KR102290654B1 - 동결보호용 조성물 및 이를 포함하는 유산균제 - Google Patents

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Abstract

비트(Beta vulgaris) 분말을 포함하는 유산균 동결보호용 조성물, 이를 포함하는 유산균제, 및 이의 제조방법이 제공된다.

Description

동결보호용 조성물 및 이를 포함하는 유산균제{Cryoprotectant compositions and lactic acid bacteria preparations comprising the same}
비트(Beta vulgaris) 분말을 포함하는 유산균 동결보호용 조성물, 이를 포함하는 유산균제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스(probiotics)는 장 내 환경에서 유익한 효과를 주는 살아있는 미생물 또는 미생물이 함유된 식품을 의미하며, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 비피박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 등을 포함하는 유산균(lactic acid bacteria)이 여기에 포함된다. 프로바이오틱스는 장에 정착하여 혈중 콜레스테롤 농도 저하, 면역 증진, 유해효소 합성 억제, 유당 불내증의 개선, 장 내 유해균의 증식 억제, 설사 치유 및 정장 작용, 장내 균총의 정상화 및 노화 방지, 피부 미용 효과, 염증성 장질환 개선에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
한편 유산균이 프로바이오틱스로서 기능하기 위해서는 제조, 유통, 및 체내 섭취 과정에서 사멸하지 않고 안정적으로 활성을 유지하며 보존될 수 있도록 하는 기술이 필요하다. 유산균의 안정성을 지속적으로 유지하기 위한 장기보존의 한 방법으로서 동결건조방법이 널리 이용되어 왔다. 이는 유산균을 동결건조용 현탁액에 현탁시킨 후 감압 하에 급속으로 동결시켜 건조한 뒤 분말화하는 단계를 포함하며, 이 과정에서 유산균은 온도, pH, 산소를 비롯한 각종 물리화학적 스트레스에 노출되어 생존율이 감소하게 된다. 이를 극복하기 위한 수단으로서 적합한 동결보호제를 사용하여 유산균의 동결건조 및 이후 저장 단계에서 유산균의 생존율을 높일 수 있음이 알려져 있다.
비트(Beta vulgaris)는 석죽목(Centrospermae) 비름과(Amaranthaceae) 명주아과(Chenopodiaceae) 근대속(Beta)에 속하며 고대 로마시대부터 약용식물로 이용되어 왔다. 비트는 탄수화물, 당, 식이섬유, 지방 및 단백질을 함유하고 있으며, 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 베타카로틴, 티아민, 리보플라빈, 나이아신, 판토테산, 엽산 등의 비타민과 칼슘, 철분, 마그네슘, 망간, 인, 칼륨, 나트륨, 아연 등의 무기질이 풍부하다. 비트의 붉은 색을 나타내는 베타레인(betalain)은 석죽목(Centrospermae)에만 제한적으로 존재하는 수용성 색소로서 베타시아닌(betacyanin)과 베타잔틴(betaxantin)으로 구성되어 있으며, 이들 성분은 항산화, 항암 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 비트는 철분 함량이 풍부하여 빈혈, 혈압 강하, 혈당 강하, 소화기 질환, 순환계 질환, 항염증에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
프로바이오틱스 제품에 적용가능한 다양한 동결보호제가 보고되어 있지만, 기존 공정에 용이하게 적용가능하며, 동결건조 과정에서 발생하는 외부 스트레스에 대한 유산균의 생존력을 개선하고 장기 안정성을 보장할 수 있는 동결보호제의 개발이 여전히 필요하다.
일 목적은 비트(Beta vulgaris) 분말을 포함하는 유산균 동결보호용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 목적은 상기 유산균 동결보호용 조성물을 함유하는 유산균제를 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 상기 유산균제의 제조 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 비트(Beta vulgaris) 분말을 포함하는 유산균 동결보호용 조성물을 제공한다.
