到。

本申请还提供上述任意一种菌体冻干保护剂在提高菌体冻干存活率中的用途。

本申请还提供透明质酸或其盐和鼠李糖在制备菌体冻干保护剂中的应用。

在一个具体的实施方式中，透明质酸或其盐的分子量为40-200万Da，透明质酸或其盐的含量为0.5-12g/L，鼠李糖的含量为5-150g/L。例如，透明质酸或其盐的含量可以为0.5g/L、1.0g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L；鼠李糖的含量可以为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、110g/L、115g/L、120g/L、125g/L、130g/L、135g/L、140g/L、145g/L、150g/L。

在一个具体的实施方式中，透明质酸或其盐的分子量为70-150万Da，透明质酸或其盐的含量为1-10g/L，鼠李糖的含量为10-100g/L。

本申请提供一种包含透明质酸或其盐和鼠李糖的冻干保护剂，使用该冻干保护剂可以显著提高动物双歧杆菌的冻干存活率。尤其是当冻干保护剂中透明质酸或其盐的分子量为70-150万Da，透明质酸或其盐的含量为1-10g/L，鼠李糖的含量为10-100g/L时，采用该冻干保护剂制备的动物双歧杆菌冻干粉的冻干存活率最高可接近90％，有效解决了动物双歧杆菌冻干粉活菌率低的问题。

实施例

下述实施例中涉及的透明质酸或其盐由华熙生物科技股份有限公司提供；下述实施例中涉及的鼠李糖购自北京伊诺凯科技有限公司；下述实施例中涉及的脱脂奶粉购自索莱宝；下述实施例中涉及的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160记载于公开号为CN 113897300A的专利申请文本中，保藏编号为GDMCC No.61500；下述实施例中涉及的动物双歧杆菌动物亚种CGMCC 1.1852购自中国普通微生物菌体保藏管理中心；下述实施例中涉及的其他冻干保护剂成分及培养基成分购自国药集团化学试剂有限公司。

下述实施例中涉及的培养基及溶液如下：

MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O0.1g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L；灭菌温度：115℃灭菌20min。

MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O0.1g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L；灭菌温度：115℃灭菌20min。

PBS缓冲液：L-半胱氨酸磷酸盐0.5g/L、七水合磷酸氢二钠2.2g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、氯化钾0.2g/L、NaCL 8g/L、pH6.8～7.0；灭菌温度：115℃灭菌20min；操作时提前放置于4℃，避免菌体产酸。

冻干保护剂配制：按照下述实施例配制相应的冻干保护剂，其中：海藻糖溶液、山梨糖醇溶液、麦芽糊精溶液、海藻酸钠溶液、鼠李糖溶液、蔗糖溶液115℃灭菌20min；透明质酸钠溶液、抗坏血酸溶液、谷氨酸钠溶液、L-半胱氨酸盐酸盐溶液过膜灭菌；脱脂奶粉溶液105℃灭菌10min。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

动物双歧杆菌冻干前活菌数的检测方法：参考国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。

动物双歧杆菌冻干后活菌数的检测方法：向冻干后的样品中加入一定量的无菌PBS缓冲液，使其复水至冻干前的质量，活菌计数操作同冻干前。

动物双歧杆菌冻干存活率(％)的计算公式为：

金氏公式计算方法：q＝E(A+B)/[EA+EB-EA*EB]

式中：q为系统作用系数，EA与EB为A和B单独使用时的效果；E(A+B)为两者合用的效果。q＝0.85-1.15为单纯相加；1.15＜q＜20为增强；q＞20为明显增强；q＜0.56-0.85为拮抗；q＜0.55为明显拮抗。

实施例1组合物中不同分子量HA对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干存活率的影响

具体步骤如下：

(1)收集菌体：取保藏于-80℃的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160甘油保菌管于4℃解冻，用接种环蘸取保菌管中的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160在MRS固体培养基上划线，置于37℃的厌氧工作站培养36-48h得到单菌落；挑取单菌落接入MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-24h；取菌液按照2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-16h得到种子液；将种子液按2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧静止培养12-16h至稳定期，得到菌液；将菌液在4℃8000×g下离心20min弃去上清液，然后将菌泥用PBS缓冲液在相同离心条件下洗涤两次；将菌泥置于4℃下备用。

(2)本实验以菌种冻干保护剂的常规辅料100g/L脱脂奶粉+30g/L蔗糖为动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干保护剂的基础配方。本实施例在基础配方的基础上，添加不同分子量的透明质酸钠配置相应的冻干保护剂，其中透明质酸钠的平均分子量为9wDa、40wDa、70wDa、110wDa、150wDa和200wDa，具体如表1所示。

(3)将菌泥分别与冻干保护剂按照质量比1:1进行混合，然后再进行冷冻干燥，得到动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干菌粉。将冻干前后的样品进行称重。

(4)冷冻干燥工艺：包括预冻、一次干燥和二次干燥。预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h；一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h；二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。冻干完成后，冻干瓶塞盖子密封，保存至-20℃用于后续测定。

(5)检测动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数，并且计算相应的冻干存活率。

表1不同分子量HA的冻干粉配方及动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数及冻干存活率

不同组的配方和冻干存活率结果如表1和图1所示，其中***表示实验组vs空白组有极显著差异，p<0.001。

由表1和图1可知：不同分子量的HA对冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率影响不同。当采用平均分子量为9万Da的HA时，与空白组相比，动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率无显著性差异(p>0.05)；当采用平均分子量为40、70、110、150和200万Da的HA时，与空白组相比，动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率有极显著差异(p<0.001)，尤其是平均分子量为70、110和150万Da的HA，其冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数分别达到(1.44±0.08)×10¹¹CFU/mL、(1.74±0.11)×10¹¹CFU/mL和(1.51±0.08)×10¹¹CFU/mL，冻干存活率分别为30.37％、36.86％和31.99％，冻干存活率约是空白组的2.46倍、2.99倍和2.59倍，冻干效果比200万Da(24.74％)和9万Da(13.88％)的HA效果显著。

实施例2组合物中HA不同添加量对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干存活率的影响

具体步骤如下：

(1)收集菌体：取保藏于-80℃的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160甘油保菌管于4℃解冻，用接种环蘸取保菌管中的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160在MRS固体培养基上划线，置于37℃的厌氧工作站培养36-48h得到单菌落；挑取单菌落接入MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-24h；取菌液按照2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-16h得到种子液；将种子液按2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧静止培养12-16h至稳定期，得到菌液；将菌液在4℃8000×g下离心20min弃去上清液，然后将菌泥用PBS缓冲液在相同离心条件下洗涤两次；将菌泥置于4℃下备用。

(2)在实施例1基础上选择平均分子量为110万Da透明质酸钠进行添加量试验，研究110万Da透明质酸钠的不同添加量(0.5、1、2、4、7、10g/L)对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的保护效果，具体如表2所示。

(3)将菌泥分别与冻干保护剂按照质量比1:1进行混合，然后再进行冷冻干燥，得到动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干菌粉。将冻干前后的样品进行称重。

(4)冷冻干燥工艺：包括预冻、一次干燥和二次干燥。预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h；一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h；二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。冻干完成后，冻干瓶塞盖子密封，保存至-20℃用于后续测定。

(5)检测动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数，并且计算相应的冻干存活率。

表2不同HA添加量的冻干粉配方及动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数及冻干存活率

不同组的配方和冻干存活率结果如表2和图2所示，其中***表示实验组vs空白组有极显著差异，p<0.001。

由表2和图2可知：当HA添加量>0.5g/L时，对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率有极显著影响(p<0.001)。当HA添加量为0-4g/L时，动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率随着HA添加量的增加呈快速上升趋势，且在HA添加量为4g/L时，动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数达到(2.79±0.12)×10¹¹CFU/mL，冻干存活率达到最大值(58.99％)，冻干存活率约是对照组的4.78倍；当HA添加量为4-10g/L时，随着HA添加量的增加动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率呈下降趋势。除此之外，当HA添加量为2-7g/L时，动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干存活率达到45％以上。