구체예에서, 상기 조성물은 동결보호제, 다공성 지지체 및 질소원으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
구체예에서, 상기 조성물은 수크로오스(sucrose), 트레할로스(trehalose), 말토오스(maltose), 프럭토오스(fructose), 라피노오스(raffinose), 락토스(lactose), 글루코스(glucose), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 글리세롤(glycerol), 자일리톨(xylitol), 이노시톨(inositol), 염화나트륨(sodium chloride), 인산나트륨(sodium phosphate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 아세트산나트륨(sodium acetate), 젖산나트륨(sodium lactate), 숙신산나트륨(sodium succinate), 프로피온산나트륨(sodium propionate), 제1인산칼륨(monopotassium phosphate, KH2PO4), 제2인산칼륨(dipotassium phosphate, K2HPO4), 말토덱스트린(maltodextrin), 알기네이트(alginate), 키토산(chitosan), 전분(starch), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 트리아세틴(triacetin), 아세틸트리에틸 시트레이트(acetyltriethyl citrate), 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate), 카복시메틸셀룰로스(carboxymethyl cellulose), 잔탄검(Xanthan gum), 탈지 분유, 유청 단백질, 효모 추출물, 맥아 추출물, 비프 추출물, 카세인 가수분해물, 트립톤, 시스테인, 펩톤 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
구체예에서, 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토코커스(Lactococcus), 와이셀라(Weissella) 또는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속에 속하는 유산균일 수 있다.
구체예에서, 상기 조성물의 비트 함량은 비트 분말을 제외한 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 10 중량부일 수 있다.
다른 양상은 상기 유산균 동결보호용 조성물, 및 유산균을 포함하는 유산균제를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 유산균 동결보호용 조성물의 존재 하에 유산균을 동결건조하는 단계를 포함하는, 유산균제의 제조 방법을 제공한다.
본 개시에 따르면, 유산균의 제조공정, 특히 동결건조 공정 및 저장 시 발생할 수 있는 온도, 압력, pH, 산소 등 다양한 물리화학적 스트레스에 대한 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한 체내 섭취 시 위산 및 담즙산 등의 소화 효소에 대한 안정성이 향상되어 유산균의 체내 생존율 및 활성이 증대될 수 있다. 또한, 동결건조와 코팅으로 구분되는 2단계 공정과 같은 복잡한 공정 없이, 동결보호용 조성물이 동결건조 과정에서 유산균 표면에 코팅되므로 제조공정의 간소화 및 경제적 이점이 있다.
도 1은 비트 분말을 포함하는 유산균 동결보호용 조성물로 코팅된 동결건조 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plnatarum) LMT19-1 유산균 균주의 표면을 나타내는 전자현미경(SEM) 사진이다(배율: x50000).
본 개시는 통상적으로 사용되는 동결보호용 조성물에 비트(Beta vulgaris) 분말을 첨가하는 경우 유산균의 생존율, 열안정성, 저장 안정성, 내산성 및 내담즙성이 개선됨을 발견한 사실에 기초한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "비트(Beta vulgaris)"는 사탕무(sugar beet); 뿌리 채소용 비트 예컨대 비트 뿌리(beet root), 가든 비트(garden beet) 또는 레드비트(red beet); 잎 채소용 비트 예컨대 근대(chard) 또는 시금치 비트(spinach beet); 사료용 비트 예컨대 만젤우르젤(mangelwurzel); 및 이들의 개량종, 변종 등을 포괄하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 "비트(Beta vulgaris)"는 "레드 비트(red beet)"라는 용어와 호환가능하다.
본원에서 사용된 용어 "유산균"은 그람-양성(Gram-positive) 세균으로서 물질대사에 의해 탄수화물을 젖산(lactic acid)으로 분해하는 세균을 총칭하는 용어이다. 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 예컨대 L. 애시도필러스(L. acidophilus), L. 브레비스(L. brevis), L.카제이(L. casei), L. 파라카제이(L. paracasei), L. 퍼멘텀(L. fermentum), L. 가세리(L. gasseri), L. 존소니(L. johnsonii), L. 루테리(L. reuteri), L. 람노서스(L. rhamnosus), L. 살리바리우스(L. salivarius) 등; 류코노스톡(Leuconostoc) 속 예컨대 L. 김치아이(L. kimchii), L. 시트레움(L. citreum), L. 메센테로이드스(L. mesenteroides) 등; 페디오코커스(Pediococcus) 속, 예컨대 P. 펜토사세우스(P. pentosaceus), P. 애시디락티(P. acidilactici) 등; 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 예컨대 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 등; 엔테로코커스(Enterococcus) 속 예컨대 E. 패시움(E. faecium), E. 패컬리스(E. faecalis) 등; 락토코커스(Lactococcus) 속, 예컨대 L.락티스(L. lactis) 등; 와이셀라(Weissella) 속, 예컨대 W. 시바리아(W. cibaria) 등; 또는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속, 예컨대 B. 비피덤(B. bifidum), B. 브레베(B. breve), B. 롱검(B.longum), B. 애니말리스(B. animalis), B. 락티스(B. lactis) 중 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 및/또는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속에 속하는 1종 이상의 유산균일 수 있다.