实施例3组合物中鼠李糖不同添加量对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干存活率的影响

具体步骤如下：

(1)收集菌体：取保藏于-80℃的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160甘油保菌管于4℃解冻，用接种环蘸取保菌管中的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160在MRS固体培养基上划线，置于37℃的厌氧工作站培养36-48h得到单菌落；挑取单菌落接入MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-24h；取菌液按照2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-16h得到种子液；将种子液按2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧静止培养12-16h至稳定期，得到菌液；将菌液在4℃8000×g下离心20min弃去上清液，然后将菌泥用PBS缓冲液在相同离心条件下洗涤两次；将菌泥置于4℃下备用。

(2)本实施例以100g/L脱脂奶粉+30g/L蔗糖为动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干保护剂的基础配方，考察添加不同量鼠李糖(5、10、30、50、70和100g/L)对冻干存活率的影响，具体如表3所示。

(3)将菌泥分别与冻干保护剂按照质量比1:1进行混合，然后再进行冷冻干燥，得到动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干菌粉。将冻干前后的样品进行称重。

(4)冷冻干燥工艺：包括预冻、一次干燥和二次干燥。预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h；一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h；二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。冻干完成后，冻干瓶塞盖子密封，保存至-20℃用于后续测定。

(5)检测动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数，并且计算相应的冻干存活率。

表3鼠李糖不同添加量的冻干粉配方及动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率

不同组的配方和冻干存活率结果如表3和图3所示，其中*表示实验组vs空白组有显著差异，p<0.05；***表示实验组vs空白组有极显著差异，p<0.001。

由表3和图3可知：添加5g/L的鼠李糖对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数及冻干存活率没有显著影响(p>0.05)；添加10g/L的鼠李糖对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率有显著影响(p<0.05)，冻干存活率提高了44.42％。当鼠李糖添加量在30-100g/L时，与空白组相比，动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率均有极显著差异(p<0.001)。当鼠李糖添加量在0-50g/L时，活菌数和冻干存活率呈快速增长；当添加量为50-100g/L时，冻干存活率缓慢增长趋于平稳，且在添加量为100g/L时，有最大活菌数(1.97±0.10)×10¹¹CFU/mL和最大冻干存活率41.72％。综合原料成本考虑，鼠李糖添加量为50g/L时经济效益最佳，此时动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数为(1.79±0.09)×10¹¹CFU/mL，冻干存活率为37.77％，冻干存活率约是空白组的3.01倍。

实施例4透明质酸鼠李糖组合物对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干存活率的影响

具体步骤如下：

(1)收集菌体：取保藏于-80℃的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160甘油保菌管于4℃解冻，用接种环蘸取保菌管中的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160在MRS固体培养基上划线，置于37℃的厌氧工作站培养36-48h得到单菌落；挑取单菌落接入MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-24h；取菌液按照2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-16h得到种子液；将种子液按2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧静止培养12-16h至稳定期，得到菌液；将菌液在4℃8000×g下离心20min弃去上清液，然后将菌泥用PBS缓冲液在相同离心条件下洗涤两次；将菌泥置于4℃下备用。

(2)本实施例以100g/L脱脂奶粉+30g/L蔗糖为动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干保护剂的基础配方，考察添加不同含量透明质酸钠和鼠李糖对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干存活率的影响，具体如表4所示。

(3)将菌泥分别与冻干保护剂按照质量比1:1进行混合，然后再进行冷冻干燥，得到动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干菌粉。将冻干前后的样品进行称重。

(4)冷冻干燥工艺：包括预冻、一次干燥和二次干燥。预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h；一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h；二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。冻干完成后，冻干瓶塞盖子密封，保存至-20℃用于后续测定。

(5)检测动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数，并且计算相应的冻干存活率。

表4添加不同量透明质酸和鼠李糖的冻干粉配方及动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率

不同组的配方和冻干存活率结果如表4和图4所示，表4中^&表示数据来源于实施例3，图4中**表示空白组vs实验组有显著差异，p<0.01；***表示空白组vs实验组有极显著差异，p<0.001；###表示对照组vs组合物组有极显著差异，p<0.001。

由表4和图4可知：空白组与对照组b、c、d、f、g、h和组合物B、C、D之间存在显著差异(p<0.01或p<0.001)，与对照组a、e、i和组合物A、E之间无显著差异(p>0.05)。组合物B、C和D的活菌数分别达到(3.21±0.10)×10¹¹、(4.22±0.13)×10¹¹和(2.66±0.10)×10¹¹CFU/mL，冻干存活率分别达到67.74％、89.13％和56.10％，冻干存活率分别是空白组的5.38倍、7.08倍和4.46倍。除此之外，对照组a、e与组合物A之间无显著差异(p>0.05)，对照组d、f与组合物B之间存在极显著差异(p<0.001)，对照组c、g与组合物C之间存在极显著差异(p<0.001)，对照组b、h与组合物D之间存在极显著差异(p<0.001)，对照组a、i与组合物E之间无显著差异(p>0.05)。根据金氏公式计算，组合物B、C和D的冻干存活率增效指数q分别为1.62、2.36和3.10，均大于1.15，说明鼠李糖和透明质酸复配对于提升动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干存活率有协同增效作用。

实施例5冻干保护剂与菌泥比例对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干存活率的影响

具体步骤如下：

(1)收集菌体：取保藏于-80℃的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160甘油保菌管于4℃解冻，用接种环蘸取保菌管中的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160在MRS固体培养基上划线，置于37℃的厌氧工作站培养36-48h得到单菌落；挑取单菌落接入MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-24h；取菌液按照2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-16h得到种子液；将种子液按2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧静止培养12-16h至稳定期，得到菌液；将菌液在4℃8000×g下离心20min弃去上清液，然后将菌泥用PBS缓冲液在相同离心条件下洗涤两次；将菌泥置于4℃下备用。

(2)按照表5配置相应的冻干保护剂，之后将冻干保护剂与菌泥分别按照8:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4和1:8的质量比混合，具体如表5所示，得到相应混合液，再进行冷冻干燥，得到动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干菌粉。将冻干前后的样品进行称重。

(3)冷冻干燥工艺：包括预冻、一次干燥和二次干燥。预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h；一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h；二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。冻干完成后，冻干瓶塞盖子密封，保存至-20℃用于后续测定。

(4)检测动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干粉中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数，并且计算相应的冻干存活率。

表5动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干保护剂的配制及动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数和冻干存活率

不同组的配方和冻干存活率结果如表5和图5所示。图5中**表示实验组(X)vs空白组(X)有显著差异，p<0.01；***表示实验组(X)vs空白组(X)有极显著差异，p<0.001；###表示实验组与(保护剂1:1)组间有极显著差异，p<0.001。

由表5和图5可知：冻干保护剂与菌泥比例为8:1-1:4时，与对应的空白组相比活菌数和冻干存活率均有极显著提升(p<0.001)，冻干保护剂与菌泥比例为1:8时呈显著性差异(p<0.01)。当冻干保护剂与菌泥比例从8:1降为1:1时，活菌数不断增加，但冻干存活率几乎无变化，冻干保护剂与菌泥比例为1:1时活菌数分别是比例为8:1、4:1和2:1的4.59、2.51和1.52倍，从经济效益来讲，冻干保护剂与菌泥比例为1:1时效益最佳，而冻干保护剂与菌泥比例为8:1时，虽然冻干存活率可以达到87.25％，但活菌数仅有(9.07±0.27)×10¹⁰CFU/mL，活菌数太低。当冻干保护剂与菌泥比例从1:1降为1:8时，冻干存活率呈快速下降趋势，活菌数先小幅上升后快速下降，冻干保护剂与菌泥比例为1:1时冻干存活率分别是比例为1:2、1:4和1:8的1.28、2.90和7.35倍，活菌数分别是比例为1:2、1:4和1:8的0.96、1.81和4.12倍；当冻干保护剂与菌泥比例为1:8时，活菌数可以达到(1.01±0.09)×10¹¹CFU/mL，但冻干存活率仅为12.11％，此时冻干存活率太低。因此，冻干保护剂与菌泥比例选择4:1-1:4，优选2:1-1:2。