일 양상은 비트 분말을 포함하는 유산균 동결보호용 조성물에 관한 것이다. 동결보호용 조성물은 동결건조 과정에서 발생하는 물리화학적 스트레스로부터 유산균을 보호하여 유산균의 활성을 유지할 수 있도록 하는 조성물을 지칭한다.
구체예에서, 비트 분말의 함량은 비트 분말을 제외한 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 10 중량부, 예컨대 0.1 내지 5 중량부, 0.1 내지 1 중량부, 0.5 내지 10 중량부, 0.5 내지 5 중량부, 또는 0.5 내지 1 중량부일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체예에서, 비트 분말의 농도는 비트 분말을 제외한 조성물에 대하여 1 내지 20 g/L의 농도, 예컨대 1 내지 10 g/L, 1 내지 5 g/L, 5 내지 20 g/L, 10 내지 20 g/L의 농도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
비트 분말은 시판되는 것을 구입하여 이용할 수 있다. 상기 시판 분말은 당업자에 의해 용이하게 입수될 수 있는 임의의 것일 수 있다.
구체예에서, 유산균 동결보호용 조성물은 비트 분말 이외에 당업계에서 통상적으로 사용되는 동결보호제, 다공성 지지체 및 질소원으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 당업계에서 통상적으로 사용되는 동결보호제는 비트 분말을 제외한 것으로서, 당, 당 알코올, 이온 화합물, 아미노산, 펩티드, 젤라틴, 글리세롤, 유청, 알긴산, 아스코르빈산, 효모 추출물, 탈지유 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
당은 고분자의 변성(denaturation)을 보호하는 것으로 알려져 있다. 당은 수크로오스(sucrose), 트레할로스(trehalose), 말토오스(maltose), 프럭토오스(fructose), 라피노오스(raffinose), 락토스(lactose), 글루코스(glucose) 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
당 알코올(sugar alcohol)은 액상이나 동결건조 조건에서 고분자를 안정화시키고, 변성을 방지하는데 유용한 것으로 알려져 있다. 당 알코올은 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 글리세롤(glycerol), 자일리톨(xylitol), 이노시톨(inositol) 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
이온 화합물은 염(salt) 또는 완충액(buffer) 등을 의미한다. 이온 화합물은 특이적 또는 비특이적 결합을 통하여 고분자와 작용한다. 염은 열안정성을 증가시킬 수 있고, 용해도를 증가시키고 응집의 정도를 감소시킨다. 이온 화합물은 염화나트륨(sodium chloride), 인산나트륨(sodium phosphate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 아세트산나트륨(sodium acetate), 젖산나트륨(sodium lactate), 숙신산나트륨(sodium succinate), 프로피온산나트륨(sodium propionate), 제1인산칼륨(monopotassium phosphate), 제2인산칼륨(dipotassium phosphate) 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 지지체는 외부 수분 및 공기의 유입을 차단하고, 동결 건조된 유산균에 다공성을 부여하여 재수화 작용을 용이하게 하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 다공성 지지체는 말토덱스트린(maltodextrin), 알기네이트(alginate), 키토산(chitosan), 전분(starch), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 트리아세틴(triacetin), 아세틸트리에틸 시트레이트(acetyltriethyl citrate), 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate), 글리세린(glycerin), 카복시메틸셀룰로스(carboxymethyl cellulose), 잔탄검(Xanthan gum) 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
질소원은 유산균의 질소 에너지원으로 사용되는 물질을 의미하며, 이는 후발효에 의한 균체의 손상을 방지하는 역할을 한다. 질소원은 탈지 분유, 유청 단백질, 효모 추출물, 맥아 추출물, 비프 추출물, 카세인 가수분해물, 트립톤, 시스테인, 펩톤, 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
통상적인 동결보호제, 다공성 지지체, 또는 질소원은 당업자에 의해 용이하게 입수될 수 있는 임의의 것일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하여 이용할 수 있다.
다른 양상은 상기 유산균 동결보호용 조성물, 및 유산균을 포함하는 유산균제에 관한 것이다.
구체예에서, 상기 유산균제는 분말, 분산제, 과립제, 침제, 유제, 유동제, 정제, 환제, 캅셀제, 과립제, 연고, 좌제, 주사액, 흡입제, 에어로졸, 현탁제, 시럽제, 에멀젼, 연질 캡슐, 경질 캡슐, 엘릭시르제(elixirs), 트로치제(troches), 로젠지(lozenge) 등의 형태일 수 있다. 예를 들어, 유산균제는 분말일 수 있다.
구체예에서, 상기 유산균제는 식품 또는 식품 첨가제일 수 있다. 상기 식품은 또한 건강기능성 식품일 수 있다. 예컨대, 상기 식품 및/또는 건강기능성 식품은 유제품, 음료류, 과자류, 다이어트바, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류일 수 있다.
구체예에서, 상기 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 유산균 동결보호용 조성물의 존재 하에 유산균을 동결건조하는 단계를 포함하는, 유산균제의 제조 방법에 관한 것이다.
구체예에서, 상기 제조 방법은 비트 분말을 포함하는 유산균 동결보호용 조성물을 유산균과 혼합하여 혼합물을 준비하고, 상기 혼합물을 동결건조하여 분말화 하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 비트 분말은 통상의 동결보호제, 다공성 지지체, 및/또는 질소원을 포함하는 혼합물로서 일시에 유산균과 혼합되거나, 유산균과 통상의 동결보호제, 다공성 지지체, 및/또는 질소원이 먼저 혼합된 뒤 별도로 첨가될 수 있다.
구체예에서, 유산균과 동결보호용 조성물의 혼합 시기는 통상적인 유산균제의 제조 방법 중 임의의 단계, 예를 들어 유산균의 배양 전 단계, 배양 중 임의의 단계, 동결건조하여 분말화하는 단계일 수 있으며 특정 단계로 제한되는 것은 아니다.
구체예에서, 비트 분말의 함량은 비트 분말을 제외한 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 10 중량부, 예컨대 0.1 내지 5 중량부, 0.1 내지 1 중량부, 0.5 내지 10 중량부, 0.5 내지 5 중량부, 또는 0.5 내지 1 중량부일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체예에서, 비트 분말의 농도는 비트 분말을 제외한 조성물에 대하여 1 내지 20 g/L의 농도, 예컨대 1 내지 10 g/L, 1 내지 5 g/L, 5 내지 20 g/L, 10 내지 20 g/L의 농도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체예에서, 동결 건조는 -70℃ 내지 -30℃, 예를 들어 -70℃ 내지 -40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 동결 건조는 3시간 내지 48시간, 예를 들어 6시간 내지 36시간, 예를 들어 12시간 내지 24시간 동안 냉각되는 조건에서 동결시킨 후, 동결 건조기에서 해동하여 수분을 제거하는 과정으로 수행될 수 있다.
본 개시에 따르면, 동결건조 과정에서 유산균이 사멸하지 않고 활성이 유지되어 장기 보관 안정성이 개선될 수 있다.
상기 안정성은, 비트 분말을 포함하지 않은 동결보호제와 비교하여, 40℃에서 2주간 보관한 후 보관 초기 대비 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 생존율을 나타내는 것일 수 있다.
상기 안정성은, 비트 분말을 포함하지 않은 동결보호제와 비교하여, 40℃에서 4주간 보관한 후 보관 초기 대비 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 생존율을 나타내는 것일 수 있다.
상기 보관 초기는 보관 0일차 또는 보관 직전일 수 있다.
본 개시에 따르면, 유산균의 내산성 및/또는 내담즙성을 개선할 수 있다.
상기 내산성은 MRS 배지에서 pH 2.5 및 37℃에서 2시간 동안 배양한 경우 생존율이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 80 내지 90%, 80% 내지 95%, 85% 내지 90%, 또는 90 내지 95%일 수 있다.