实施例6不同冻干保护剂对动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干存活率的影响

具体步骤如下：

(1)收集菌体：取保藏于-80℃的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160甘油保菌管于4℃解冻，用接种环蘸取保菌管中的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160在MRS固体培养基上划线，置于37℃的厌氧工作站培养36-48h得到单菌落；挑取单菌落接入MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-24h；取菌液按照2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-16h得到种子液；将种子液按2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧静止培养12-16h至稳定期，得到菌液；将菌液在4℃8000×g下离心20min弃去上清液，然后将菌泥用PBS缓冲液在相同离心条件下洗涤两次；将菌泥置于4℃下备用。

(2)按照表6的配方配置冻干保护剂A-E，其中冻干保护剂A-D来源于乳酸菌冻干保护剂专利中的优选方案。其中：海藻糖溶液、海藻酸钠溶液、山梨糖醇溶液、鼠李糖溶液、蔗糖溶液和麦芽糊精溶液115℃灭菌20min；透明质酸钠溶液、抗坏血酸溶液、谷氨酸钠溶液、L-半胱氨酸盐酸盐溶液过膜灭菌；脱脂奶粉溶液105℃灭菌10min。

(3)将菌泥分别与冻干保护剂A-E混合，得到混合液A-E；将混合液A-E进行冷冻干燥，得到动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干菌粉A-E，冻干保护剂与菌泥的比例按照表6配置。将冻干前后的样品进行称重。

(4)冷冻干燥工艺：包括预冻、一次干燥和二次干燥。预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h；一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h；二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。冻干完成后，冻干瓶塞盖子密封，保存至-20℃用于后续测定。

(5)检测动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干粉1-7中动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数，并且计算相应的冻干存活率。

表6冻干保护剂A-E的配方及与菌泥的比例

不同组的配方和冻干存活率结果如表6和图6所示，其中***表示冻干保护剂A-D组vs冻干保护剂E组有极显著差异，p<0.001。

由表6和图6可知：采用专利报道的双歧杆菌和乳杆菌冻干保护剂A-D制成的动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160冻干菌粉，其冻干存活率在25％-40％左右，活菌数约为(0.8-1.8)×10¹¹CFU/mL。而采用冻干保护剂E制成的冻干菌粉，动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的活菌数达到4.15×10¹¹CFU/mL，冻干存活率为88.18％。冻干保护剂A-D与冻干保护剂E相比有极显著差异(p<0.001)。冻干保护剂E的冻干存活率分别是冻干保护剂A-D的2.36倍、2.27倍、3.10倍和2.44倍，活菌数分别是冻干保护剂A-D的2.36倍、4.07倍、3.10倍和4.87倍。由此说明，冻干保护剂E相比其他专利报道的冻干保护剂更加适用于动物双歧杆菌乳亚种CCFM1160的冻干保护。

实施例7透明质酸鼠李糖组合物对动物双歧杆菌动物亚种CGMCC 1.1852冻干存活率的影响

具体步骤如下：

(1)收集菌体：取保藏于-80℃的动物双歧杆菌CGMCC 1.1852甘油保菌管于4℃解冻，用接种环蘸取保菌管中的动物双歧杆菌动物亚种CGMCC 1.1852在MRS固体培养基上划线，置于37℃的厌氧工作站培养36-48h得到单菌落；挑取单菌落接入MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-24h；取菌液按照2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧工作站静止培养12-16h得到种子液；将种子液按2％-5％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中，37℃厌氧静止培养12-16h至稳定期，得到菌液；将菌液在4℃8000×g下离心20min弃去上清液，然后将菌泥用PBS缓冲液在相同离心条件下洗涤两次；将菌泥置于4℃下备用。