상기 내담즙성은 0.3% 담즙산염 함유 MRS 배지에서 37℃에서 2시간 배양한 경우 생존율이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 75 내지 90%, 75내지 95%, 80 내지 90%, 80% 내지 95%, 85% 내지 90%, 또는 90 내지 95%일 수 있다.
이하, 본 개시내용을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 개시내용의 설명을 위한 목적일 뿐이며 이에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예: 비트 분말을 포함하는 동결보호용 조성물을 이용한 유산균 동결건조 분말 제조
하기 표 1의 조성의 동결보호제와 상기 동결보호제 100 중량부에 대하여 각각 0.1 중량부, 0.5 중량부 및 1.0 중량부의 비트 분말이 포함된 3종의 동결보호용 조성물을 이용하여, 락토바실러스 플란타럼(L.plantarum) LMT19-1 균주의 3종의 동결건조 분말을 제조하였다.
동결보호제 함량비
트레할로스 50%
잔탄검 0.20%
K2HPO4 1.15%
KH2PO4 1.1
카복시메틸셀룰로스 0.20%
물 47.35%
총 함량 100%
구체적으로, 락토바실러스 플란타럼(L.plantarum) LMT19-1 균주를 420 ml의 멸균된 MRS 액체 배지(BD, Difco, MI, USA)에서 34℃에서 14시간 동안 종균배양하였다. 상기 배양물을 0.01 g/ml 취하여 MRS 액체 배지(BD, Difco, MI, USA)가 담긴 420 L의 대량 발효조로 옮긴 후 34℃에서 17시간 동안 대량 배양하였다. 이어서 상기 배양물을 분리기(Separator)에서 분리한 후 상등액은 버리고 유산균체만 회수하였다. 회수된 유산균체를 상기 3종의 동결보호용 조성물과 1:1의 중량 비율로 교반하며 각각 혼합한 후, -50℃에서 급속 동결건조시켰다. 이어서 동결건조된 균체를 혼합기(Mixer)를 사용하여 분쇄 및 분말화하여, 3종의 동결건조된 유산균 분말을 수득하였다. 상기와 같이 제조된 유산균 분말을 각각 실시예 1(0.1 중량부 비트 분말 포함-동결보호용 조성물로 제조), 실시예 2(0.5 중량부 비트 분말-포함 동결보호용 조성물로 제조), 및 실시예 3(1.0 중량부 비트 분말 포함-동결보호용 조성물로 제조)으로 지정하였다.
도 1은 상기와 같이 동결건조된 락토바실러스 플란타럼(L.plantarum) LMT19-1 균주의 표면을 나타내는 전자현미경(SEM) 사진이다(배율: x5000). 도 1에 나타난 바와 같이, 비트 분말을 함유하는 동결보호용 조성물이 유산균 표면에 박막을 형성하며 코팅된 것을 확인할 수 있다.
비교예: 비트 분말을 포함하지 않는 동결보호용 조성물을 이용한 유산균 동결건조 분말 제조
비트 분말을 첨가하지 않은 것을 제외하고, 상기 실시예와 동일한 절차에 따라 락토바실러스 플란타럼(L.plantarum) LMT19-1 균주의 동결건조 분말을 제조하였다.
실험예 1: 동결건조된 유산균 분말의 보관 안정성 평가
유산균에 가혹 조건을 가했을 때 비트 분말을 포함한 동결보호용 조성물이 유산균을 효율적으로 보호할 수 있는지를 평가하기 위하여 가속 안정성 평가를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 및 비교예에 따라 제조된 4종의 동결건조된 유산균 분말을 온도 40℃, 습도 70%의 조건에서 보관하면서 2주 및 4주차에 시료를 채취하였다. 멸균 생리식염수에 상기 시료를 연속 희석하여 MRS 배지에 도말한 후, 48 내지 72시간 배양한 다음 생균 수를 측정하여 가혹 조건에서의 생존율을 확인하였다. 비트 분말의 함량에 따른 유산균 분말의 2주차 및 4주차 생존율을 아래 표 2에 나타냈으며, 유산균의 상대적 생존율은 아래 식에 따라 계산하였다:
유산균 상대적 생존율(%): 비트 분말 함유-동결보호용 조성물로 처리한 유산균의 가속 안정성 생존율 / 비트 분말 미함유-동결보호용 조성물로 처리한 유산균의 0주차 가속 안정성 생존율
상기 식에서, 가속 안정성 생존율은 또한 아래 계산식에 의해 수득된다:
가속안정성 생존율(%)= 가속안정성평가 n주차 시료의 CFU 값/가속안정성 평가 전(0주차)의 CFU 값 x 100
비트 분말 함량에 따른 유산균 분말의 가속 안정성 평가
동결보호용 조성물 2주차 4주차
CFU/g 생존율(%) CFU/g 생존율(%)
비교예 (비트 분말 미포함) 2.47E+10 100.00 7.74E+09 100.00
실시예 1
(0.1 중량부 비트 분말 포함)		 3.21E+10 130.39 5.60.E+09 71.88
실시예 2
(0.5 중량부 비트 분말 포함)		 3.92.E+10 179.41 1.01.E+10 146.88
실시예 3
(1.0 중량부 비트 분말 포함)		 2.41.E+10 108.82 6.27.E+09 90.63
표 2에 나타난 바와 같이, 비트 분말을 포함하지 않은 비교예의 생존율과 비교하여, 비트 분말을 포함하는 경우 유산균의 2주차 생존율이 더 높음을 확인하였으며, 특히 실시예 2(0.5 중량부의 비트 분말 포함)의 경우 4주차에서도 높은 생존율을 유지함을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과로부터, 동결보호제에 비트 분말이 포함되는 경우 동결건조 시 유산균을 효과적으로 보호하여 동결건조 후 초기 안정성이 향상될 뿐만 아니라, 시간 경과에 따른 보관 안정성이 향상됨을 알 수 있다.
실험예 2: 동결건조된 유산균 분말의 내산성 및 내담즙성 평가
2.1. 내산성 평가
본 개시내용의 동결보호용 조성물로 제조된 유산균 분말이 장내에서 프로바이오틱스로서의 효능을 발휘하기 위해서는 섭취 후 낮은 pH의 위를 통과해야 한다.
상기 실시예 2 및 비교예의 동결건조된 유산균 분말의 균주를 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음으로, HCl로 pH 2.5로 조정하여 멸균한 MRS 액체 배지에서 상기 균주를 1% 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 대조군으로서, pH가 조정되지 않은 MRS 액체 배지(pH 6.8)를 사용하여 동일하게 배양하였다. 균주 접종 직후와 2시간 배양 후의 시료를 회수하여 MRS 액체 배지에서 희석하고 MRS 평판 배지에서 도말한 다음 37℃에서 24시간 배양한 후 평판 배지 위의 집락 수를 계수하여 균 수를 측정하여 표 3에 나타내었다.
동결보호용 조성물 pH 2.5에서의 생존율
비교예(비트 분말 미포함) 50.6%
실시예 2(0.5 중량부 비트 분말 포함) 67.2%
표 3에 나타난 바와 같이, 비트 분말을 포함하지 않은 경우 생존율이 대조군 대비 50.6% 증가하지만 0.5 중량부의 비트 분말을 추가로 더 포함하는 경우 생존율이 67.2%로 더 향상됨을 확인할 수 있다. 이러한 결과로부터, 본 개시내용의 비트 분말을 포함하는 동결보호용 조성물은 유산균을 안정화시켜 섭취 후 위산에 노출되는 경우 향상된 생존율 및 활성을 나타낼 수 있음을 시사한다.
2.2. 내담즙성 평가
담즙산이 본 개시내용의 비트 분말을 포함하는 동결보호용 조성물로 제조된 유산균 분말의 균주의 안정성에 미치는 영향을 평가하였다. 상기 실시예 2 및 비교예에서 동결건조된 유산균 분말의 균주를 멸균된 MRS 액체 배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였고, 장관 내 담즙산염 농도가 0.1% 내외임을 감안하여, 0.3%의 담즙산염(bile salts)(Sigma, USA)이 함유된 MRS 액체 배지에 상기 균주를 1% 양으로 접종하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 대조군으로서 0.3% 담즙산염이 함유되지 않은 MRS 액체 배지를 사용하여 동일하게 배양하였다. 균주 접종 직후와 2 시간 배양 후의 시료를 회수하여 MRS 액체 배지에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락 수를 계수하여 균주 세포 수를 측정하여 표 4에 나타내었다.