(2)本实施例以100g/L脱脂奶粉+30g/L蔗糖为动物双歧杆菌动物亚种CGMCC1.1852冻干保护剂的基础配方，考察透明质酸鼠李糖组合物对动物双歧杆菌动物亚种CGMCC 1.1852冻干存活率的影响，具体如表7所示。

(3)将菌泥与冻干保护剂按照质量比1:1进行混合，然后再进行冷冻干燥，得到动物双歧杆菌动物亚种CGMCC 1.1852的冻干菌粉。将冻干前后的样品进行称重。

(4)冷冻干燥工艺：包括预冻、一次干燥和二次干燥。预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h；一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h；二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。冻干完成后，冻干瓶塞盖子密封，保存至-20℃用于后续测定。

(5)检测动物双歧杆菌动物亚种CGMCC 1.1852冻干粉中动物双歧杆菌动物亚种CGMCC 1.1852的活菌数，并且计算相应的冻干存活率。

表7添加透明质酸鼠李糖的冻干粉配方及动物双歧杆菌动物亚种CGMCC 1.1852的活菌数和冻干存活率

不同组的配方和冻干存活率结果如表7所示。其中***表示空白组vs组合物组有极显著差异，p<0.001。

由表7可知：组合物组比空白组的冻干存活率有极显著提高(p<0.001)。采用透明质酸鼠李糖组合物制备的冻干保护剂，动物双歧杆菌动物亚种CGMCC 1.1852的活菌数可以达到(3.50±0.11)×10¹¹CFU/mL，冻干存活率达到76.82％，约是空白组的4.47倍。

结合实施例1-6可知，本专利提供的透明质酸鼠李糖冻干保护剂，不仅适用于动物双歧杆菌乳亚种，对于提升动物双歧杆菌动物亚种冻干存活率也具有显著效果。

Claims (10)

1.透明质酸或其盐和鼠李糖在制备菌体冻干保护剂中的应用。

2.透明质酸或其盐和鼠李糖在提高菌体冻干存活率中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述透明质酸或其盐的分子量为40-200万Da，所述透明质酸或其盐和鼠李糖的质量比为1：(0.42-300)，优选地，所述透明质酸或其盐的分子量为70-150万Da，所述透明质酸或其盐和鼠李糖的质量比为1：(1-100)。

4.一种菌体冻干保护剂，其特征在于，所述菌体冻干保护剂包括透明质酸或其盐和鼠李糖。

5.根据权利要求4所述的菌体冻干保护剂，其特征在于，所述菌体冻干保护剂中，所述透明质酸或其盐的分子量为40-200万Da，所述透明质酸或其盐和鼠李糖的质量比为1：(0.42-300)，优选地，所述透明质酸或其盐的分子量为70-150万Da，所述透明质酸或其盐和鼠李糖的质量比为1：(1-100)。

6.根据权利要求4所述的菌体冻干保护剂，其特征在于，所述菌体冻干保护剂还包括脱脂奶粉、乳清蛋白、胶原蛋白、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、乳糖醇、低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、甘油、山梨糖醇、木糖醇、海藻糖、水苏糖、菊粉、麦芽糊精、抗性糊精中的一种或者两种以上，优选地，脱脂奶粉含量为50-200g/L，蔗糖的含量为10-80g/L。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的应用或者权利要求4-6中任一项所述的菌体冻干保护剂，其特征在于，所述菌体为动物双歧杆菌。

8.一种菌体的冻干方法，其特征在于，使用权利要求4-6中任一项所述的菌体冻干保护剂。

9.根据权利要求8所述的菌体的冻干方法，其特征在于，所述冻干方法包括将菌体的菌泥与所述冻干保护剂混合之后进行冷冻干燥，其中所述冻干保护剂与所述菌泥的质量比为1：(0.25-4)。

10.一种菌体冻干粉，其特征在于，所述菌体冻干粉包括菌体、透明质酸或其盐和鼠李糖，

优选地，所述菌体冻干粉由权利要求8或9所述的冻干方法制备得到。

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