동결보호용 조성물 0.3% 담즙산염에서의 생존율
비교예(비트 분말 미포함) 25.4%
실시예 2(0.5 중량부 비트 분말 포함) 44.3%
표 4에 나타난 바와 같이, 비트 분말을 포함하지 않은 경우 생존율이 대조군 대비 내담즙성이 25.4% 증가하였지만 0.5 중량부의 비트 분말을 추가로 더 포함하는 경우 생존율이 44.3%로 현저하게 향상됨을 확인할 수 있다. 이러한 결과로부터, 본 개시내용의 비트 분말을 포함하는 동결보호용 조성물은 유산균을 안정화시켜 섭취 후 담즙에 노출되는 경우 향상된 생존율 및 활성을 나타낼 수 있음을 시사한다.
종합하면, 본 개시내용의 비트 분말을 포함하는 동결보호용 조성물은 섭취 후 위산 및 담즙산 노출 환경에서 유산균의 안정화 효능이 우수하여 섭취 후 장 내에서 활성이 안정하게 유지될 수 있음을 확인할 수 있다.
실험예 3: 유산균 종류에 따른 동결건조된 유산균 분말의 보관 안정성 평가
본 개시내용에 따른 비트 분말을 포함하는 동결보호제가 다양한 유산균에 대해 안정화 효과가 있는지를 확인하였다. 구체적으로, 락토바실러스 플란타럼(L.plantarum) LMT19-1 균주 외에, 락토바실러스 브레비스(L.brevis) LMT1-73, 엔테로코커스 패시움(E. faecium)LMT2-3, 및 비피도박테리움 롱검(B. longum) LMT4-6을 사용하고 0.5 중량부의 비트 분말만을 사용한 것을 제외하고 상기 실시예에 따라 유산균을 배양하고 동결건조한 후 상기 실험예의 절차에 따라 보관 안정성을 평가하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.
균주 동결보호용 조성물 2주차 생존율 4주차 생존율
L. brevis LMT1-73 비트 분말 미포함 100% 100%
0.5 중량부 비트 분말 포함 121.1% 133.3%
E. faecium LMT2-3 비트 분말 미포함 100% 100%
0.5 중량부 비트 분말 포함 174.7% 166.9%
B. longum LMT4-6 비트 분말 미포함 100% 100%
0.5 중량부 비트 분말 포함 99.5% 402.8%
표 5에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 브레비스(L.brevis) LMT1-73, 엔테로코커스 패시움(E. faecium)LMT 2-3 및 비피도박테리움 롱검(B. longum) LMT4-6에서도 비트 분말을 포함하지 않은 경우와 비교하여, 0.5 중량부의 비트 분말을 추가로 포함하는 경우 2주차 생존율 개선되었고 시간 경과에 따른 4주차 생존율이 현저하게 개선되었음을 확인하였다. 따라서, 본 개시내용의 비트 분말을 함유하는 동결보호용 조성물은 유산균 균주의 종류와 관계 없이 유산균에 대한 안정화 효과가 우수하여 장기 보관을 가능케 함을 시사한다.
종합하면, 비트 분말이 유산균의 동결보호제에 첨가되는 경우 유산균에 대한 안정화 효과가 우수하여 초기 안정성 및 장기 보관 안정성을 모두 개선하므로 유산균의 동결보호용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 비트(Beta vulgaris) 분말을 포함하는 유산균 동결보호용 조성물로서, 트레할로스(trehalose), 잔탄검(Xanthan gum), 제1인산칼륨(monopotassium phosphate, KH2PO4), 제2인산칼륨(dipotassium phosphate, K2HPO4), 및 카복시메틸셀룰로스(carboxymethyl cellulose)를 추가로 포함하며 상기 비트 분말의 함량은 비트 분말을 제외한 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 1 중량부인 유산균 동결보호용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토코커스(Lactococcus), 와이셀라(Weissella) 또는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속에 속하는 1종 이상의 유산균인 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 유산균 동결보호용 조성물의 존재 하에 유산균을 동결건조하는 단계를 포함하는, 유산균제의 제조 방법.
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